משטח מסנן מבוססי משופר ראמאן Assay ספקטרוסקופיות עבור איתור מהיר של מזהמים כימיים

Summary

הליך עבור ייצור וביצוע פני השטח מבוסס-מסנן משופרת ראמאן ספקטרוסקופיות (SERS) assay לצורך זיהוי של מזהמים כימיים (כלומר, הדברה ferbam ו אמפיצילין אנטיביוטי) מוצג.

Introduction

ספקטרוסקופיה Surface ראמאן משופרת (SERS) היא טכניקה המשלבת ספקטרוסקופיית ראמאן עם ננוטכנולוגיה. עוצמת פיזור ראמאן של analytes ב-משטחים ננו מתכתיים אציליים היא משפרת על ידי תהודת המשטח plasmon המקומית. ¹ חלקיקי כסף (Ag NPS) הם ללא ספק מצעי SERS הנפוץ ביותר בשל יכולת השיפור הגבוה שלה. ² עד כה , שיטות סינטטיות שונות של צירופי Ag פותחו. ^3-6 Ag צירופים ניתן להשתמש לבד כמו מצעי SERS יעילים, או בשילוב עם חומרים ומבנים אחרים כדי לשפר את הרגישות ו / או את הפונקציונליות שלו. ^7-11

טכניקות SERS הוכיחו יכולת רבה זיהוי של מזהמי עקבות סכום שונים במזון דגימות סביבתי ¹² באופן מסורתי, ישנן שתי דרכים נפוצות להכנת מדגם SERS:.. פתרון המבוסס על שיטות המבוסס על מצע ¹³ פתרון המבוסס methoד משתמשת קולואידים NP לערבב עם דגימות. ואז המתחם-אנליטי NP נאסף באמצעות צנטריפוגה, ואת שהופקדו על תמיכה מוצקה למדידת ראמאן לאחר הייבוש. בשיטה המבוססת על המצע מיושם בדרך כלל על ידי הפקדת כמה מיקרוליטר של מדגם נוזלי על מצע מוצק מראש מפוברק. ¹⁴ עם זאת, אף אחת משתי שיטות אלה יעילים ישים עבור כמות גדולה של נפח דגימה. מספר שינויים של מבחני SERS התגבר על מגבלות נפח, כגון שילוב של מערכת סינון ^15-21 או שילוב של מכשיר microfluidic. ^21-24 מבחני SERS שונה הראו שיפור גדול ברגישות היתכנות לניטור מזהמים כימיים בדגימות מים גדולות.

כאן אנו מדגימים את פרוטוקול מפורט של ייצור ויישום של שיטת SERS מבוסס מזרק מסנן לזיהוי עקבות לכמות חומר ההדברה ferbam ו אמפיצילין אנטיביוטי.

Protocol

1. Nanoparticle כסף סינתזה ¹⁵

1. ממיסים כסף חנקתי 18 מ"ג במים ultrapure 100 מ"ל (18.2 ΩU) ו מערבולת למשך 5 שניות.
2. ממסים מימיים נתרן ציטרט 27 מ"ג במי 1 מיליליטר ו מערבולת למשך 5 שניות.
3. להעביר את כל הפתרון חנק כסף המוכן בבקבוק חרוטים המכיל בר ערבוב ולשים את הבקבוק על פלטה חשמלית מגנטי. מחממת את הבקבוק תחת בחישה נמרצת עם מהירויות ערבוב של 700 סל"ד ב ~ 350 ° C (קביעת הטמפרטורה על הצלחת).
4. כאשר רותחים, מוסיפים את כל הפתרון נתרן ציטרט מוכן הבקבוק חרוטי מיד, ולהשאיר הפתרון להרתיח במשך 25 דקות נוספות עד הפתרון הופך חום ירקרק, מה שמלמד על היווצרות של Ag צירופים.
5. הסר את הבקבוק מהצלחת חם והניח אותו על צלחת מגנטית אחרת (לא לחמם) ומערבבים O / N באותה מהירות בחישה ב RT עד לקבלת תערובת מגיע למצב יציב, עם צבע טראן מתמידsparency. השתמש ספקטרומטר UV-VIS כדי לקבוע את הספיגה של צירופי Ag המוכנים במידת הצורך.
6. לדלל את התערובת הסופית עם מים ultrapure ל -100 מ"ל.
7. השתמש Zetasizer למדוד את גודל צירופי Ag במידת צורך על פי פרוטוקול של היצרן.
8. מעבירים את קולואיד Ag כדי במיכל אטום ולהגן עליו מפני האור עם רדיד אלומיניום. קולואיד ניתן לאחסן במקרר ב 4-7 מעלות צלזיוס למשך 2 חודשים אם יש צורך.

ייצור 2. של ממברנה מסנן פעיל SERS

1. ממיסים 2.92 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב 100 מ"ל מים כדי ליצור פתרון mM NaCl 50.
2. הוסף 1 מ"ל של הפתרון 5 mM NaCl לתוך 1 מ"ל של צירופים Ag מוכן לערבב אותם על מערבל nutating במשך 10 דקות ב 20 סל"ד. שלב זה הוא כדי לצבור את Ag צירופים לתוך nanoclusters Ag.
3. מניח קרום מסנן (PVDF, 0.1 גודל נקבובי מיקרומטר) לתוך מחזיק מסנן, אשר יכול להיות מצורפות מזרק. קרום הגודל הנקבובי הקטן היה עבורund יעיל יותר מאשר הממברנה הגודל הנקבובי גדול יותר (כלומר, 0.22 מיקרומטר) ב שמנת nanoclusters Ag והפקה אותות עקביים.
4. טען 2 מיליליטר של nanoclusters Ag המוכן לתוך מזרק לסינון. צרף בעל מסנן כדי המזרק באופן ידני להעביר את כל נפח nanoclusters Ag דרך הממברנה בשיעור זרימת 1 טיפה / sec. מלכודות קרום nanoclusters Ag, ויצר קרום מסנן SERS הפעיל.
5. לנתק את קרום מסנן מבעל המסנן. זהירות מיוחדת נדרשת כאשר מחזיקים את קרום על השפה החיצונית באמצעות פינצטה כדי להבטיח שאין נזק הממברנה. אוויר יבש קרום 3 דקות ומניחים על בשקופית זכוכית.
6. איתור ראמאן של מצע SERS
   1. כווננו את המכשיר ראמאן כדי לייזר באורך גל 780 ננומטר עם כוח לייזר של 5 mW, זמן החשיפה של 1 מספר שניות וחשיפה של 2. הגדרת המטרה מיקרוסקופיים 10X. ודא אובייקטיבית על התוכנה המוגדרת גם בהתאם. </ Li>
   2. מניח את שקף הזכוכית עם קרום על גבי על גבי פלטפורמה של מכשיר רמן להשתמש במיקרוסקופ כדי להתמקד על פני הממברנה.
   3. אקראי לבחור 8-10 כתמים ממשטח הממברנה המכשיר יאסוף אותם באופן אוטומטי ברצף. נתונים ספקטרליים Open in התוכנה של היצרן לניתוח.

3. יישום של מערכת סינון SERS פעיל לזהות מזהמים כימיים

1. כן פתרון ferbam 10 ppb.
   זהירות: Ferbam הוא תנודתי מאוד. השתמש באמצעי זהירות (הנשמה ומשקפים) כאשר השקילה המוצקה.
   1. לשקול אבקת 2 מ"ג ferbam לפזר אותו 20 מ"ל 50% אצטוניטריל (אצטוניטריל 10 מ"ל ו -10 מ"ל מים) כדי להפוך פתרון מניות (100 עמודים לדקה). וורטקס הבקבוק למשך 30 שניות.
   2. קח 1 מ"ל של הפתרון ferbam 100 ppm במבחנה ולהוסיף 9 מ"ל 50% אצטוניטריל לעשות פתרון 10 עמודים לדקה. וורטקס הצינור במשך 5 שניות.
   3. קח 1 מ"ל שלפתרון 10 עמודים לדקה במבחנה ולהוסיף 9 מ"ל 50% אצטוניטריל לבצע פתרון 1 ppm. וורטקס הצינור במשך 5 שניות.
   4. קח 1 מ"ל של הפתרון 1 ppm במבחנה ולהוסיף 9 מ"ל 50% אצטוניטריל לבצע פתרון 100 ppb. וורטקס הצינור במשך 5 שניות.
   5. קח 1 מ"ל של הפתרון 100 ppb במבחנה ולהוסיף 9 מ"ל 50% אצטוניטריל לעשות פתרון 10 ppb. וורטקס הצינור במשך 5 שניות.
2. כן פתרון אמפיצילין 1 ppm.
   1. לשקול 10 מ"ג אבקת אמפיצילין לפזר אותו 100 מ"ל מים כדי להפוך פתרון אמפיצילין 100 ppm. וורטקס הבקבוק למשך 30 שניות.
   2. קח 1 מ"ל של הפתרון 100 ppm במבחנה ולהוסיף 9 מ"ל מים כדי ליצור פתרון אמפיצילין 10 עמודים לדקה. וורטקס הצינור במשך 5 שניות.
   3. קח 1 מ"ל של הפתרון 10 עמודים לדקה במבחנה ולהוסיף 9 מ"ל מים כדי ליצור פתרון אמפיצילין 1 ppm. וורטקס הצינור במשך 5 שניות.
3. שים את הממברנה מסנן בחזרה אל בעל מסנן, עם הצד מצופה NP פונה כלפי מעלה. </ Li>
4. טען 5 מ"ל של דגימה אחת לתוך מזרק חדש, ולאחר מכן חבר אותו בעל מסנן עם קרום מצופה Ag בפנים.
5. באופן ידני להעביר את כל הנפח של מדגם דרך הממברנה את קצב זרימה של 1 טיפה / sec. מולקולות מטרה ניתן adsorbed ומרוכזות על הצירופים צופה על הקרום המסנן.
6. ניתוק קרום מסנן מבעל מסנן, אוויר יבש במשך כ -3 דקות ולמדוד את האותות באמצעות מכשיר ראמאן תוך שימוש באותה שיטה כמתואר בשלב 2.6.
7. חזור על שלב 2.2 עד 2.6 להכין עוד קרום Ag-מצופה, אחרי משלב 3.3 עבור זיהוי של מדגם אחר.

Representative Results

השלבים העיקריים של הניסוי הזה הוצגו תרשים סכמטי (איור 1). איור 2 מראים את החשיבות להשתמש נפח אופטימיזציה של AgNPs בציפוי הממברנה כדי להגיע לרגישות המוגדלת. 1 מ"ל של Ag צירופים מספק את האות החזק ביותר בעת שימוש ferbam, לעומת 0.5 מ"ל (ציפוי מספיק) או 2 מ"ל (ציפוי מדי).

הצלחנו לזהות ferbam ב -10 ppb רמת אמפיצילין ב 1 עמודים לדקה עם עוצמת אות רבה על ידי assay SERS המסנן מבוסס המפותחות (איור 1). ספקטרום SERS של ferbam מפגין פסגות מאפיין מובהקות ב -10 ppb. השיא ב 1,386 ^-1 סנטימטר הוא מן הרטט המעורב של S = CN ו- C המתיח, וסימטרית CH ₃ עיוות. השיא ב 1,516 ^-1 סנטימטר קשור CH _{3 ו} CN מתיחה. השיא ב -561 ס"מ > -1 מופק על ידי streching SS. ^25-27 הספקטרום של אמפיצילין 1 ppm גם זוהה בבירור. השיא ב 1,594 ^-1 ס"מ ו 1,447 ^-1 ס"מ הם מ C = C מתיחות CH ₃ / CH ₂ דפורמציה, בהתאמה. השיא החזק 1,001 ^-1 סנטימטר הוא מן רטט טבעת הבנזן. השיא ב 852 סנטימטר ^-1 קשור הסימטרי CNC מתיח. ^28-29 שעת ניסיוני לניתוח מדגם אחד היא פחות מ -20 דקות כולל הייצור של קרום מסנן SERS הפעיל עם צירופי Ag מראש מסונתזים.

עם הגדלת נפח דגימה, אנחנו יכולים להגביר עוד יותר את גבול גילוי, כפי שמוצג באיור 4. אנחנו נצפינו עלייה של עוצמת שיא כאשר הגדלת נפח הדגימה. זהו היתרון של שיטה המבוססת מסנן כמו נפח היא מתכווננת וגבול הזיהוי גם מתכווננת.

ether.within-page = "1">
איור 1. תרשים סכמטי של assay SERS המסנן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. SERS ספקטרום של 5 מ"ל 100 ppb ferbam עובר דרך ממברנות מצופה על ידי כמות שונה של Ag צירופים מלמעלה למטה:. 0.5 מ"ל קולואיד Ag עם NaCl 0.5 מ"ל, 1.0 מ"ל Ag עם NaCl 1.0 מ"ל, 1.5 מ"ל Ag עם 1.5 מ"ל NaCl, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

91 / 53791fig3.jpg "/>
איור 3. SERS ספקטרום של ferbam ו אמפיצילין על קרום מסנן Ag צירופים מצופה מלמעלה למטה:. השליטה אצטוניטריל 50%, 10 ppb ferbam, בקרת מים, 1 ppm אמפיצילין, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4. ספקטרום SERS כרכים שונים של 100 ppb ferbam על קרום מסנן Ag צירופים מצופה מלמעלה למטה:. 3 מ"ל ferbam, 5 מ"ל ferbam, 7 מ"ל ferbam, 9 מ"ל ferbam, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

אחד השלבים קריטיים בפרוטוקול זה הוא סינתזת צירופי Ag, שבו צירופי Ag אחידים הם מפתח עבור תוצאות עקביות. שעת החימום ועל ריכוזי מבשרים חייבות להיות מבוקרת בדיוק. הגודל הממוצע של הכנת AgNPs זה 80 ננומטר, אשר נמדד על ידי Zetasizer (מידע לא מוצג). עוד צעד קריטי הוא צבירת המלח שבו ריכוז המלח וזמן צבירה חייבים להיות מבוקרים בדיוק. בנוסף, בחירה של הממברנה הוא גם קריטי כמו הקרום עם גודל נקבובי קטן יותר נמצא יעיל יותר nanoclusters מלכודת Ag. לקבלת קרום מסוים נעשה שימוש במחקר זה, יש גם צד מלפנים ומאחור איפה הצד הקדמי חייב להיות ממוקם בתוך מחזיק לחבר את המזרק. אם זה הונח למטה, הציפוי היה הרבה פחות יעיל. הימנעות בועות כאשר עוברים דרך הממברנה היא מפתח נוסף ציפוי מוצלח.

עבור פתרון בעיות של assay זה, את הדברים הבאים צעדיםמומלצים. אם אין או מעט אות מזוהה, לבדוק את הסיבות הבאות. הגורם העיקרי יכול להיות צירופי Ag אינם מצטברים מספיק כדי להיות לכוד בתוך נקבובי של הממברנה הסינון. הגדלת ריכוז המלח ו / או זמן הדגירה יכולה לשפר את ההצטברות. אחרת, לבדוק כי הישבן של קרום מסנן פונה כלפי מעלה כי היקף או ריכוז של מדגם טעון על הממברנה אינה נמוכה מדי. אם האות של מולקולת היעד אינו עולה בקנה אחד, לבדוק את הסיבות הבאות: חלוקת הגודל של צירופי Ag עשויה להיות רחבה מדי או הצירופים אינם מתחלקים באופן שווה על הממברנה, ככל הנראה בשל צבירה יותר מדי צירופים או מהר מדי עובר דרך הממברנה.

לעומת הנתונים הקודמים שלנו לשימוש דנדריטים Ag כמו מצע SERS, ^30-31 הרגישות של assay SERS המסנן מבוסס זה גבוה בהרבה על זיהוי ferbam. זאת בשל היתרון של המערכת מבוססת מסנן, אשר יכול לזרום large כמות המדגם, כך שיותר מולקולות אנליטי מרוכזות על גבי מצע SERS. יתרון נוסף של שימוש במערכת מבוסס המסנן מעל בשיטה המבוססת על הפתרון הוא קלות הפעלה ומדידת fieldable, כמו שאף צנטריפוגה יש צורך לאסוף את מורכבות NP-אנליטי. המגבלה של שיטה זו היא שהיא לא יכולה לשמש מטריצות נוזלות מורכבות כגון חלב ישירות, כמו הרכיבים מורכבים יכולים לחסום את הנקבוביות הממברנה. המקדים יש צורך להסיר רכיבים להתערב לפני שהיא עוברת את הממברנה.

לסיכום, אנחנו מדגימים assay SERS מבוסס מסנן פשוט רגיש, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של מזהמים או adulterations במטריצת מזון נוזל דגימות סביבתיות. כדי להמשיך לדחוף את המגבלה של זיהוי, אופטימיזציה של הפרמטרים, כגון גדלים NP וכמות, ריכוז מלח, נפח דגימה ופרמטרים מכשיר נדרש.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	N/A
Ferbam	Chem Service	N-11970-250MG	98+%
Silver nitrate	Sigma Aldrich	209139	99.0+%
Sodium citrate dehydrate	Sigma Aldrich	W302600	99+%
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653	99.5+%
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters	Fisher Scientific	VVLP01300	0.10 µm Pore Size, hydrophilic
Polycarbonate Filter Holders	Cole-Parmer	EW-29550-40	13 mm diameter
Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-365	N/A
Nutating Mixers	Fisher Scientific	05-450-213	N/A
DXR Raman spectroscope	Thermo Scientific	IQLAADGABFFAHCMAPB	Laser power: 1 mW Exposure time: 5 sec