Summary
Se presenta un procedimiento para la fabricación y la realización de la superficie a base de filtro de Raman espectroscópico (SERS) de ensayo mejorado para la detección de contaminantes químicos (es decir, ferbam pesticidas y antibiótico ampicilina).
Introduction
Superficie espectroscopia Raman mejorada (SERS) es una técnica que combina la espectroscopia Raman con la nanotecnología. La intensidad de la dispersión Raman de analitos en Noble nano-superficies metálicas es mucho mayor por la resonancia de plasmón de superficie localizada. 1 nanopartículas de plata (Ag NP) son con mucho los SERS más utilizados sustratos debido a su alta capacidad de mejora. 2 Hasta ahora , se han desarrollado diversos métodos de síntesis de Ag NP. 3-6 Ag NP pueden ser usados solos como sustratos SERS eficaces, o combinado con otros materiales y estructuras para mejorar su sensibilidad y / o funcionalidad. 7-11
Técnicas SERS han demostrado una gran capacidad para la detección de diversos contaminantes cantidad traza en alimentos y muestras medioambientales 12 Tradicionalmente, hay dos formas comunes para la preparación de una muestra SERS:.. Los métodos basados en sustrato y basados en solución 13 El metho basado en solucionesd utiliza coloides NP para mezclar con las muestras. A continuación, el complejo NP-analito se recoge mediante centrifugación, y se deposita sobre un soporte sólido para la medición Raman después del secado. El método basado en el sustrato se aplica generalmente mediante el depósito de varios microlitros de muestra de líquido sobre el sustrato sólido pre-fabricados. 14 Sin embargo, ninguno de estos dos métodos son eficaces y aplicables para una gran cantidad de volumen de muestra. Varias modificaciones de los ensayos de SERS superaron los límites de volumen, tales como la integración de un sistema de filtro de 15 a 21 o la incorporación de un dispositivo de microfluidos. 21-24 Los ensayos SERS modificados han mostrado una gran mejora en la sensibilidad y la viabilidad para el control de los contaminantes químicos en grandes muestras de agua.
Aquí demostramos el protocolo detallado de fabricación y aplicación de un método basado SERS filtro de jeringa para detectar trazas de pesticidas y ferbam antibiótico ampicilina.
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Protocol
1. Síntesis de nanopartículas de plata 15
- Disolver 18 mg de nitrato de plata en 100 ml de agua ultrapura (18,2 ΩU) y agitar durante 5 seg.
- Disolver 27 mg de dihidrato de citrato de sodio en agua 1 ml y agitar durante 5 seg.
- Transferir toda la solución de nitrato de plata preparado a un matraz cónico que contiene una barra de agitación y poner el matraz en una placa caliente magnético. Calentar el matraz con agitación vigorosa con una velocidad de agitación de 700 rpm a ~ 350 ° C (ajuste de la temperatura en el plato).
- Cuando hierva, añadir toda la solución de citrato de sodio preparado al matraz cónico de inmediato, y dejar la solución a hervir por 25 minutos adicionales hasta que la solución se vuelve marrón verdoso, lo que indica la formación de Ag NP.
- Retirar el matraz de la placa caliente y ponerlo en otro plato magnético (no caliente) y se agita O / N a la misma velocidad de agitación a temperatura ambiente hasta que la mezcla alcanza un estado estable, con un color y tran constantesparency. Utilice un espectrómetro UV-vis para determinar la absorbancia de los PN Ag preparados en caso necesario.
- Se diluye la mezcla final con agua ultrapura a 100 ml.
- Use un Zetasizer para medir el tamaño de los NPs Ag si es necesario de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Transferir el coloide Ag a un recipiente sellado y protegerlo de la luz con papel de aluminio. El coloide puede ser almacenado en un refrigerador a 4-7 ° C durante 2 meses si es necesario.
2. Fabricación de un filtro de membrana activa SERS
- Disolver 2,92 g de cloruro de sodio (NaCl) en 100 ml de agua para hacer una solución de NaCl 50 mM.
- Añadir 1 ml de la solución de NaCl 5 mM en 1 ml de los NPs Ag preparados y mezclarlas en un mezclador oscilante durante 10 minutos a 20 rpm. Este paso consiste en agregar los PN Ag en nanoacumulaciones AG.
- Colocar una membrana de filtro (PVDF, 0,1 micras de tamaño de poro) en un soporte de filtro, que puede ser unida a una jeringa. La membrana de tamaño de poro más pequeño era found más eficaz que la membrana de tamaño de poro más grande (es decir, 0,22 m) en atrapar nanoclusters de Ag y la producción de señales consistentes.
- Carga de 2 ml de los nanoclusters Ag preparada en la jeringa para la filtración. Coloque el soporte del filtro a la jeringa y pasar manualmente todo el volumen de nanoclusters Ag a través de la membrana en la velocidad de flujo de 1 gota / seg. Los nanoclusters trampas de membrana Ag, formando una membrana de filtro SERS-activo.
- Separar la membrana del filtro del soporte del filtro. Se necesita especial precaución cuando se sostiene la membrana en el borde exterior con un par de pinzas para asegurar que ningún daño a la membrana. secar al aire durante aproximadamente 3 min y el lugar de la membrana en un portaobjetos de vidrio.
- detección Raman del sustrato SERS
- Coloque el instrumento Raman para un láser de longitud de onda de 780 nm con una potencia de láser de 5 mW, tiempo de exposición de 1 segundo y la exposición número de 2. Establecer el objetivo microscópico hasta 10 veces más. Asegúrese de que el objetivo sobre el software está configurado en consecuencia también. </ Li>
- Colocar el portaobjetos de vidrio con la membrana en la parte superior en la plataforma del instrumento Raman y utilizar el microscopio para enfocar en la superficie de la membrana.
- Selección aleatoria de 8-10 puntos de la superficie de la membrana y el instrumento recogerá automáticamente en secuencia. Los datos espectrales abiertas en el software del fabricante para el análisis.
3. Aplicación del Sistema de SERS activo filtro para detectar contaminantes químicos
- Preparar una solución ferbam 10 ppb.
Precaución: Ferbam es altamente volátil. Se deben tomar precauciones (para respirar y lentes) cuando se pesa el sólido.- Pesar 2 mg de polvo ferbam y se disuelven en 20 ml 50% de acetonitrilo (10 ml de acetonitrilo y 10 ml de agua) para hacer una solución madre (100 ppm). Vortex el matraz durante 30 seg.
- Tomar 1 ml de la solución ferbam 100 ppm en un tubo de ensayo y añadir 9 ml 50% de acetonitrilo para preparar una solución 10 ppm. Vortex el tubo durante 5 seg.
- Tomar 1 ml de la10 ppm de solución en un tubo de ensayo y añadir 9 ml 50% de acetonitrilo para preparar una solución 1 ppm. Vortex el tubo durante 5 seg.
- Tomar 1 ml de la solución de 1 ppm en un tubo de ensayo y añadir 9 ml 50% de acetonitrilo para preparar una solución 100 ppb. Vortex el tubo durante 5 seg.
- Tomar 1 ml de la solución 100 ppb en un tubo de ensayo y añadir 9 ml 50% de acetonitrilo para preparar una solución 10 ppb. Vortex el tubo durante 5 seg.
- Preparar una solución de ampicilina 1 ppm.
- Pesar 10 mg de polvo de ampicilina y se disuelven en 100 ml de agua para hacer una solución de ampicilina 100 ppm. Vortex el matraz durante 30 seg.
- Tomar 1 ml de la solución de 100 ppm en un tubo de ensayo y añadir 9 ml de agua para hacer una solución de ampicilina 10 ppm. Vortex el tubo durante 5 seg.
- Tomar 1 ml de la solución de 10 ppm en un tubo de ensayo y añadir 9 ml de agua para hacer una solución de ampicilina 1 ppm. Vortex el tubo durante 5 seg.
- Ponga la membrana del filtro en el soporte del filtro, con el lado revestido NP hacia arriba. </ Li>
- Carga de 5 ml de una muestra en una nueva jeringa, y luego adjuntarlo al soporte del filtro con una membrana de Ag recubierto en su interior.
- pasar manualmente todo el volumen de muestra a través de la membrana a la velocidad de flujo de 1 gota / seg. Las moléculas diana pueden ser adsorbidos y se concentraron en los PN que recubren la membrana de filtro.
- Separar membrana de filtro desde el soporte del filtro, secar al aire durante aproximadamente 3 min y medir las señales utilizando el instrumento Raman utilizando el mismo método como se describe en el paso 2.6.
- Repita el paso 2.2 a 2.6 para preparar otra membrana recubierto de Ag, y siga desde el paso 3.3 para la detección de la otra muestra.
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Representative Results
Las principales etapas de este experimento se muestran en el diagrama esquemático (Figura 1). La Figura 2 demuestra la importancia de usar el volumen optimizado de AGNPS en el recubrimiento de membrana con el fin de alcanzar la sensibilidad maximizada. 1 ml de Ag NP proporciona la señal más fuerte cuando se utiliza ferbam, en comparación con 0,5 ml (recubrimiento insuficiente) o 2 ml (exceso de revestimiento).
Hemos sido capaces de detectar ferbam en el nivel 10 ppb y ampicilina a 1 ppm con gran intensidad de la señal mediante el ensayo de SERS basado en filtro desarrollado (Figura 1). El espectro SERS de ferbam exhibe picos característicos distintos a los 10 ppb. El pico a 1.386 cm-1 es de la vibración mixto de NC y C = S estiramiento y simétrica CH3 deformación. El pico a 1.516 cm-1 se asocia con CH 3 y CN estiramiento. El pico a 561 cm
Con el aumento de volumen de la muestra, se puede aumentar aún más el límite de detección, como se muestra en la Figura 4. Se observó un aumento de la intensidad de pico de al aumentar el volumen de la muestra. Esta es la ventaja del método basado en filtro como el volumen es ajustable y el límite de detección es también ajustable.
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Figura 1. Un diagrama esquemático del ensayo de SERS filtro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. SERS espectros de 5 ml 100 ppb ferbam pasa a través de las membranas recubiertas por diferentes cantidades de Ag NP De arriba a abajo:. 0,5 ml de coloide Ag con 0,5 ml de NaCl, 1,0 ml de Ag con 1,0 ml de NaCl, 1,5 ml de Ag con 1,5 ml de NaCl, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. SERS espectros de ferbam y ampicilina en la membrana de filtro recubierto de Ag NP De arriba a abajo:. El control del 50% de acetonitrilo, 10 ppb ferbam, control del agua, 1 ppm ampicilina, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. SERS espectros de diferentes volúmenes de 100 ppb en ferbam membrana de filtro recubierto de Ag NP De arriba a abajo:. 3 ml ferbam, 5 ml ferbam, 7 ml ferbam, 9 ml ferbam, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
Uno de los pasos críticos de este protocolo es la síntesis de Ag NP, donde uniformes NP Ag son la clave para obtener resultados consistentes. El tiempo de calentamiento y las concentraciones de los precursores deben ser controlados con precisión. El tamaño medio de esta preparación AGNPS es 80 nm, que se midió por el Zetasizer (datos no mostrados). Otro paso crítico es la agregación de sal donde la concentración de sal y el tiempo de agregación deben ser controlados con precisión. Además, la elección de la membrana también es crítica ya que la membrana con un tamaño de poro más pequeño se encontró más eficaz para atrapar nanoclusters AG. Para la membrana particular utilizada en este estudio, hay un lado frontal y posterior donde el lado frontal debe ser colocado en el soporte para conectar la jeringa. Si se coloca hacia abajo, el revestimiento era mucho menos eficaz. Evitar las burbujas al pasar a través de la membrana es otra clave para un recubrimiento con éxito.
Para la solución de problemas de este ensayo, los siguientes pasosse recomiendan. Si no se detecta ninguna o poca señal, la verificación de las siguientes causas. La causa principal podría ser los NPs AG no se agregan suficiente para ser atrapado en los poros de la membrana de filtro. El aumento de la concentración de sal y / o el tiempo de incubación puede mejorar la agregación. De lo contrario, compruebe que la parte trasera de la membrana de filtro quede hacia arriba y que el volumen o la concentración de la muestra cargados en la membrana no es demasiado baja. Si la señal de la molécula diana no es consistente, la verificación de las siguientes causas: la distribución del tamaño de los PN Ag puede ser demasiado amplio o los PN no se distribuyen de manera uniforme en la membrana, probablemente debido a un exceso de agregación de PN o demasiado rápido pasa a través de la membrana.
En comparación con nuestros datos previos sobre el uso de dendritas de Ag como sustrato SERS, 30-31 de la sensibilidad de este ensayo SERS basado en filtro es mucho mayor en la detección ferbam. Esto es debido a la ventaja del sistema basado en filtro, que puede fluir laRGE cantidad de muestra, de modo que más moléculas de analito se concentran sobre el sustrato SERS. Otra ventaja de usar el sistema basado en filtro sobre el método basado en la solución es la facilidad de operación y la medición fieldable, como no se necesita centrifugación para recoger el complejo NP-analito. La limitación de este método es que no se puede utilizar para matrices líquidas complejas, tales como la leche directamente, ya que los componentes complejos pueden bloquear los poros de la membrana. El tratamiento previo es necesario para eliminar los componentes de interferencia antes de pasar la membrana.
En resumen, se demuestra un ensayo de SERS basado en filtro simple y sensible, que podría aplicarse a la detección de contaminantes o adulteraciones en la matriz de alimentos líquidos y muestras ambientales. Para impulsar aún más el límite de detección, es necesaria la optimización de los parámetros, tales como NP tamaños y cantidad, concentración de sal, volumen de la muestra y los parámetros del instrumento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | N/A |
| Ferbam | Chem Service | N-11970-250MG | 98+% |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | 99.0+% |
| Sodium citrate dehydrate | Sigma Aldrich | W302600 | 99+% |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | 99.5+% |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters | Fisher Scientific | VVLP01300 | 0.10 µm Pore Size, hydrophilic |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole-Parmer | EW-29550-40 | 13 mm diameter |
| Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | N/A |
| Nutating Mixers | Fisher Scientific | 05-450-213 | N/A |
| DXR Raman spectroscope | Thermo Scientific | IQLAADGABFFAHCMAPB | Laser power: 1 mW Exposure time: 5 sec |
References
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