Summary
Procedimento per la fabbricazione ed eseguendo la superficie filtro Enhanced Raman spettroscopiche (SERS) Test per l'individuazione dei contaminanti chimici (cioè, ferbam pesticidi e ampicillina) è presentata.
Introduction
Surface Enhanced spettroscopia Raman (SERS) è una tecnica che combina spettroscopia Raman con la nanotecnologia. L'intensità di scattering Raman di analiti a nobili metallici nano-superfici è notevolmente migliorata dalla risonanza plasmonica di superficie localizzata. 1 nanoparticelle di argento (Ag NP) sono di gran lunga i SERS più utilizzati substrati grazie alla sua elevata capacità di valorizzazione. 2 Fino ad oggi , sono stati sviluppati diversi metodi di sintesi di Ag NP. 3-6 Ag NP può essere usato da solo come substrati SERS efficaci, o combinati con altri materiali e strutture per migliorare la sensibilità e / o la funzionalità. 7-11
Tecniche SERS hanno dimostrato grande capacità di rilevamento di vari contaminanti quantità in tracce negli alimenti e nei campioni ambientali 12 Tradizionalmente, ci sono due modi comuni per la preparazione di un campione SERS:.. Soluzione-based e metodi di substrato a base 13 Il metho soluzione basata sud utilizza colloidi NP per mescolare con i campioni. Poi il complesso NP-analita viene raccolto mediante centrifugazione, e depositato su un supporto solido per la misurazione Raman dopo l'essiccazione. Il metodo substrato a base di solito è applicata depositando diversi microlitri di campione liquido sul substrato solido prefabbricato. 14 Tuttavia, nessuno di questi due metodi sono efficaci e applicabili per una grande quantità di volume di campione. Diverse modifiche dei dosaggi SERS superato i limiti di volume, come l'integrazione di un sistema di filtri 15-21 o l'incorporazione di un dispositivo microfluidico. 21-24 I saggi SERS modificati hanno mostrato grande miglioramento nella sensibilità e la fattibilità del monitoraggio dei contaminanti chimici in grandi campioni di acqua.
Qui mostriamo il protocollo dettagliato di fabbricazione e applicazione di un metodo basato SERS filtro siringa per rilevare quantità traccia di ferbam pesticidi e antibiotici ampicillina.
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Protocol
1. argento delle nanoparticelle di sintesi 15
- Sciogliere 18 mg di nitrato d'argento in 100 ml di acqua ultrapura (18.2 ΩU) e vortex per 5 sec.
- Sciogliere 27 mg di sodio citrato diidrato in acqua 1 ml e vortex per 5 sec.
- Trasferire tutta la soluzione di nitrato d'argento disposti in una beuta contenente una barra di agitazione e mettere il pallone su una piastra calda magnetica. Riscaldare il pallone sotto agitazione vigorosa con una velocità di agitazione di 700 giri al minuto a ~ 350 ° C (temperatura impostata sulla piastra).
- Quando bolle, aggiungere tutta la soluzione di citrato di sodio preparato nella beuta immediatamente e lasciare la soluzione a bollire per altri 25 min fino a quando la soluzione diventa marrone verdastro, che indica la formazione di Ag NP.
- Togliere il pallone dalla piastra calda e metterlo su un altro piatto magnetico (non riscaldare) e mescolare O / N alla stessa velocità di agitazione a temperatura ambiente fino a quando il composto non raggiunge uno stato stabile, con un colore costante e transparency. Utilizzare uno spettrometro UV-vis per determinare l'assorbimento delle Ag NP preparati, se necessario.
- Diluire la miscela finale con acqua ultrapura a 100 ml.
- Utilizzare un Zetasizer per misurare le dimensioni delle nanoparticelle di Ag, se necessario, secondo il protocollo del produttore.
- Trasferire il colloide Ag in un contenitore sigillato e proteggerlo dalla luce con un foglio di alluminio. Il colloide può essere conservato in frigorifero a 4-7 ° C per 2 mesi, se necessario.
2. Realizzazione di un SERS attivo filtro a membrana
- Sciogliere 2,92 g di cloruro di sodio (NaCl) in 100 ml di acqua per ottenere una soluzione 50 mM di NaCl.
- Aggiungere 1 ml di soluzione 5 mM NaCl in 1 ml di Ag NP preparati e mescolare su un agitatore oscillante per 10 min a 20 rpm. Questo passo è quello di aggregare le NP Ag in nanoclusters AG.
- Collocare una membrana filtrante (PVDF, 0,1 micron dimensione dei pori) in un portafiltro, che può essere collegato ad una siringa. La membrana dimensione dei pori più piccola era FOund più efficace rispetto alla dimensione dei pori di membrana più grandi (cioè, 0,22 micron) in intrappolamento nanocluster Ag e produrre segnali coerenti.
- Carico 2 ml di nanocluster Ag preparati nella siringa per la filtrazione. Agganciare il portafiltro alla siringa e passare manualmente l'intero volume di nanocluster Ag attraverso la membrana al flusso di 1 goccia / sec. I nanocluster trappole membrana Ag, formando una membrana filtrante SERS-attiva.
- Staccare la membrana del filtro dal supporto del filtro. Particolare cautela è necessaria quando si tiene la membrana sul bordo esterno usando un paio di pinzette per garantire nessun danno alla membrana. Aria secca per circa 3 min e posto membrana su un vetrino.
- rilevamento Raman del substrato SERS
- Impostare lo strumento Raman di un laser a lunghezza d'onda di 780 nm con una potenza laser di 5 mW, tempo di esposizione di 1 secondo e l'esposizione numero di 2. Impostare l'obiettivo microscopico a 10 volte. Assicurarsi che l'obiettivo del software è impostato di conseguenza troppo. </ Li>
- Posizionare il vetrino con la membrana in alto sulla piattaforma dello strumento Raman e utilizzare il microscopio a concentrarsi sulla superficie della membrana.
- Casualmente selezionare 8-10 macchie dalla superficie della membrana e lo strumento raccoglierà automaticamente in sequenza. Aperte dati spettrali nel software del produttore per l'analisi.
3. Applicazione della SERS Filtro Attivo sistema di rilevare contaminanti chimici
- Preparare una soluzione ferbam 10 ppb.
Attenzione: Ferbam è altamente volatile. Utilizzare precauzioni (respiratore e occhiali) nel valutare il solido.- Pesare 2 mg polvere ferbam e scioglierlo in 20 ml 50% acetonitrile (10 ml di acetonitrile e 10 ml di acqua) per ottenere una soluzione stock (100 ppm). Agitare il pallone per 30 sec.
- Prendere 1 ml di soluzione ferbam 100 ppm in una provetta e aggiungere 9 ml 50% acetonitrile per ottenere una soluzione 10 ppm. Agitare la provetta per 5 secondi.
- Prendere 1 ml di10 ppm soluzione in una provetta e aggiungere 9 ml 50% acetonitrile per ottenere una soluzione 1 ppm. Agitare la provetta per 5 secondi.
- Prendere 1 ml della soluzione di 1 ppm in una provetta e aggiungere 9 ml 50% acetonitrile per ottenere una soluzione di 100 ppb. Agitare la provetta per 5 secondi.
- Prendere 1 ml della soluzione 100 ppb in una provetta e aggiungere 9 ml 50% acetonitrile per ottenere una soluzione 10 ppb. Agitare la provetta per 5 secondi.
- Preparare una soluzione ampicillina 1 ppm.
- Pesare 10 mg polvere ampicillina e sciogliere in 100 ml di acqua per ottenere una soluzione ampicillina 100 ppm. Agitare il pallone per 30 sec.
- Prendere 1 ml della soluzione 100 ppm in una provetta e aggiungere 9 ml di acqua per ottenere una soluzione ampicillina 10 ppm. Agitare la provetta per 5 secondi.
- Prendere 1 ml della soluzione di 10 ppm in una provetta e aggiungere 9 ml di acqua per ottenere una soluzione ampicillina 1 ppm. Agitare la provetta per 5 secondi.
- Mettere la membrana del filtro ai portafiltri, con il lato rivestito NP rivolto verso l'alto. </ Li>
- Carico 5 ml di un campione in una nuova siringa, e poi attaccarlo al supporto del filtro con una membrana di Ag ricoperto all'interno.
- Far passare manualmente l'intero volume del campione attraverso la membrana al flusso di 1 goccia / sec. molecole bersaglio possono essere assorbiti e concentrati sulle NP adesi alla membrana del filtro.
- Sfilare membrana del filtro dal portafiltro, asciugare all'aria per circa 3 minuti e misurare i segnali utilizzando lo strumento Raman utilizzando lo stesso metodo descritto al punto 2.6.
- Ripetere passaggio 2.2 2.6 preparare un'altra membrana Ag-rivestito, e seguire dal punto 3.3 per il rilevamento degli altri campioni.
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Representative Results
Le fasi principali di questo esperimento sono stati mostrati nel diagramma schematico (Figura 1). La Figura 2 ha dimostrato l'importanza di usare il volume ottimizzata AGNPS nel rivestimento della membrana al fine di ottenere sensibilità massimizzato. 1 ml di Ag NP fornisce il segnale più forte quando si utilizza ferbam, rispetto a 0,5 ml (rivestimento insufficiente) o 2 ml (troppo rivestimento).
Siamo stati in grado di rilevare ferbam a livello 10 ppb e ampicillina a 1 ppm con grande intensità del segnale da parte del saggio SERS filtro-based sviluppata (Figura 1). Lo spettro SERS di ferbam mostra distinti picchi caratteristici a 10 ppb. Il picco a 1,386 cm -1 è dalla vibrazione mista di CN e C = S allungamento e simmetrica CH 3 deformazione. Il picco a 1,516 cm -1 è associata con CH 3 CN e allungamento. Il picco a 561 cm
Con l'aumento del volume del campione, possiamo aumentare ulteriormente il limite di rilevamento, come mostrato in Figura 4. Abbiamo osservato un aumento dell'intensità di picco quando si aumenta il volume del campione. Questo è il vantaggio del metodo basato filtro come il volume è regolabile e il limite di rilevazione è regolabile.
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Figura 1. Un diagramma schematico di test filtro SERS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. SERS spettri di 5 ml 100 ppb ferbam passando attraverso le membrane rivestite da diverse quantità di Ag NP Dall'alto in basso:. 0,5 ml Ag colloidale con 0,5 ml di NaCl, 1,0 ml di Ag con 1,0 ml di NaCl, 1,5 ml di Ag con 1.5 ml NaCl, rispettivamente. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. SERS spettri di ferbam e ampicillina su Ag NP membrana del filtro rivestito Dall'alto in basso:. Il controllo del 50% acetonitrile, 10 ppb ferbam, il controllo di acqua, 1 ppm ampicillina, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
Figura 4. SERS spettri di diversi volumi di 100 ppb ferbam su Ag NP membrana del filtro rivestito Dall'alto in basso:. 3 ml ferbam, 5 ml ferbam, 7 ml ferbam, 9 ml ferbam, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Uno dei passaggi critici in questo protocollo è la sintesi Ag NP, dove uniformi Ag NP sono la chiave per ottenere risultati coerenti. Il tempo di riscaldamento e le concentrazioni di precursori devono essere controllati con precisione. La dimensione media di questa preparazione AGNPS è di 80 nm, che è stata misurata dal Zetasizer (dati non mostrati). Un altro passo importante è l'aggregazione di sale in cui la concentrazione di sale e tempo di aggregazione devono essere controllati con precisione. Inoltre, la scelta di membrana è anche critica come la membrana con dimensione dei pori più piccolo è stato trovato più efficace per intrappolare Ag nanocluster. Per la particolare membrana utilizzata in questo studio, c'è un lato anteriore e posteriore in cui il lato anteriore deve essere posizionato nella detentore di collegare la siringa. Se è stata immessa in giù, il rivestimento era molto meno efficace. Evitare bolle quando passa attraverso la membrana è un'altra chiave per un rivestimento successo.
Per la risoluzione dei problemi di questo test, i seguenti passaggisono raccomandati. Se non viene rilevato alcun segnale o poco, verificare le seguenti cause. La causa principale potrebbe essere PN Ag non sono aggregate abbastanza per essere intrappolato nei pori della membrana filtrante. Aumentando la concentrazione di sale e / o il tempo di incubazione può migliorare l'aggregazione. Altrimenti, verificare che la parte posteriore della membrana filtro è rivolto verso l'alto e che il volume o la concentrazione di campione caricati alla membrana non sia troppo basso. Se il segnale della molecola bersaglio non è coerente, verificare le seguenti cause: la distribuzione delle dimensioni delle NP Ag potrebbe essere troppo ampia o le nanoparticelle non sono distribuiti in modo uniforme sulla membrana, probabilmente a causa di troppo aggregazione di NP o troppo veloce passa attraverso la membrana.
Rispetto ai nostri precedenti dati sull'uso dendriti Ag come substrato SERS, 30-31 la sensibilità di questo saggio SERS filtro-based è molto più alta sul rilevamento ferbam. Ciò è dovuto al vantaggio del sistema basato su filtri, che può scorrere large quantità di campione, in modo che più molecole di analiti sono concentrati sul substrato SERS. Un altro vantaggio di usare il sistema di filtro basato sul metodo di soluzione basata è la facilità di funzionamento e misura fieldable, come è necessario alcun centrifugazione per raccogliere il complesso NP-analita. La limitazione di questo metodo è che non può essere utilizzato per matrici liquide complessi come latte direttamente, come i componenti complessi possono bloccare i pori della membrana. Il pretrattamento è necessaria per rimuovere i componenti interferenti prima di passare la membrana.
In sintesi, abbiamo dimostrato un saggio SERS basato su filtro semplice e sensibile, che potrebbe essere applicato alla rivelazione di contaminanti o sofisticazioni a matrice alimentare liquidi e campioni ambientali. Per spingere ulteriormente il limite di rilevazione, è necessaria l'ottimizzazione dei parametri, quali i formati NP e la quantità, la concentrazione di sale, volume del campione e parametri dello strumento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | N/A |
| Ferbam | Chem Service | N-11970-250MG | 98+% |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | 99.0+% |
| Sodium citrate dehydrate | Sigma Aldrich | W302600 | 99+% |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | 99.5+% |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters | Fisher Scientific | VVLP01300 | 0.10 µm Pore Size, hydrophilic |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole-Parmer | EW-29550-40 | 13 mm diameter |
| Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | N/A |
| Nutating Mixers | Fisher Scientific | 05-450-213 | N/A |
| DXR Raman spectroscope | Thermo Scientific | IQLAADGABFFAHCMAPB | Laser power: 1 mW Exposure time: 5 sec |
References
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