Introduction
多細胞生物において、細胞遊走は、組織や器官への細胞の組織化を確実に胚の発達のために、それが組織の恒常性（創傷治癒）および免疫性に関与する成人用の両方に必須です。これらの生理学的な機能に加えて、細胞遊走はまた、特に、癌転移を含む多様な病的状態に関与しています。
細胞遊走は、平坦な表面上での細胞の移動を確保する分子機構の全体的な理解を提供する、数十年にわたってインビトロで分析された。 インビボではしかしながら、細胞は、より複雑な環境に直面しています。明らかに、移行を誘導する細胞や分泌ケモカイン隣接、そのような細胞外マトリックスとして生体内移行が外部の合図によって影響され得ることは、過去数年に登場し、その記載されているものと異なる場合があり、細胞移動を駆動機構<em>のin vitroで1,2。 生体内の細胞遊走に確保するメカニズムは、in vitro試験に比べて、主に増加した技術的な困難のため、これまであまり注目されてきた。特に、細胞遊走のインビボ分析遊走細胞への直接的な光アクセスを必要とする、でユニークな細胞を標識するためのテクニックその原動力と形態、ならびにゲインまたは機能の損失を見るためには、候補遺伝子の役割をテストするために近づきます。これまでのところ、これらの特性を保有するだけ少数のモデル系は、 インビボ細胞遊走3 に切開するために使用されています。
我々は最近、 生体内の細胞遊走4,5 に制御する際に候補遺伝子の機能を評価するために、新しい便利なモデルシステムとして初期のゼブラフィッシュの胚に前向き脊索前板の移行を使用していました。 （また、前方の中内として知られている）前向き脊索前板はGASTの開始時に形成する細胞群であります胚の背側にrulation。原腸形成時に、このグループをまとめ脊索前板、中内胚葉の肥厚、脊索に前方、および神経板の下にあるを形成するために、胚6-8の動物極に向かって移動します。その後部の可能性が高い中胚葉9を頭に貢献しながら、脊索前板の前方部分は、孵化腺を生じさせます。外部開発及び魚類胚の光学的透明度のおかげで、細胞遊走を直接かつ容易にこの構造では観察することができます。
細胞移植は、モザイク胚10を迅速かつ簡単に作成できます非常に強力なテクニックです。単離された細胞を標識に移植された細胞の結果で蛍光細胞骨格マーカーを発現する、の形態とダイナミクスを容易に観察することができます。機能の喪失またはゲインにこれをアプローチ組み合わせることにより、缶の細胞自律的な機能の分析を可能にしますdidate遺伝子。
提示されたプロトコルは、我々は生体内 5 に細胞遊走およびアクチンダイナミクスを制御する際にTORC2コンポーネントSIN1の機能を評価する方法について説明します。しかし、結果に記載し、さらに説明するように、 インビボでの細胞遊走を制御する任意の候補遺伝子の潜在的な含意を分析するために使用することができます。
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Protocol
注： 図1は、プロトコルの概要を提示します。
注射や移植のための針の作製
注針はいつでも調製し、保存することができます。粘土の帯に、ペトリ皿に保管してください。ほこりから保護するために、パラフィルムで皿を密封します。
- 注射針の場合は、マイクロピペットプラーで（ 材料のリストを参照）（フィラメント（ 材料のリストを参照）することなく、直径0.58ミリメートルの内部に、直径1.0ミリメートル外）ガラスキャピラリーを引き出します。彼らは絨毛膜を貫通するためのより効率的であるように短く、細い針（約5mmのテーパー部）を好みます。
注：注射針は使い捨てです。 - 細胞移植のための針
- マイクロピペットプラーと（フィラメント（ 材料のリストを参照）することなく、直径0.78ミリメートルの内部に、直径1.0ミリメートル外）ガラスキャピラリーを引き出します。
- U（材料のリストを参照）マイクロフォージを歌う、内径は（移植する細胞の直径よりもわずかに多く）は35μmである点で、針の先端を切りました。
- 45°の角度でベベルmicrogrinderと毛細血管の切断端（ 材料のリストを参照）。
- 必要に応じて、マイクロフォージを使用して、針の先端にバーブを引っ張ります。このために、傘の先端で熱フィラメントに触れると急速に胚を貫通することができバーブを作成し、それを引き離します。
- 注射器に取り付けられた針ホルダーの針をマウントします。シリンジを用いて、ガラスの残留物を除去し、次いで、アセトンで3回リンスし、2％フッ化水素酸で針の内部を3回洗浄します。
注意：フッ酸は毒性があり、手袋をして、ボンネットの下に操作します。
注：細胞移植針を数回使用することができます。
の調製インジェクションおよび細胞移植のための食器
- 熱フルパワーで1分間電子レンジでアガロース0.5gを含む11培地胚50mlの胚培地中で1％アガロースを取得します。約60℃まで、アガロースゲルを冷却し、90 mmのペトリ皿中で50ミリリットル注ぎます。特別に設計された金型（材料のリストを参照）、いずれかの注射皿のためのラインで、または細胞移植皿のためのウェルを有するゲルの表面に配置します。
- アガロースが高すぎない場合、アガロースに金型floatを守ってください。アガロースゲルが設定された後、鉗子（ - B 図2A）で金型を削除します。
注：料理は数週間まで、4℃で保存することができます。乾燥を避けるために、閉じられた湿った箱に保管してください。
- アガロースが高すぎない場合、アガロースに金型floatを守ってください。アガロースゲルが設定された後、鉗子（ - B 図2A）で金型を削除します。
- 使用前に28℃のインキュベーターで30分で皿を置きます。
3.胚の収集と注入
- 注射溶液の調製
注：アクチン結合ドメイン酵母アクチンのmCherryを（ABP140-mCherryをと呼ばれる）に結合したそのようなLifeactような結合タンパク質140（ABP-140）は、突出活性を分析するために、細胞内の重合アクチンを可視化するために使用されます。候補遺伝子（ドミナントネガティブまたは構成的に活性な構築物を例えば、mRNA、またはモルホリノオリゴヌクレオチド）の機能をテストするために他の化合物を追加します。結果（ 図3）に記載のようにSIN1の機能を評価するために、我々は、モルホリノオリゴヌクレオチドを使用します。対照として、我々はSIN1のモルホリノと同一のモルホリノを使用するが、この制御モルホリノは標的RNAと一致しないように配列に沿って分布する5ヌクレオチドについて。- 解凍SIN1と5-ミスマッチ対照モルホリノ（2 mMのストック溶液）、そして氷上でABP140-mCherryをするmRNA。 mRNAの375 ngの（75 ngの/最終μL）およびSIN1または5-ミスマッチ対照モルホリノいずれかの0.75μL（0.3 mMの最終）Danieauバッファー（58 mMの塩化ナトリウム、0.7mMの中を追加KCl、0.4mMのMgSO 4を、0.6ミリモルのCa（NO 3）2、5.0 mMのHEPES pHは7.6）を、5μlの総体積に到達します。
- 胚コレクション
注：両方のドナーとホスト胚は将来の脊索前板11を可視化するために、 グースコイド （GSC）プロモーターの制御下でGFPを発現する、トランスジェニックで設定し、この実験のために。- 卵：Tgは（GFP GSC）を収集します。胚培地で満たされた90ミリメートルペトリ皿に約80卵を置き、28℃でインキュベートします。
- ドナー胚を注入
- 実体顕微鏡下では、静かに胚培地で満たされた注射皿のラインにピンセットで収集した胚を絞ります。鉗子を使用して、上部に向かって細胞と胚を向けます。胚は4細胞期（1時間後に受精）に到達するまで28℃のインキュベーター内注入皿を置きます。
- の2μlの注射針をロード注射液。空気transjectorに（材料のリストを参照してください）マイクロマニピュレーターに入れ、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブ（ 材料のリストを参照）に接続された針ホルダ（材料のリストを参照）で針を挿入します（材料のリストを参照してください。 ）。
- 優しく細かい鉗子で先端を触れることにより、キャピラリーを開きます。必要に応じて、その先端をつまんでオープンキャピラリーを切りました。
- 針で4つのセルのいずれかを入力し、細胞容積（2 NL）の70％を満たすために、セル内の溶液を注入します。 30胚を注入します。
注：原形質膜が柔らかいように、細胞に針を得ることは、困難な場合があります。細胞と卵黄の間の接合部に目指して針の貫通を容易にします。 - 彼らは球ステージ（4時間後に受精）に到達するまで28℃のインキュベーターで胚を置きます。
セルTransplantatのための胚の4準備イオン
- 200μlのペニシリン/ストレプトマイシン（材料のリストを参照してください）（ペニシリン/ストレプトマイシンEM）で胚培地20mlを準備します。
- 球の段階での胚のDechorionation（4時間後の受精）
注：Dechorionated胚は非常に壊れやすく、空気やプラスチックとの接触の場合に爆発します。したがって、これらは、アガロースでコーティングされた皿に入れ、ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて転送する必要があります。- プラスチック製パスツールピペットを用いて、胚培地に1％アガロースで被覆し、ペニシリン/ストレプトマイシンEMで充填された2つの35ミリメートルペトリ皿にステップ3.3で注入ステップ3.2で収集ホスト胚およびドナー胚を移します。二つの別々の皿でホスト胚およびドナー胚を保管してください。
- 手動で微ピンセット（材料のリストを参照）との絨毛膜から胚を抽出します。
- 彼らはシールドステージ（6時間後に受精）に到達するまで28℃のインキュベーターで胚を置きます。
5.細胞移植
- 細胞移植のために胚を配置します。
- 蛍光実体顕微鏡下では、選択したドナー胚はABP140-mCherryをシールド内（赤）（緑）を発現します。
- ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、ペニシリン/ストレプトマイシンEMで満たされた細胞移植皿のウェルに胚を移します。隣の行に1行のホスト胚およびドナー胚を置きます。
- まつげを使用して、慎重にシールドを上にして胚を向けます。
注：シールドの位置は、GFP発現または解剖学によって評価することができます。
- 移植システムセットアップ。
注：移植システムは、マイクロドライブを搭載したハミルトンシリンジにPTFEチューブ（ 材料のリストを参照）、チューブコネクタに接続された針ホルダ（材料のリストを参照してください）（ 材料のリストを参照）で構成されている（リストを参照してください材料の）。持針器3ウェイマイクロマニピュレータに搭載されている（ 材料のリストを参照）。- 注射器に取り付けられた針ホルダを使用して、70％エタノールで細胞移植のために針をすすぎます。針に空気を吸い込むことにより、ドライ。これは埃が針のテーパ部で立ち往生になる可能性があるため、吹き付けて乾燥させないでください。
- ベベル上向きで、ハミルトンシリンジに接続された針ホルダーに針を挿入します。
- シールド・ツー・シールド細胞移植
- 移植針でドナー胚のシールドを入力し、ABP140-mCherryをで標識された約10〜20セルを描きます。慎重に卵黄を描く避けます。
- 宿主胚のシールドに細胞を移植します。すべてのホスト胚を移植されるまで繰り返します。
- ファイアーポリッシュパスツールピペットで破損した胚を削除します。 28℃のインキュベーターで移植した胚を置き、それらを約30分間回復しましょう。
- 針を使用して注射器に取り付けたホルダーは、水で細胞移植針をすすぎ、粘土のバンドにペトリ皿に戻ってそれを置きます。パラフィルムで皿を密封します。
6.（任意）単一細胞移植
注：移植針で1つのセルだけを描画することが困難であるように胚では、細胞は、互いに接着します。私たちは、簡単に、単一の脊索前板前駆細胞を移植するために修正されたプロトコルを開発しました。アイデアは、移植前に細胞を解離することです。単離された脊索前板前駆細胞は、それらの同一性を失う傾向があるので、我々は、遺伝子Sox32転写因子の非存在下で、Nodalのシグナル伝達経路を活性化することによって、それらを将来の脊索前板の同一性を課します。我々は、これらの誘導された細胞は、内因性脊索前板前駆細胞8のように振る舞うことを確認しました。以下は、単一細胞移植を実行するための具体的な手順は次のとおりです。細胞dissociaンは、カルシウムを含まないリンガー11に胚を置く植片を解剖し、機械的にそれを攪拌することにより達成されます。
- ステップ2.1では、代わりに胚中のカルシウムフリーリンガー中の1％アガロースでの移植の料理を準備。
- ステップ3.1では、ABP140-mCherryをRNAおよびSIN1モルホリノに加えて、2で3（最終0.6 ngの/μl）をノーダル受容体Taram-Aの活性形態をコードするRNAのngのとsox32に対するモルホリノの1.25μlの（ストック溶液を追加mMの、したがって、0.5 mMの最終）。
- ステップ4の後、ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、ペニシリン/ストレプトマイシンカルシウムフリーリンガーで満たされた細胞移植のため皿に3つの選択されたドナー胚を移します。細かいピンセットで、注入された細胞（ABP140-mCherryを標識された細胞）を含む外植を分析。急速に胚の残りを捨てます。
- 細胞が解離するまでまつ毛と、そっと外植片をかき混ぜます。
- 移植針で単一の単離された細胞を描きますそして、宿主胚のシールドにそれを移植。
- ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、ペニシリン/ストレプトマイシンEMで満たされたアガロースでコーティングされた皿に胚を移します。 30分間28℃のインキュベーターで胚を置きます。
取り付け7.胚
- イメージング商工会議所
- 方法1：1の側（ 図2C - D）に3ミリメートル高いエッジで、4つの穴（5.5ミリメートルの直径）が貫通プラスチックスライド（75 * 25 * 0.5ミリメートル）で構成される撮像チャンバを使用しています。シアノアクリレート系接着剤（スーパーグルー）で、裏面のカバーガラスを接着。
注意：実験の最後に、カバースリップを削除し、サンドペーパーで接着剤残基を取り除くために一晩水にチャンバーを配置。 - 方法2：10ミリメートル穴と35ミリメートルマテックのガラスボトムディッシュを（ 材料のリストを参照）を使用します。
- 方法1：1の側（ 図2C - D）に3ミリメートル高いエッジで、4つの穴（5.5ミリメートルの直径）が貫通プラスチックスライド（75 * 25 * 0.5ミリメートル）で構成される撮像チャンバを使用しています。シアノアクリレート系接着剤（スーパーグルー）で、裏面のカバーガラスを接着。
- 胚の取り付け
- 胚培地中でホット0.2％アガロースの1ミリリットルのガラスバイアルを埋めます。ヒートブロックで42℃で、それを保管してください。
- 蛍光実体顕微鏡下では、移植された細胞を赤くした胚を選択し、緑色で標識された将来の脊索前板の一部（ すなわち赤移植された細胞は緑色の将来の脊索前板内にあり、かつ動物極に向かって移行し始めている）されています。
- ファイアーポリッシュパスツールピペットでアガロース溶液中に、選択した胚を転送します。ピペットからの胚培地の過剰を捨てます。アガロースとピペットで胚を描き、撮像チャンバ内に胚を転送する、アガロースの液滴を堆積させます。アガロースが設定される前に、まつげを持つ胚を向けます。正立顕微鏡とイメージングのために上向きに前向き脊索前板を置き、または倒立顕微鏡の撮像用ガラス底に。アガロースは、チャンバーの次のウェル内の別の胚をマウントする前に（室温に応じて、1分程度）に設定されるまで待ちます。
注：イメージング茶4ウェルを含むmberは4胚まで取り付けることができます。 - アガロースが設定されている場合、乾燥を避けるために、ペニシリン/ストレプトマイシンEMでチャンバを充填します。
8.ライブイメージング
- 40X水浸長距離レンズを使用してください。 GFPのために（画像GFPとmCherryをに適切なフィルターセットを使用します。励起BP 40分の470、ビームスプリッタFT 510、及び発光BP 50分の540; mCherryをするために：励起BP 21分の578、ビームスプリッタFT 596、および発光LP 641 / 75）。画像のダイナミクスを最適化するために、露光時間を調整します。
- プレート内のすべてのセルの画像に、（外胚葉中）前向き脊索前板上記数μmを開始し、（卵黄中）前向き脊索前板下の数μmを終了、z軸スタックを取得します。 2ミクロンのzステップを使用してください。取得速度を最適化するために、z軸スタックの間ではなく、フレーム間で色を切り替えます。
これは、緑と赤の画像間のわずかな違いにつながる可能性があり、ない正確な共同以来の問題ではありません注：緑と赤の信号の間-localizationが必要となります。光をさらに撮像時間と暴露を低減するために、緑のは一度だけ脊索前板前駆細胞を同定するのに十分である、すべての5つの時間点を、取得することができます。 - 突起周波数および方位を分析する必要がある2分の時間間隔内で4の胚に、画像のような設定を使用して。突起寿命の分析のために、より高い時間分解能を得るために30秒の時間間隔を減少させます。 80％の被包に60％の被包からの画像。
9.細胞動態解析
- ImageJの中に4D画像を読み込みます
注：取得のために使用するソフトウェアによっては、画像が異なる形式で保存されている（画像ごとに1ファイル、zスタックごとに1ファイル、実験全体に1つのファイル）。いくつかのImageJのプラグイン4Dスタックを開くことがオンラインで入手できます。我々のデータは、zスタックごとに1つのファイルとして格納されます。データセットが大きくなる可能性があるので、それの一部だけ（いくつかのティムを開くために便利ですeは点、またはzスタックの下位区分、または8ビットの変換画像...）。私たちは、リクエストに応じて配布するために幸せになるこれは、そうするためにカスタムメイドのImageJのプラグインを使用します。 - オリエンテーションの分析および細胞突起の頻度
- 将来の脊索前板の移動の主方向を決定するために、GFPの画像を使用してください。細胞突起角の測定のための基準としてこれを取ります。この基準方向が画像の一辺と平行になるように、スタックを回転させます。
- 一つのセルに従ってください。角度ツールを選択します。各フレームおよび各突出部は、突出部と基準方向（ 図3A）との間の角度を測定するために、角度ツールを使用します。 （キーボード上やプレスM）の値を格納するために測定/分析コマンドを使用します。 txtファイルとして結果を保存します。次のセルで繰り返します。
- ヒストグラムとしてR、プロットの角度分布にデータをインポートします。さまざまな条件を比較するためにコルモゴロフ - スミルノフ検定（Rでks.test）を使用します。
注：角度ツールは、古典的な統計的検定と円形でないテストの使用を可能にする、0°と180°の間に含まれる値を提供します。 - このデータセットを用いて、毎分細胞あたりの突起の数と発光周波数を算出します。使用異なる条件を比較するスチューデントT検定（Rでt.test）。
- 細胞突起寿命の解析
- 各セルと各突出部は、突出期間（突起がフレーム間に存在するのx時間間隔である間のフレーム数）を測定します。
- さまざまな条件を比較するためにR.使用スチューデントT検定（Rでt.test）にデータをインポートします。
注：他のマイグレーション機能は、細胞遊走を特徴づけるために分析することは興味深いことができます。これらは、速度、方向、持続性の測定のための細胞トラック、または細胞の形態が含まれます。いくつかの商用ソフトウェア・アプリケーションは、これらの機能を測定するために利用可能であるが、オープンソース・ソフトウェア・アプリの数が多いですカチオンとImageJのプラグインは、細胞の軌跡と指向性持続性13を見てDiPer、例えばとしてmorphodynamics 12を分析することADAPT、また、移行14時のセルの境界を追跡するCellTrackご利用いただけます。
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Representative Results
提示された技術は、 インビボ細胞遊走に制御する際に、SIN1、Torの錯体2（TORC2）のコア要素の1つの役割を分析するために使用しました。細胞移植の使用は、単離された細胞と細胞自律的効果の分析の標識化を可能にします。映画S1は、移植脊索前板前駆細胞の遊走を示しています。 ABP140とアクチン標識がアクチン豊富な細胞質突起の容易な可視化を可能にします。私たちは、その頻度と向きを測定しました。野生型細胞は、移動の方向（ 図3B）、 すなわち動物極の方向に配向頻繁な大きな細胞質突起を生成します。 SIN1の機能の喪失は、アクチンリッチ突起の形成を制御するSIN1の重要性を実証し、残りの大幅な突起の数の減少、およびランダム化につながります。興味深いことに、この表現型は、電子によって救出することができますRac1の15の構成的に活性な形のXPRESSIONは、強くTORC2はRac1の（ 図3B）を介してアクチン動態と細胞突起の形成を制御することを示唆しています。
提示された技術は、細胞動態4に、Arpin、ARP2 / 3複合体の最近同定された阻害剤の役割を特徴づけるために使用されました。 Arpin機能の喪失は、突起周波数（所定の時間に突起を有する細胞の平均率）の増加をもたらします。これは、より頻繁な突起形成にまたは突起安定性の増加のいずれかによるものである可能性があります。突起寿命を測定することArpinの非存在下で、突起の時間的持続性は（ 図3C）倍になる、ことが明らかになりました。これは、突起退縮を促進するARP2 / 3阻害剤としてArpinの役割と一致して、かつArpinではなく、突起の安定性を調節することにより、突起周波数に影響を与えることを示唆しています突起開始。
図1：手順の概要は、Tgは（GSC：GFP）。胚は4細胞期（1時間後に受精）で注入されています。 28℃で5時間後、シールド（GFP +）の内ABP140-mCherryを陽性細胞を示した胚をドナー胚として選択されます。シールド細胞は、移植針内に吸い上げと宿主胚のシールドに移します。回復の0.5時間後、ホスト胚が搭載されていると落射蛍光顕微鏡（対物レンズ40倍）で画像化。 HPF：時間は受精を投稿してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：Transplantati皿や個々のウェルとイメージングチャンバー。（A）移植皿に。 （B）細胞移植皿用モールド。 （C）ホームメイドの撮像チャンバー。 （D）自家製撮像チャンバーの模式図。スケールバー= 1 cmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：細胞動力学解析の結果から突出角度測定の（A）スキーム。 （B）細胞突起の方向と周波数解析。 SIN1モリブデン（Mo-SIN1）の非存在下では、細胞は、より少ない突出部を放出し、残りの凸部がランダムに配向しています。この表現型は、GTPアーゼRac1のモリブデン（Mo-罪の構成的に活性な形態の発現によって救出することができます1 + CA-Rac1は）。デュモルティエとDavid、2015年5突起寿命の。（C）の分析から変更されました。 Arpinモリブデン（Mo-Arpin）の非存在下では、突起頻度が増加します。これは、突起寿命の増加によるものです。モルホリノに鈍感arpin RNAを再導入することは、このハイパー突出表現型を復元します。ダンら変更され、2013年4。スケールバー=10μmです。 ：前方; P：後方、L：左、R：右この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
映画1：Rac1を介した細胞突起のSIN1コントロールの形成、（右クリックしてダウンロード）。を注射移植脊索前板前駆細胞、ABP140-mCherrry RNAおよびRac1のの構成型の制御モルホリノ、またはSIN1のモルホリノ、またはSIN1モルホリノおよびRNAを。突起周波数及び配向は、これらの画像上で測定しました。
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Discussion
このプロトコルは、ライブイメージングと細胞移植を使用してキメラ胚の生成を組み合わせることにより、 インビボでの細胞遊走における候補遺伝子の役割を研究するための簡単な方法を提示します。
モザイク胚の作成
細胞のダイナミクスを研究することは、細胞質拡張を分析するために、その輪郭の可視化が必要となります。良好な視覚的なコントラストを提供し、環境 - または異なって標識された - これは、そうでなければ、非標識で単離された細胞を標識することによって達成することができます。
確率的に胚における細胞の一部を標識する簡単な方法は、1細胞期16でプラスミドDNAを注入することです。注入されたプラスミドは、ランダムかつ不均等に細胞分裂中の細胞に分離される凝集体を形成します。これは、セルのランダムなサブセットにおけるプラスミドの発現をもたらし、従ってMOを生成するために非常に速く、簡単で非侵襲的方法を表しますSAIC胚。しかし、注入されたプラスミドを発現する細胞は、クラスターを形成する傾向があり、将来の脊索前板に少数の単離された発現する細胞を含む胚を発見する確率は極めて低いです。さらに、プラスミドDNAの使用は、注入された構築物の発現レベルの非常に限られた制御を提供しています。プラスミドDNA注入よりも技術的に難しいが、細胞移植によるキメラ胚の作成は、多くの利点を提供しています：移植された細胞の数の制御を、構築物（RNA注入）の発現レベルの制御、および最後のではなく、少なくとも、細胞移植は、細胞が機能構築物の損失または利得を含んで移植されたモザイク胚を作成することによって、細胞自律的な効果のためにテストすることができます。逆に、移植はまた、修飾された胚に野生型細胞を移植することにより、環境の非自律的な役割を評価するために使用することができます。これは、テストのために特に関心のものとすることができます例えば、細胞遊走の分析に特に関連する細胞外マトリックス成分の機能。
細胞移植のための詳細なプロトコールは、すでに10に記載されています。このプロトコルに比べて、私たちは私たちの手順2つの主要な相違点を議論したいと思います。
第1の相違点は、ドナー胚注入の段階に関連しています。我々の経験によると、蛍光タンパク質のRNAと1細胞期に注入した胚が原因細胞内のRNAの不完全な拡散のために、すべてのセルに均一に蛍光タンパク質を発現しません。 4つのセルのいずれかで、4細胞期でのドナー胚の注入は、蛍光タンパク質のRNAを同時注入トレーサブルではない他のRNAとしているときに特に関心のある細胞の均質なクローンを、取得することができます。
第二の主な違いは、transplantat中の代わりに油の空気の使用でありますイオンシリンジ。空気で満たされたシステムの主な欠点は、空気の弾性に起因する慣性力です。オイルは逆に、非圧縮性であること、吸引圧力の良好な制御を提供しています。しかし、少しのトレーニングで、針の薄い、テーパ部に空気と胚の媒体との間のインターフェースを維持することにより、空気充填システムと吸引圧力の制御は、シールド段階で細胞を移植するのに十分です。細胞はより小さく、より粘着性になるように後の段階のために、吸入空気が充填された設定を用いて達成することができない非常に正確に制御する必要があり、高圧を必要とします。セットアップが任意の気泡なしでオイルを充填システムとして、油の代わりに空気を容易に使用することは難しいです。また、油と移植針を充填避けます。これは、移植針を再利用することを可能にし、従って慎重に調製します。私たちは、鋭いエッジがなく、正確な直径の針がsucceの鍵であることを感じますssful移植。この移植ステップは明らかに簡単に実行される前に練習が必要プロトコル、における重要なステップの1つです。
私たちは、移植針内で一意のセルを描画するために、移植前に、細胞を解離することからなる単一の細胞を移植するための具体的な手順を、また提案しています。これは一過性の細胞解離は、自分のアイデンティティおよび/または動作を変更しないことを意味します。脊索前板前駆細胞のために、我々は遺伝的に細胞のアイデンティティを課す、と慎重にこれらの細胞は非解離のもののように振る舞うことをチェックしています。しかし、我々は正式に解離および/または遺伝的誘導が細胞内で見過ごさ修正を誘導することを除外することはできません。それらを解離することなく、単一の細胞を移植することは可能です。細胞は、移植針に慎重に策定されるべきです。しかし、少なくとも我々の手で、成功率は非常に低く、いずれか2つ以上のセルが旧姓になるためDLE、または策定し、針で死ぬか、一度移植された細胞ばさみが原因。
高速共焦点イメージング対落射蛍光
モザイク胚を作成するために、細胞移植の使用は、他の標識された細胞から分離された単離された細胞を標識を可能にします。プロトコルで提案され、この文脈では、細胞形態及び動態の優れたイメージングは、標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて達成することができます。これは、比較的広範囲の装置とより高価な共焦点イメージングシステムへの低コストの代替であることの明らかな利点を有します。
正確な細胞内局在のために、共焦点画像は、特定の軸方向の解像度で、解像度を改善するために使用することができます。まだ十分な時間分解能を得るには、高速共焦点イメージングを使用する必要があります。私たちの経験から、スピニングディスク顕微鏡は、解像度、スピードと光毒性の間の妥協点を提供します。高速走査型共焦点マイク（共振走査型顕微鏡のような）roscopesにも良いオプションですが、あまり頻繁で、より高価。
細胞骨格のラベリング
アクチンフィラメントとそのダイナミクスの良好な標識は、アクチンベースの細胞移動のメカニズムを研究することが重要です。膜に結合した蛍光マーカーは、細胞の輪郭を分析するほうが効率的ですが、アクチン標識が細胞突起のより良い可視化を可能にします。 3標識された細胞が接触し得る場合に特に、拡張の輪郭と混同を受けることができ、隣接細胞の膜のように2つの隣接するセルの間に位置する細胞質拡張を識別することは非常に困難です。アクチンフィラメントをラベリングすることは、我々が注目しているアクチンベースの細胞突起の明確な検出を可能にします。細胞の形態は、定量化されることになっていた場合、膜の標識が好ましいであろう。別のオプションは、いずれかのトランスジェニックのLi 3色画像（いずれかを使用して、両方の標識を使用することですね、アクチンおよび膜のための1のための1つ）、または膜を標識GFPこともできます。トランスジェニック系統において、GFPは、細胞質であり、グースコイド-GFP陽性細胞は、このように膜がGFP標識であっても、識別することができます。
過去数年にわたり、プローブの数は、生試料中のアクチンを標識するために使用されています。最初のものは、アクチンモノマーに直接融合しました。これらは、2つの主要な欠点を提示しました。まず、彼らはすべてのアクチンを標識し、具体的にアクチンを重合しません。第二に、彼らはしばしば毒性でした。現在使用されているプローブは、蛍光レポーターに融合した繊維状アクチン結合ドメインです。このプロトコルでは、我々は現在、繊維状アクチンのために最も頻繁に使用されるマーカーであり、すべての繊維状アクチンにラベルを付け、ABP140 17（酵母アクチン結合タンパク質140のアクチン結合ドメイン）を使用しました。 （相同ドメインカルポニン）ユートロフィン18はまた、繊維状アクチンを標識するが、唯一の安定したフィラメントを標識するために表示されます。この差は、IDENために使用されていますtifyダイナミックアクチンフィラメント、ものはABP140によって標識していないユートロフィン19として。
最近ではABP140とユートロフィンが長い式20以上、特に毒性作用を持つことができることをフライに報告されています。我々はABP140標識細胞内の任意の移行欠陥を気づいていないにもかかわらず、我々はABP140発現は、内因性アクチンダイナミクスを混乱させる可能性があることは否定できません。繊維状アクチンのための第3のプローブは、最近21を報告しました。 F-tractin（ラットイノシトール三リン酸3-キナーゼからのアクチン結合ドメイン）は、毒性作用20,22を示さないであろう、繊維状アクチンの忠実なレポーターとして記載されています。我々の知る限りでは、F-tractinの使用はまだゼブラフィッシュで報告されていません。
アクチンに加えて、多くの他の細胞成分は、細胞遊走の我々の理解を改善するために標識することができます。これは、ミオシン、微小管、中心体、ならびにknのような他の細胞骨格の構成要素を含んでいます自身の細胞遊走の調節因子（低分子量GTPaseのRho、RacのとCdc42は、PIP3のための蛍光プローブの活性化形態...）または細胞接着に関与するタンパク質（インテグリン、カドヘリン...）。
全体として、このプロトコルは、 インビボで細胞遊走を制御する際に候補遺伝子の関与を試験するための迅速かつ容易なシステムを提案するために前述のツールおよび技法の数を再編成します。我々は、それが向け集団移住の興味深いモデルであるとして将来の脊索前板の移行を使用して、ためにそれを標識する利用可能なトランスジェニック系統の。しかし、同様のプロトコルが、開発中に発生する他の移行イベントを分析するために適合させることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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