Introduction
В многоклеточных организмах, миграция клеток имеет важное значение как для развития эмбриона, где он обеспечивает организацию клеток в ткани и органы, а также для взрослой жизни, где он принимает участие в гомеостазе ткани (заживления ран) и иммунитета. В дополнение к этим физиологические функции, миграция клеток также участвует в различных патологических ситуациях, в том числе, в частности, раковых метастаз.
Миграция клеток была проанализирована в пробирке в течение многих десятилетий, обеспечивая общее понимание молекулярных механизмов , обеспечивающих движения клеток на плоских поверхностях. В естественных условиях , однако, клетки сталкиваются с более сложной среде. Это явно появились в последние годы, что миграция в организме может влиять внешние сигналы, такие как внеклеточный матрикс, соседние клетки или секретируемые хемокинов миграцию направляющих, и что механизмы, движущие миграции клеток может отличаться в зависимости от того, что было описано <EM> в пробирке 1,2. Механизмы , обеспечивающие в миграции естественных клеток уделялось меньше внимания до сих пор, в основном , из-за повышенной технической сложности, по сравнению с исследованиями в лабораторных условиях . В естественных условиях анализа миграции клеток , в частности , требует прямого оптического доступа к мигрирующие клетки, методы , чтобы маркировать уникальные клетки чтобы видеть их динамику и морфологию, а также усиление или потеря функции подходит для проверки роли генов-кандидатов. До сих пор лишь несколько модельных систем , несущие эти характеристики были использованы для рассекают в естественных условиях миграции клеток 3.
Недавно мы использовали миграцию перспективной прехордальной пластины в ранних эмбрионов данио рерио в качестве новой системы удобная модель для оценки функции генов - кандидатов в контроле миграции клеток естественных условиях 4,5. Перспективное прехордальная пластины (также известный как передний mesendoderm) представляет собой группу клеток, образующих в начале Gastrulation на спинной стороне зародыша. Во время гаструляции эта группа коллективно мигрирует к анимальной эмбриона 6-8, чтобы сформировать прехордальную пластину, mesendodermal утолщение, кпереди от хорды, и лежащие в основе нервной пластинки. Передняя часть прехордальной пластины будет приводить к инкубационной железы, в то время как его задняя часть , вероятно , способствует головы мезодермы 9. Благодаря внешнему развитию и оптической прозрачности рыбы эмбриона, миграция клеток может быть непосредственно и легко наблюдать в этой структуре.
Клеточная трансплантация является очень мощным методом , который позволяет быстро и легко создавать мозаики эмбрионов 10. Выражая флуоресцентные маркеры цитоскелета в трансплантированных клеток приводит в классификации выделенных клеток, морфологии и динамика которого можно легко наблюдать. В сочетании с потерей или усилением функции подходов позволяет анализировать клеточных автономных функций банкиdidate ген.
Представленный протокол описывает , как мы оценивали функцию компонента SIN1 TORC2 в контроле клеточной миграции и актина динамики в естественных условиях 5. Но, как уже упоминалось в результатах и дальнейшего обсуждения, он может быть использован для анализа потенциального импликации любого гена - кандидата в контроле миграции клеток в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: На рисунке 1 представлен контур протокола.
1. Подготовка иглы для инъекций и трансплантологии
Примечание: Иглы могут быть получены в любое время и хранится. Держите их в чашку Петри, на полосе пластилина. Печать блюдо с парафином для защиты от пыли.
- Для инъекционных игл, тянуть стеклянный капилляр (наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,58 мм, без нити (см список материалов)) с микропипетки съемник (список материалов). Предпочитают короткие и тонкие иглы (коническую часть около 5 мм), поскольку они являются более эффективными для пирсинга хориона.
Примечание: инъекционные иглы являются одноразовым. - Игла для клеточной трансплантации
- Вытяните стеклянный капилляр (наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,78 мм, без нити (см список материалов)) с микропипетки съемник.
- Uпоют microforge (список материалов), разрезать кончик иглы в точке, где внутренний диаметр 35 мкм (чуть больше, чем диаметр клеток для трансплантации).
- Скос разрез оконечность капилляра с микромельница (список материалов) с углом 45 °.
- При желании, тянуть зубец на конце иглы, используя microforge. Для этого прикоснуться к горячей нити с кончиком скоса и быстро вытащить его, создавая зубец, который может помочь проникнуть в зародыш.
- Установите иглу на держателе иглы, прикрепленной к шприцу. С помощью шприца, промыть внутреннюю поверхность иглы три раза с 2% фтористоводородной кислотой с целью устранения остатков стекла, а затем промыть три раза ацетоном.
Внимание: плавиковой кислоты является токсичным, манипулировать под капотом, в перчатках.
Примечание: Иглы трансплантации клеток может быть использована несколько раз.
2. ПодготовкаПосуда для инъекций и клеточной трансплантологии
- Тепло 50 мл эмбрионом среды 11 , содержащего 0,5 г агарозы в микроволновой печи в течение 1 мин при полной мощности , чтобы получить 1% агарозы в среде эмбриона. Охлаждают в агарозном геле, приблизительно 60 ° С и залить 50 мл в 90 мм чашки Петри. Поместите на поверхности геля специально разработанной формы (список материалов), либо с линиями для инжекционного блюдо или с колодцами для клеточной трансплантационной Петри.
- Обратите внимание на поплавок плесени на агарозы, если агарозы не слишком жарко. После того , как гель агарозы установлен, удалить плесень с пинцетом (фиг.2А - B).
Примечание: блюда можно хранить при температуре 4 ° С, до нескольких недель. Храните их в закрытой влажной коробке, чтобы избежать высыхания.
- Обратите внимание на поплавок плесени на агарозы, если агарозы не слишком жарко. После того , как гель агарозы установлен, удалить плесень с пинцетом (фиг.2А - B).
- Поместите блюдо в 28 ° C инкубатор 30 мин перед использованием.
3. Сбор эмбрионы и инъекций
- Инъекции Приготовление раствора
Примечание: актин-связывающий домендрожжевой актин-связывающего белка 140 (АВР-140), такие как Lifeact, связанный с mCherry (называемый ABP140-mCherry) используется для визуализации полимеризованный актин внутри клетки, для того, чтобы проанализировать протрузии активность. Добавить еще одно соединение , чтобы проверить функцию кандидата гена (например , мРНК доминирующего отрицательного или конститутивно активной конструкции, или морфолино олигонуклеотиды). Для оценки функции SIN1 , как описано в результатах (рис 3), которые мы использовали морфолино олигонуклеотиды. В качестве контроля использовали морфолино , идентичный SIN1 морфолино , но в течение 5 нуклеотидов , распределенных по последовательности таким образом , чтобы этот элемент управления морфолино не соответствует РНК - мишени.- Оттепель SIN1 и Morpholinos управления 5-рассогласования (2 мМ исходные растворы) и ABP140-mCherry мРНК на льду. Добавьте 375 нг мРНК (75 нг / мкл конечный) и 0,75 мкл либо SIN1 или 5-рассогласования управления морфолино (0,3 мМ конечная) в Danieau буфере (58 мМ NaCl, 0,7 мМKCl, 0,4 мМ MgSO 4, 0,6 мМ Са (NO 3) 2, 5,0 мМ HEPES , рН 7,6), чтобы достичь общего объема 5 мкл.
- Эмбрион Коллекция
Примечание: для этого Экспериментальная установка обоих доноров и принимающих эмбрионы являются трансгенными, выражающая GFP под контролем goosecoid (РКГ) промотора для того , чтобы визуализировать предполагаемую прехордальную пластину 11.- Соберите Tg (GSC: GFP) яйца. Поместите около 80 яиц в 90 мм чашке Петри заполнены эмбрион средой и инкубировать при 28 ° С.
- Вводят доноров зародыши
- Под стереомикроскопа, осторожно выдавить накопившиеся эмбрионов с пинцетом в линиях инжекционного Петри заполнены эмбрион среде. Использование щипцов, ориентировать эмбрионов с клетками к вершине. Поместите инъекции блюдо в инкубаторе при температуре 28 ° C, пока зародыши не достигли стадии 4-клеток (1 час после оплодотворения).
- Загрузите инъекционной иглой с 2 мклраствор для инъекций. Вставьте иглу в держатель иглы (см перечень материалов) , который помещается в микро-манипулятором (см перечень материалов) и связанного с политетрафторэтилена (PTFE) трубки (список материалов) к воздушному трансжекторного (см перечень материалов ).
- Откройте капилляр, осторожно касаясь кончиком с тонким пинцетом. При необходимости отрежьте капилляр открытую зажимая его конечность.
- Введите один из четырех клеток с иглой и вводят раствор внутри клетки, чтобы заполнить 70% от объема ячейки (2 NL). Вводят 30 эмбрионов.
Примечание: Получение иглы в клетке может быть затруднено, так как плазма мембрана мягкая. Прицеливание на стыке между клеткой и желтка облегчает проникновение иглы. - Поместите эмбрионы в 28 ° C инкубатор, пока они не достигли стадии сферы (4 часа после оплодотворения).
4. Подготовка эмбрионы для Cell трансплантатион
- Приготовьте 20 мл среды эмбриона с 200 мкл пенициллин / стрептомицин (список материалов) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation эмбрионов на стадии сферы (4 ч после оплодотворения)
Примечание: Dechorionated эмбрионы очень хрупкие и взрывается при контакте с воздухом или пластика. Таким образом, они должны быть помещены в агарозном покрытием блюд, и переносили с пожарными-полированного стекла Пастера пипеток.- С помощью пластмассовой пипетки Пастера передачи хост эмбрионов, собранных на этапе 3.2 и эмбрионов доноров впрыскивают на шаге 3.3 на два 35 мм чашки Петри с покрытием из 1% агарозы в среде эмбриона и наполненными Pen / Strep EM. Держите хозяев эмбрионов и эмбрионов доноров в виде двух отдельных блюд.
- Вручную извлечь из эмбрионов их хорионов с мелкими пинцетом (см список материалов).
- Поместите эмбрионов в 28 ° C инкубаторе, пока они не достигли стадии щита (6 часов после оплодотворения).
5. клеточной трансплантации
- Устройте эмбрионы для трансплантации клеток.
- Под флуоресцентным стереомикроскопа, выберите эмбрионы донорские выражения ABP140-mCherry (красный) внутри щита (зеленого цвета).
- Использование огневой полировкой пипетки Пастера, передача эмбрионов в лунки трансплантации клеток Петри заполнены Pen / Strep EM. Поместите хост эмбрионов в одном ряду и эмбрионов доноров в соседнем ряду.
- Использование ресничку, тщательно ориентируют эмбрионов с щитом.
Примечание: положение щита может быть оценена с помощью экспрессии GFP или анатомически.
- Трансплантация настройки системы.
Примечание: Система трансплантации состоит из держателя иглы (см перечень материалов) , связанных с тефлоновой трубкой (список материалов) и разъем для подключения трубки (список материалов) в Гамильтон шприц , снабженный микро-диск (см список материалов). Держатель иглымонтируется на 3-ходовым микроманипулятором (см список материалов).- Используя держатель иглы, присоединенную к шприцу, промойте иглу для трансплантации клеток с 70% -ным этанолом. Высушите подлизываться воздух в иглу. Не сушить продуванием, так как это может привести к пыли застрять в суженной части иглы.
- Вставьте иглу в держателе иглы, соединенного с шприца Гамильтона, с фаской вверх.
- Щит-к-щит Клеточная трансплантация
- Введите щит донора эмбриона с трансплантационной иглы и составлять около 10-20 клеток, меченных ABP140-mCherry. Тщательно избегать рисования желток.
- Пересадка клеток в щит эмбриона хозяина. Повторяйте, пока все эмбрионы хозяева не были пересажены.
- Удалите все поврежденные эмбрионы с огнем полированные пипетку Пастера. Поместите пересаженных эмбрионов в инкубаторе при температуре 28 ° С, и пусть они восстановить в течение примерно 30 мин.
- С помощью иглыдержатель прикреплен к шприцу, прополоскать перевивки иглу с водой и поместить его обратно в чашку Петри на диапазон формовочной глины. Печать блюдо с парафином.
6. (Необязательно) Single Cell Трансплантация
Примечание: В эмбрионе клетки прилипают друг к другу, так что трудно провести только одну клетку в трансплантационной иглы. Мы разработали модифицированный протокол легко трансплантации одиночных клеток прехордальная пластины предшественников. Идея заключается в том, чтобы отделить клетки перед трансплантацией. Поскольку изолированные прехордальная клетки-предшественники пластины, как правило, теряют свою идентичность, мы генетически налагают их предполагаемый прехордальная идентичность пластины, путем активации узловой сигнального пути, в отсутствие фактора транскрипции Sox32. Мы проверили , что эти индуцированные клетки ведут себя как эндогенных прехордальная клеток - предшественников пластины 8. Ниже приведены конкретные шаги для выполнения одиночных трансплантаций клеток. Cell dissociaции достигается за счет размещения эмбрионов в бескальциевой Ringer 11, рассекает эксплантате и механически перемешивая.
- На этапе 2.1, подготовить трансплантацию блюдо с 1% агарозы в бескальциевой Ringer вместо Эмбрион среды.
- На этапе 3.1, в дополнение к ABP140-mCherry РНК и SIN1 морфолино, добавьте 3 нг РНК , кодирующей активную форму Узловой рецептора Taram-A (0,6 нг / мкл конечной) и 1,25 мкл морфолино против sox32 (основной раствор на 2 мМ, следовательно, 0,5 мМ конечная).
- После шага 4, передача трех выбранных эмбрионов донора в чашке для клеточной трансплантации, наполненную Pen / Strep бескальциевой Ringer с использованием огневой полировкой пипетки Пастера. С тонкой пинцетом, рассекают эксплантате, содержащий клетки (инъекционные ABP140-mCherry меченые клетки). Быстро отбросить остальную часть эмбрионов.
- С ресниц, осторожно перемешать эксплантов, пока клетки не диссоциируют.
- Оформи одной изолированной клетки в трансплантационной иглыи пересадить его в щит хозяина эмбриона.
- Использование огневой полировкой пипетки Пастера, перенесите эмбрионы в чашке агарозном покрытием, заполненного Pen / Strep EM. Поместите эмбрионов в инкубаторе при 28 ° С в течение 30 мин.
7. Эмбрион Монтаж
- Камерный обработки изображений
- Способ 1: использовать камеру формирования изображения , состоящего из пластиковой горкой (75 * 25 * 0,5 мм) пронзил с 4 отверстиями (диаметр 5,5 мм), с 3 мм высокими краями , с одной стороны (рис 2C - D). Клей покровного стекла на задней стороне, с цианакриловый клей (супер клей).
Примечание: В конце эксперимента, поместите камеру в воду на одну ночь, чтобы удалить покровное и избавиться от остатков клея с наждачной бумагой. - Способ 2: использование 35 мм Маттек со стеклянным дном блюда (список материалов) с 10 мм отверстие диаметром .
- Способ 1: использовать камеру формирования изображения , состоящего из пластиковой горкой (75 * 25 * 0,5 мм) пронзил с 4 отверстиями (диаметр 5,5 мм), с 3 мм высокими краями , с одной стороны (рис 2C - D). Клей покровного стекла на задней стороне, с цианакриловый клей (супер клей).
- Эмбрион Монтажное
- Заполните стеклянную пробирку с 1 мл горячего 0,2% агарозы в среде эмбриона.Хранить ее при температуре 42 ° C в плавки- блоке.
- Под флуоресцентным стереомикроскопа, выберите эмбрион , в котором Red пересаженные клетки являются частью предполагаемой прехордальной пластины с надписью зеленым цветом (т.е. красные пересаженные клетки находятся в пределах зеленой предполагаемой прехордальной пластины, и начали мигрировать к анимальной).
- Перенос выбранного эмбриона в раствор агарозы с огневой полировкой пипетки Пастера. Откажитесь избыток эмбриона среды из пипетки. Нарисуйте эмбрион в пипетку с агарозы, и перенести эмбрион в камере формирования изображения, осаждения капли агарозы. Перед агарозном устанавливается, сориентировать эмбриона с ресницах. Поместите перспективный прехордальную пластину вверх для получения изображения с использованием вертикального микроскопа, или на стеклянным дном для визуализации с помощью инвертированного микроскопа. Подождите, пока агароза не установлен (около 1 мин, в зависимости от комнатной температуры) перед установкой другого эмбриона в следующую лунку камеры.
Примечание: тя изображенияmber, содержащий 4 скважины позволяет устанавливать до 4-х эмбрионов. - Когда агарозном установлено, заполнить камеру с ручкой / Strep EM, чтобы избежать высыхания.
8. Живая съемка
- Используйте 40X воды погружения на большие расстояния объективом. Используйте соответствующие наборы фильтров для изображений GFP и mCherry (для GFP: возбуждения BP 470/40, светоделителе FT 510 и эмиссии BP 540/50; для mCherry: возбуждения BP 578/21, светоделителе FT 596 и LP эмиссии 641 / 75). Регулировка длительности экспозиции с целью оптимизации динамики изображения.
- Для изображения всех ячеек в пластине, приобретают Z-стеки, начиная несколько микрометров выше предполагаемой прехордальной пластины (в эктодермы) и заканчивая несколько микрометров ниже предполагаемой прехордальной пластины (в желтке). Используйте Z-шаг 2 мкм. Для оптимизации скорости сбора данных, переключение цветов между Z-стеки, а не между кадрами.
Примечание: Это может привести к небольшим различиям между зеленым и красным изображений, но это не проблема, так как нет точного сотрудничества-локализацией между зелеными и красными сигналами требуется. Для дальнейшего сокращения времени формирования изображений и воздействия света, зеленый может быть приобретен только один раз каждые 5 очков времени, которое достаточно для идентификации прехордальная клеток-предшественников пластины. - С помощью таких параметров, изображение до 4-х эмбрионов в течение двухминутного интервала времени, который необходимо проанализировать частоту протрузии и ориентацию. Для анализа жизни протрузии, сократить временной интервал до 30 секунд, чтобы получить более высокое разрешение по времени. Изображение от 60% эпиболии до 80% эпиболии.
9. Анализ динамики клеток
- Загрузка 4D изображений в ImageJ
Примечание: В зависимости от используемого программного обеспечения для сбора, изображения сохраняются в различных форматах (один файл на изображения, один файл на г-стек, один файл для всего эксперимента). Некоторые плагины ImageJ доступны в Интернете, чтобы открыть 4D стеки. Наши данные хранятся в виде одного файла на г-стека. Поскольку набор данных может быть большим, это может быть удобно открывать только его часть (некоторые тиме точки, или подразделу Z-стека, или 8-битные изображения преобразуются ...). Мы используем на заказ ImageJ плагин, чтобы сделать так, что мы были бы рады, чтобы распределить по запросу. - Анализ ориентации и частоты клеточных выпячиваний
- Используйте GFP изображения для определения основного направления перспективного прехордальной миграции пластины. Возьмите это в качестве эталона для измерения угловых ячеек выступающих частей. Поворотом стек, так что эта ссылка направление параллельно одной стороне изображения.
- Выполните одну ячейку. Выбор инструмента угол. Для каждого кадра и каждого выступа, с помощью инструмента угол для измерения угла между выступом и опорным направлением (фиг.3А). С помощью команды Analyze / Measure для хранения значения (или нажмите M на клавиатуре). Сохранить результаты в виде текстового файла. Повторите следующую ячейку.
- Импорт данных в распределении R и угол участка как гистограмм. С помощью теста Колмогорова-Смирнова (ks.test в R) для сравнения различных условий.
Примечание: Инструмент угол обеспечивает значения в диапазоне между 0 ° и 180 °, что позволяет использовать классические статистические тесты и не круговых испытаний. - С помощью этого набора данных, вычислить частоту излучения, как количество выступов на клетку в минуту. Использование Student T-тест (t.test в R) для сравнения различных условий.
- Анализ клеточного Выступы Lifetime
- Для каждой ячейки и каждого выступа, мера длительности протрузия (количество кадров, в течение которых протрузия присутствует х временной интервал между кадрами).
- Импорт данных в R. Использование Стьюдента (t.test в R) для сравнения различных условий.
Примечание: Другие функции миграции может быть интересно проанализировать, с тем чтобы охарактеризовать клеточную миграцию. К ним относятся клеточные дорожки, для скорости, направления и измерения постоянства или морфологии клеток. Некоторые коммерческие программные приложения доступны для измерения этих функций, но большое количество программного обеспечения приме с открытым исходным кодомкатионы и плагинов ImageJ также доступны, как, например , ADAPT для анализа морфодинамики 12, DiPer смотреть на клеточных траекторий и направленного настойчивостью 13, CellTrack отслеживать границы ячеек во время миграции 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленная методика была использована для анализа роли SIN1, одного из основных компонентов Тор комплекс 2 (TORC2), в контроле миграции естественных клеток. Применение трансплантации клеток позволяет маркировать изолированных клеток и анализа клеточных автономных эффектов. Movie S1 показывает миграцию трансплантированных клеток-предшественников прехордальная пластины. Актина маркировка с ABP140 позволяет легко визуализировать актин-богатых отростках цитоплазмы. Мы измерили их частоту и ориентацию. Клетки дикого типа производят частые большие цитоплазматические выступы ориентированы в направлении полюса животного, то есть в направлении миграции (рис 3B). Потеря функции SIN1 приводит к резкому уменьшению количества выступов и рандомизации оставшихся, демонстрирует важность SIN1 в управлении образования выступу актин богатых. Интересно, что этот фенотип может быть спасен еXpression из конститутивно активной формы Rac1 15, сильно предполагая , что TORC2 контролирует динамику актина и формирование клеток через Rac1 выступу (рис 3B).
Представленная методика также была использована для характеристики роли Arpin, недавно идентифицированного ингибитора комплекса Arp2 / 3, на динамику клеток 4. Потеря функции Arpin приводит к увеличению частоты выступу (средней скорости клеток, несущих выпячивание в данный момент времени). Это может быть обусловлено либо к образованию более частой выступу или к увеличению стабильности выступу. Измерение жизни выступу показало , что, при отсутствии Arpin, протрузии временное сохранение удваивается (рис 3C). Это согласуется с ролью Arpin в качестве ингибитора Arp2 / 3, что облегчило бы выступу втягивание, и предполагает, что Arpin влияет на частоту выступания путем модуляции стабильности выступу, а неВыступ инициации.
Рисунок 1:. Общая структура процедуры Tg (GSC: GFP) эмбрионы вводят на 4-клеточной стадии (1 ч после оплодотворения). Через 5 часов при 28 ° С, эмбрионы, показывая ABP140-mCherry позитивных клеток внутри щита (GFP +) выбраны в качестве эмбрионов-доноров. Щит клетки составлены в трансплантационной иглы и переносили в щит хозяина эмбриона. Через 0,5 ч восстановления, принимающих эмбрионы установлены и отображены с эпифлуоресцентной микроскопом (40х объективной). HPF:. часов после оплодотворения Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Transplantatiна блюдо и обработки изображений камеры. (A) трансплантологии блюдо с отдельным скважинам. (B) Форма для трансплантации клеток блюдо. (C) Самодельные изображения камеры. (D) Схематическое изображение самодельного изображения камеры. Шкала бар = 1 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Результаты Cell Dynamics Analysis (A) Схема измерения угла выпячивание. (В) Анализ клеточной ориентации протрузии и частоты. При отсутствии SIN1 (Mo-SIN1), клетки выбрасывают меньше выступающих частей, а остальные выступы ориентированы случайным образом. Этот фенотип может быть спасен путем экспрессии конститутивно активной формы GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Модифицированный из Дюмортье и Давида, 2015 5. (C) Анализ жизни протрузии. При отсутствии Arpin (Mo-Arpin), увеличивается частота выпячивание. Это связано с увеличением срока службы выступу. Повторное введение в Arpin РНК нечувствительным к морфолино восстанавливает этот гипер протрузии фенотип. Измененный Данг и др., 2013 4. Шкала бар = 10 мкм. A: Передней; P: Задней, L: левый, R:. Правый Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1: SIN1 контролирует формирование клеточных выступов, через Rac1 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Трансплантированных прехордальная клетки - предшественники пластины, инъецированныеABP140-mCherrry РНК и управления морфолино или SIN1 морфолино или SIN1 морфолино и РНК для конституциональной форме Rac1. Частота Выступ и ориентации были измерены на этих изображениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой простой способ для изучения роли гена - кандидата в миграции клеток в живом организме , путем объединения создания химерных эмбрионов с использованием клеточной трансплантации с живого изображения.
Создание мозаики эмбрионов
Изучение динамики ячейки требует визуализации ее контура для анализа цитоплазматические расширения. Это может быть достигнуто путем маркировки изолированных клеток в противном случае немеченого - или по-разному меченых - окружающую среду, таким образом, предлагая хороший визуальный контраст.
Самый простой способ стохастически маркировать часть клеток в эмбрионе, чтобы придать plasmidic ДНК на стадии 16 1-клеток. Инъецированные плазмиды образуют агрегаты, которые случайным образом и неодинаково в клетках сегрегированных во время клеточного деления. Это приводит к экспрессии плазмиды в случайном подмножество клеток, и, таким образом, представляет собой очень быстрый, простой и неинвазивный метод для генерации моSAIC эмбрионов. Тем не менее, клетки, экспрессирующие инъецированные плазмиды, как правило, образуют кластеры, и вероятность обнаружения эмбрионов, содержащих несколько изолированных клеток, экспрессирующих в перспективном прехордальной пластинки является довольно низким. Кроме того, использование plasmidic ДНК предлагает очень ограниченный контроль над уровнем экспрессии вводимой конструкции. Создание химерных эмбрионов трансплантацией клеток, хотя технически более сложным, чем инъекции plasmidic ДНК, предлагает ряд преимуществ: контроль количества трансплантированных клеток, контроль уровня экспрессии конструкций (введение РНК), и не в последнюю очередь , клеточные трансплантаций позволяют испытать для клеточных автономных эффектов, путем создания мозаики эмбрионов, в которых пересаженные клетки содержат потерю или усиление функциональных конструкций. С другой стороны, трансплантаций также может быть использован для оценки неавтономную роли окружающей среды путем пересадки клеток дикого типа в эмбрионы, которые были изменены. Это может представлять особый интерес для тестированиянапример, функция компонентов внеклеточного матрикса, которые имеют особое значение для миграции клеток анализа.
Подробный протокол для трансплантации клеток уже описана 10. По сравнению с этим протоколом, мы хотели бы обсудить две основные различия в нашей процедуре.
Первое различие связано со стадией эмбрионов-доноров инъекции. По нашему опыту, эмбрионы вводят на стадии 1-клеток с РНК флуоресцентного белка не экспрессируют гомогенно флуоресцентного белка во всех клетках, из-за неполной диффузии РНК в клетке. Инъекция эмбрионов доноров на 4-клеточной стадии в одной из четырех ячеек позволяет получить однородный клон клеток, который представляет особый интерес, когда РНК флуоресцентного белка совместно вводят с другими РНК, которые не отслеживаться.
Вторым главным отличием является использование воздуха вместо масла в трансплантатионный шприц. Основной недостаток системы заполненной воздухом инерция вследствие упругости воздуха. Масло, наоборот, будучи несжимаемым, предлагает хороший контроль всасывания и давления. Тем не менее, с небольшим количеством обучения, и за счет поддержания взаимодействия между воздухом и эмбрион среды в тонкой конической части иглы, контроль давления всасывания и с системой заполненных воздухом достаточно для пересадки клеток на стадии щита. Для более поздних стадиях, поскольку клетки становятся все меньше и более связным, всасывающая требует высокого давления, которое должно быть очень точно контролировать, что не может быть достигнуто при установке заполненные воздухом. Используя воздух вместо масла облегчает установку, как заполнение системы маслом без воздушных пузырьков сложно. Кроме того, это позволяет избежать заполнения трансплантации иглу с маслом. Это позволяет Трансплантация иглы для повторного использования, и, следовательно, должна быть тщательно подготовлена. Мы считаем, что игла без острых краев и правильного диаметра является ключом к successful трансплантация. Этот шаг трансплантации явно является одним из важнейших шагов в протоколе, который требует практики перед тем, как легко выполнить.
Мы также предложили конкретную процедуру пересадки отдельных клеток, заключающийся в диссоциацию клеток перед трансплантацией, для того, чтобы нарисовать уникальную ячейку в трансплантационной иглы. Это означает, что переходный процесс диссоциации клеток не будет изменять свою личность и / или поведение. Для прехордальная клеток-предшественников пластины, мы генетически налагают идентичность клеток, и тщательно проверили, что эти клетки ведут себя как не-диссоциированных из них. Тем не менее, мы не можем формально исключить, что диссоциация и / или генетической индукции вызывают незаметные изменения в клетках. Пересадка отдельных клеток без их диссоциацию осуществимо. Клетки должны быть составлены тщательно в трансплантационной иглы. Тем не менее, по крайней мере, в наших руках, процент успеха довольно низок, либо потому, что больше, чем одна клетка попадает в девичествеDLE, или потому, что клеточные ножницы при рисовании и плашки в иглу или после трансплантации.
Эпифлуоресцентной по сравнению с быстрой конфокальной микроскопии
Применение трансплантации клеток для создания мозаики эмбрионов позволяет для маркировки изолированных клеток, отделенных от других меченых клеток. В этом контексте, хорошая визуализация морфологии и динамики клеток может быть достигнуто с помощью стандартного эпифлуоресцентной микроскопии, как это было предложено в протоколе. Это имеет очевидное преимущество, что относительно широкое распространение оборудования и недорогой альтернативой а к более дорогие системы конфокальной микроскопии.
Для получения точных субклеточных локализаций, конфокальной изображения могут быть использованы для улучшения разрешающей способности, в частности, осевой размер. Для того, чтобы по-прежнему получать достаточное временное разрешение, быстрая конфокальной микроскопии следует использовать. Исходя из нашего опыта, спиннинг дисковые микроскопов предлагают хороший компромисс между разрешающей способности, скорости и фото-токсичности. Быстрое сканирование конфокальной микрофонroscopes (как резонансных сканирующих микроскопов) хорошие варианты, а также, но реже и дороже.
маркировка Цитоскелет
Хорошая маркировка нитей актина и их динамика имеет решающее значение для изучения механизмов миграции актина на основе клеток. Несмотря на то, связанные с мембранами флуоресцентные маркеры являются более эффективными, анализировать контуры клеток, актин маркировка позволяет значительно лучшей визуализации клеточных выступов. В частности, если три меченые клетки получают в контакте, очень трудно идентифицировать цитоплазматический расширение, расположенное между двумя соседними клетками, как контур расширения и мембраны соседних клеток могут перепутать. Пометка актиновые филаменты позволяет однозначное обнаружение актина на основе клеточных выступов, на которых мы сосредоточили внимание. Если клеточная морфология должна была быть определена количественно, маркировочные мембрана была бы предпочтительнее. Другой вариант заключается в использовании как маркировки, либо с помощью 3-цветное изображение (один для трансгенной LiН.Е., один актина и один для мембраны), или с помощью GFP мечение мембраны. В трансгенной линии, GFP, является цитоплазматическим и goosecoid-GFP-положительных клеток, таким образом, могут быть идентифицированы, даже если мембрана GFP помечены.
За последние годы ряд зондов были использованы для обозначения актином в живых образцах. Первые из них были непосредственными слитых мономеров актина. Они были представлены два основных недостатка. Во-первых, они помечены все актин и конкретно не полимеризованный актин. Во-вторых, они часто токсичны. Датчики используются в настоящее время нитчатые актин связывающие домены, слитые с флуоресцентными репортеров. В этом протоколе, мы использовали ABP140 17 (актин - связывающий домен дрожжей актин - связывающего белка 140), который в настоящее время является наиболее часто используемым маркером для нитчатых актина и маркирует все нитчатые актин. Атрофин 18 (calponin домен гомологии) также метки волокнистый актин, но , как представляется , маркировать только устойчивые нити. Эта разница была использована для идентифы динамического актиновые филаменты, как и те , помечены ABP140 и не атрофин 19.
Недавно сообщалось , что в лету ABP140 и атрофин может оказать токсическое воздействие, в частности , более длинное выражение 20. Несмотря на то, что мы не заметили каких-либо дефектов миграции в ABP140-меченых клеток, мы не можем исключить, что экспрессия ABP140 может возмутить эндогенные динамику актина. Третий зонд для нитчатых актина Недавно сообщалось о 21. F-tractin (актин-связывающий домен из крысы инозитолтрифосфат 3-киназы) был описан как верный репортер нитевидного актина, которая не показала бы токсические эффекты 20,22. Насколько нам известно, использование F-tractin не было зарегистрировано в данио еще.
В дополнение к актина, многие другие компоненты клеток могут быть помечены, чтобы улучшить наше понимание миграции клеток. Это включает в себя другие компоненты цитоскелета, как миозин, микротрубочки, центросомами, а также кпсобственные регуляторы миграции клеток (активированные формы маленького ГТФаз Rho, Rac и Cdc42, флуоресцентных зондов для PIP3 ...) или белки, участвующие в клеточной адгезии (интегрины, кадхеринами ...).
В целом, этот протокол перегруппировывает ряд ранее описанных инструментов и методов , чтобы предложить быструю и простую систему , чтобы проверить причастность гена кандидата в контроле миграции клеток в естественных условиях. Мы использовали предполагаемую прехордальную миграцию пластины, как это интересная модель коллективной направленной миграции, а также из-за имеющихся трансгенной линии маркировки его. Тем не менее, аналогичный протокол может быть адаптирован для анализа других событий миграции, возникающие в процессе развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F.
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
