Introduction
In vielzelligen Organismen, ist die Zellmigration wesentlich sowohl für die Entwicklung des Embryos, wo sie die Organisation von Zellen in Geweben und Organen, und für das Erwachsenenleben gewährleistet, wo es Teil Gewebshomöostase (Wundheilung) und Immunität nimmt. Neben diesen physiologischen Funktionen, ist die Zellmigration in verschiedenen pathologischen Situationen beteiligt, einschließlich, insbesondere Krebsmetastasen.
Die Zellmigration ist seit Jahrzehnten in vitro untersucht, ein umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen , die Bereitstellung zu gewährleisten Zellbewegungen auf ebenen Flächen. In vivo jedoch Zellen werden durch eine komplexere Umgebung konfrontiert. Es ist deutlich in den vergangenen Jahren zeigte sich, dass die Migration innerhalb eines Organismus kann durch externe Signale, wie beispielsweise die extrazelluläre Matrix beeinflusst werden, Zellen oder sezernierte Chemokine benachbarten Migration führen, und dass die Mechanismen der Zellmigration Antriebs von variieren, was beschrieben wurde <em> in vitro 1,2. Die Mechanismen in vivo Zellmigration sichergestellt haben weniger Aufmerksamkeit bisher, vor allem wegen der erhöhten technischen Schwierigkeit, im Vergleich zu in - vitro - Untersuchungen. In vivo - Analyse der Zellmigration insbesondere migrierenden Zellen direkten optischen Zugang erfordert, Techniken einzigartige Zellen zu markieren in um ihre Dynamik und Morphologie sowie Gewinn oder Verlust der Funktion zu sehen, nähert sich die Rolle der Kandidatengene zu testen. Bisher sind nur wenige Modellsysteme diese Merkmale beherbergen wurden 3 verwendete in vivo Zellmigration zu sezieren.
Wir haben vor kurzem die Migration der prospektiven Prächordalplatte in frühen Genaktivität als neues praktisches System - Modell bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration 4,5 die Funktion der Kandidaten - Gene zu untersuchen. Prospective Prächordalplatte (auch als vordere mesendoderm bekannt) ist eine Gruppe von Zellen bei Beginn der gast bildenrulation auf der dorsalen Seite des Embryos. Während der Gastrulation wandert diese Gruppe kollektiv gegenüber dem Tier Pol des Embryos 6-8, die Prächordalplatte zu bilden, eine mesendodermal Verdickung, anterior der Chorda und die neurale Platte zugrunde liegt. Der vordere Teil der Prächordalplatte führen zur Schraffur Drüse geben, während sein hinterer Teil trägt wahrscheinlich Mesoderm 9 Kopf. Dank der externen Entwicklung und optische Klarheit des Fischembryo, Zellmigration unmittelbar werden kann und leicht in dieser Struktur beobachtet.
Zelltransplantation ist eine sehr potente Technik , die 10 für die schnelle und einfache Erstellung von Mosaik-Embryonen erlaubt. Exprimieren fluoreszierenden Marker Zytoskelett in transplantierten Zellen führt zur Markierung von isolierten Zellen kann die Morphologie und die Dynamik, die leicht beobachtet werden. dies zu einem Verlust oder Gewinn von Funktions Kombination Ansätze ermöglicht die Analyse von Zell-autonome Funktionen einer Dosetritts Gen.
Das dargestellte Protokoll beschreibt , wie wir die Funktion des TORC2 Komponente Sin1 in Steuerung der Zellmigration und Aktindynamik in vivo 5 beurteilt. Aber, wie in den Ergebnissen genannten und weiter diskutiert, könnte es verwendet werden , um die potentiellen Auswirkungen jeder Kandidatengens Migration in Steuern Zelle in vivo zu analysieren.
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Protocol
Hinweis: Die Abbildung 1 zeigt den Umriss des Protokolls.
1. Herstellung der Nadeln für die Injektion und Transplantation
Hinweis: Nadeln können jederzeit gespeichert und hergestellt werden. Halten Sie sie in einer Petrischale, auf einem Band aus Knetmasse. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm vor Staub zu schützen.
- Für Injektionsnadeln, ziehen eine Glaskapillare (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, ohne Filament (siehe Materialliste)) mit einer Mikropipette Abzieher (siehe Materialliste). Bevorzugen kurzen und dünnen Nadeln (verjüngte Teil von etwa 5 mm), da sie effizienter zum Durchdringen der Chorion sind.
Hinweis: Die Injektionsnadeln sind Einmalgebrauch. - Nadel für Zelltransplantation
- Ziehen Sie eine Glaskapillare (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser von 0,78 mm, ohne Filament (siehe Materialliste)) mit einer Mikropipette Puller.
- Usingen ein Mikroschmiede (siehe Liste der Materialien), an der Stelle der Spitze der Nadel geschnitten, wo der Innendurchmesser 35 & mgr; m (etwas mehr als der Durchmesser der Zellen transplantiert werden) ist.
- Bevel das geschnittene Ende der Kapillare mit einer microgrinder (siehe Materialliste) mit einem Winkel von 45 °.
- Gegebenenfalls einen Widerhaken am Ende der Nadel ziehen eine Mikroschmiede verwenden. Dazu drücken Sie die Hot-Filament mit der Spitze der Schräge und ziehen Sie sie schnell weg, einen Haken zu schaffen, die das Eindringen des Embryos helfen kann.
- Montieren Sie die Nadel an einem Nadelhalter an einer Spritze befestigt. Mit der Spritze, spülen Sie das Innere der Nadel dreimal mit 2% iger Flußsäure Glasreste zu beseitigen, und spülen Sie dann dreimal mit Aceton.
Achtung: Flusssäure ist giftig, zu manipulieren unter der Haube, mit Handschuhen.
Hinweis: Die Zelltransplantation Nadeln mehrmals verwendet werden kann.
2. Herstellung desGeschirr für die Injektion und Zelltransplantation
- Wärme 50 ml Embryo Medium 11 , das 0,5 g Agarose in einer Mikrowelle für 1 min bei voller Leistung 1% Agarose in Embryo - Medium zu erhalten. Kühle das Agarosegel auf etwa 60 ° C und gießt die 50 ml in einer 90 mm Petrischale. An der Oberfläche des Gels eine speziell entwickelte Form (siehe Liste des Materials), entweder mit Linien für die Injektion Schale oder mit Vertiefungen für die Zelltransplantation Gericht.
- Beachten Sie die Form Schwimmer auf der Agarose, wenn die Agarose nicht zu heiß ist. Nachdem die Agarose - Gel eingestellt ist, entfernen Sie die Form mit einer Pinzette (2A - B).
Hinweis: Gerichte können bei 4 ° C gelagert werden, bis zu ein paar Wochen. Halten Sie sie in einem geschlossenen nassen Feld, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Beachten Sie die Form Schwimmer auf der Agarose, wenn die Agarose nicht zu heiß ist. Nachdem die Agarose - Gel eingestellt ist, entfernen Sie die Form mit einer Pinzette (2A - B).
- Die Schale in einem 28 ° C Inkubator 30 Minuten vor dem Gebrauch.
3. Sammlung von Embryonen und Injection
- Injektionslösung Vorbereitung
Hinweis: Actin-Bindungsdomänedes Hefe-Actin-bindendes Protein 140 (ABP-140), wie LifeAct zu mCherry gebunden (nachstehend als ABP140-mCherry) verwendet wird polymerisierten Actin innerhalb der Zelle, um die protrusive Aktivität zu analysieren, um zu veranschaulichen. Fügen Sie eine weitere Verbindung , die die Funktion eines Kandidatengens zu testen (zB mRNA von dominant negative oder konstitutiv aktiven Konstrukt oder Morpholino - Oligonukleotide). Um die Funktionen von Sin1 beurteilen , wie in den Ergebnissen beschrieben (Figur 3), wir Morpholino - Oligonukleotide verwendet. Als Kontrolle verwendeten wir eine morpholino identisch mit dem sin1 morpholino aber für 5 Nukleotiden entlang der Sequenz verteilt , so daß diese Steuer morpholino RNA nicht das Ziel übereinstimmt.- Thaw sin1 und 5-Mismatch Kontrolle Morpholinos (2 mM Stammlösungen) und ABP140-mCherry mRNAs auf Eis. In 375 ng von mRNAs (75 ng / pl final) und 0,75 ul entweder sin1 oder 5-Mismatch Kontrolle Morpholin (0,3 mM final) in Danieau Puffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6) mit einem Gesamtvolumen von 5 & mgr; l zu erreichen.
- Besamungs
Hinweis: Für diese experimentelle Spender und Wirt Embryonen eingerichtet sind transgene Expression der GFP unter der Kontrolle des goosecoid (gsc) Promotor, um die potenzielle Prächordalplatte 11 sichtbar zu machen.- Sammeln Tg (gsc: gfp) Eier. Jeweils etwa 80 Eier in einer 90 mm Petrischale mit Embryo Medium gefüllt und Inkubation bei 28 ° C.
- Injizieren Spenderembryonen
- Unter einem Stereomikroskop, drücken Sie sanft gesammelter Embryonen mit einer Pinzette in die Leitungen eines Injektionsform mit Embryo Medium gefüllt. Mit einer Pinzette, orientieren die Embryonen mit den Zellen nach oben. Platzieren das Injektionsschale in den Inkubator bei 28 ° C, bis die Embryonen, die 4-Zellen-Stadium (1 h nach der Befruchtung) erreicht haben.
- Legen Sie eine Injektionsnadel mit 2 ulInjektionslösung. Führen Sie die Nadel in einem Nadelhalter (siehe Liste der Materialien) , die in einem Mikromanipulator angeordnet ist (Liste der Materialien sehen) und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) Schläuche (siehe Materialliste) zu einer Luft Transjector (siehe Liste der Materialien verbunden ).
- Öffnen Sie die Kapillare vorsichtig die Spitze mit einer feinen Pinzette berührt. Falls erforderlich, schneiden Sie die Kapillare offen von seinem Ende Kneifen.
- Geben Sie eine der vier Zellen mit der Nadel und die Injektion der Lösung in der Zelle, um 70% des Zellvolumens (2 nl) zu füllen. Injizieren 30 Embryonen.
Hinweis: Werden die Nadel in der Zelle kann schwierig sein, da die Plasmamembran weich ist. Ziel an der Verbindung zwischen der Zelle und dem Eigelb erleichtert Nadelpenetration. - Legen Sie die Embryonen in der 28 ° C-Inkubator, bis sie die Kugel Stufe (4 Stunden nach der Befruchtung) erreicht haben.
4. Vorbereitung der Embryonen für die Zelle TransplantatIon
- Es werden 20 ml Embryo-Medium mit 200 & mgr; l Penicillin / Streptomycin (siehe Liste der Materialien) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation der Embryonen im Bereich der Stufe (4 Stunden nach der Befruchtung)
Hinweis: dechorionated Embryonen sehr zerbrechlich sind und bei Kontakt mit Luft oder Kunststoff explodieren. Sie müssen also in Agarose-beschichteten Schalen gelegt werden, und übertragen mit feuerpolierten Pasteur-Glaspipetten.- Mit Hilfe einer Pasteurpipette aus Kunststoff, übertragen Host Embryonen im Schritt gesammelt 3.2 und Spender in Schritt 3.3 in zwei 35-mm-Petrischalen mit 1% Agarose in Embryo-Medium beschichtet injizierten Embryonen und mit Pen / Strep EM gefüllt. Halten Sie Host-Embryonen und Spenderembryonen in zwei getrennten Gerichten.
- Extrahieren Sie manuell die Embryonen aus ihrem Chorion mit einer feinen Pinzette (siehe Liste der Materialien).
- Legen Sie die Embryonen in der 28 ° C-Inkubator, bis sie die Schildstufe (6 Stunden nach der Befruchtung) erreicht haben.
5. Cell Transplantation
- Ordnen Sie die Embryonen für die Zelltransplantation.
- Unter einem Fluoreszenzstereomikroskop, wählen Spender Embryonen exprimieren ABP140-mCherry (rot) innerhalb der Abschirmung (grün).
- Mit einem feuerpolierten Pasteur-Pipette, übertragen Sie die Embryonen in den Vertiefungen der Schale Zelltransplantation mit Pen / Strep EM gefüllt. Legen Sie die Host-Embryonen in einer Reihe und die Spenderembryonen in der benachbarten Reihe.
- Mit einem Wimpern orientieren sorgfältig die Embryonen mit dem Schild nach oben.
Hinweis: die Position der Abschirmung kann durch GFP-Expression oder anatomisch beurteilt werden.
- Transplantation System Set-up.
Hinweis: Das Transplantationssystem besteht aus einem Nadelhalter (siehe Liste der Materialien) , die mit PTFE - Schlauch (siehe Materialliste) und einem Rohrverbinder (siehe Materialliste) mit einer Spritze Hamilton mit einem Microdrive (siehe Liste of Materials). Der Nadelhalterangebracht ist , auf einem 3-Wege - Mikromanipulator (siehe Materialliste).- Mit Hilfe eines Nadelhalters an einer Spritze befestigt ist, spülen Sie die Nadel für die Zelltransplantation mit 70% Ethanol. Dry von Luft in die Nadel aufsaugt. Nicht trocken durch Blasen, da dies in Staub auftreten kann in dem konischen Teil der Nadel stecken zu bleiben.
- Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter an der Spritze Hamilton verbunden ist, mit der Fase nach oben.
- Schild-to-shield Cell Transplantation
- Geben Sie den Schirm eines Spenders Embryo mit der Nadel Transplantation und ziehen bis etwa 10-20 mit ABP140-mCherry markierten Zellen. vermeiden vorsichtig Dotter zu ziehen.
- Transplantation der Zellen in der Abschirmung des Wirtsembryo. Wiederholen, bis alle Host-Embryonen transplantiert wurden.
- Entfernen Sie alle beschädigten Embryonen mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. Legen Sie die transplantierten Embryonen im Inkubator bei 28 ° C und lassen Sie sie für etwa 30 Minuten zu erholen.
- Verwendung einer NadelHalter an einer Spritze befestigt, spülen Sie die Zelltransplantation Nadel mit Wasser und legen Sie es auf einem Band aus Knetmasse in einer Petrischale zurück. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm.
6. (Optional) Single Cell Transplantation
Hinweis: Im Embryo haften Zellen miteinander, so dass es schwierig ist, nur eine Zelle in der Transplantationsnadel zu ziehen. Wir entwickelten ein modifiziertes Protokoll auf einfache Weise einzelne Prächordalplatte Vorläuferzellen transplantiert. Die Idee besteht darin, Zellen vor der Transplantation zu dissoziieren. Da isolierte prächordalen Zellen Platte Vorläufer neigen dazu, ihre Identität zu verlieren, wir verhängen sie genetisch eine prospektive Identität Prächordalplatte, durch die Nodal-Signalweg zu aktivieren, in Abwesenheit des Sox32 Transkriptionsfaktor. Wir haben bestätigt , dass diese induzierten Zellen wie endogene Prächordalplatte Vorläuferzellen verhalten 8. Im Folgenden sind die einzelnen Schritte Einzelzelltransplantationen durchzuführen. Handy dissociation ist , indem Embryonen in Calcium-Ringer 11, sezieren eine Explantation und mechanisch Rühren erreicht.
- Im Schritt 2.1 Vorbereitung der Transplantation Schale mit 1% Agarose in Calcium-Ringer anstelle von Embryo Medium.
- Im Schritt 3.1, zusätzlich zu ABP140-mCherry RNA und sin1 Morpholino, fügen Sie 3 ng RNAs codieren , um die aktive Form des Nodal Rezeptor Taram-A (0,6 ng / ul final) und 1,25 ul Morpholin gegen sox32 (Stammlösung bei 2 mM, also 0,5 mM final).
- Nach Schritt 4 Transfer drei ausgewählten Spenderembryonen in der Schale für mit Pen / Strep Calcium-Ringer gefüllt Zelltransplantation eine feuerpolierte Pasteur-Pipette. Mit einer feinen Pinzette, sezieren eine Explantation die injizierten Zellen (ABP140-mCherry markierten Zellen) enthält. Schnell den Rest der Embryonen verwerfen.
- Mit einer Wimpern, rühren Sie vorsichtig die Explantation, bis die Zellen distanzieren.
- Zeichnen Sie eine einzelne isolierte Zelle in der Transplantation Nadel nach obenund verpflanzen sie in die Abschirmung eines Host-Embryo.
- Mit einem feuerpolierten Pasteur-Pipette, übertragen Sie die Embryonen in einem Agarose-beschichtete Schale gefüllt mit Pen / Strep EM. Platzieren Sie die Embryonen in den Inkubator bei 28 ° C für 30 min.
7. Embryo Montage
- Imaging-Kammer
- Methode 1: Verwenden Sie eine Imaging - Kammer aus einem Kunststoffschieber zusammengesetzt (75 * 25 * 0,5 mm) durchbohrt mit 4 Löchern (5,5 mm Durchmesser), mit 3 mm hohen Rändern auf einer Seite (2C - D). Kleben Sie ein Deckglas auf der Rückseite, mit Sekundenkleber (Superkleber).
Hinweis: Am Ende des Experiments, legen Sie die Kammer in Wasser für eine Nacht das Deckglas zu entfernen und loszuwerden Klebstoffreste mit Sandpapier erhalten. - Methode 2: verwenden 35 mm MatTek Glasbodenschalen (siehe Materialliste) mit einem 10 - mm - Loch.
- Methode 1: Verwenden Sie eine Imaging - Kammer aus einem Kunststoffschieber zusammengesetzt (75 * 25 * 0,5 mm) durchbohrt mit 4 Löchern (5,5 mm Durchmesser), mit 3 mm hohen Rändern auf einer Seite (2C - D). Kleben Sie ein Deckglas auf der Rückseite, mit Sekundenkleber (Superkleber).
- Embryo Montage
- Füllen Sie eine Glasflasche mit 1 ml heißem 0,2% Agarose in Embryo Medium auf.Halten Sie es bei 42 ° C in einem Wärmeblock.
- Unter dem Fluoreszenzstereomikroskop, wählen Sie ein Embryo , in dem rot transplantierten Zellen Teil der potenziellen Prächordalplatte in grün markiert sind (dh rot transplantierten Zellen sind im grünen prospektiven Prächordalplatte, und haben die Migration in Richtung des Tier Pole gestartet).
- Übertragen eines ausgewählten Embryos in die Agarose-Lösung mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. Entsorgen Sie die mehr als Embryo Medium aus der Pipette. Zeichnen Sie den Embryo in der Pipette mit Agarose und übertragen den Embryo in der Imaging-Kammer, einen Tropfen Agarose abscheidet. Bevor Agarose gesetzt ist, orientieren, den Embryo mit einer Wimpern. Legen Sie die prospektive Prächordalplatte nach oben für die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop oder auf dem Glasboden für die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop. Warten Sie, bis die Agarose eingestellt ist (ca. 1 min, je nach Raumtemperatur), bevor ein anderer Embryo in der nächsten Vertiefung der Kammer Montage.
Hinweis: ein Abbildungs chamber 4 Vertiefungen, die erlaubt zu 4 Embryonen bis Montage. - Wenn die Agarose eingestellt ist, füllen Sie die Kammer mit Pen / Strep EM ein Austrocknen zu verhindern.
8. Live-Imaging
- Verwenden Sie ein 40-facher Wassertauchlangstrecken-Objektiv. Verwenden Sie geeignete Filtersets Bild GFP und mCherry (für GFP: Anregung BP 470/40, Strahlteiler FT 510 und Emission BP 540/50; für mCherry: Anregung BP 578/21, Strahlteiler FT 596 und Emission LP 641 / 75). Stellen Sie Expositionsdauer, um die Bilddynamik zu optimieren.
- Um das Bild zu allen Zellen in der Platte, zu erwerben z-Stapel, um nur einige um über der prospektiven Prächordalplatte beginnen (im Ektoderm) und ein paar & mgr; m unterhalb der prospektiven Prächordalplatte endet (im Dotter). Verwenden Sie einen z-Schritt von 2 um. Zur Optimierung der Erfassungsgeschwindigkeit, wechseln Farben zwischen z-Stacks statt zwischen Frames.
Hinweis: Diese zu geringe Unterschiede zwischen den grünen und roten Bilder führen können, aber es ist kein Problem, da keine genauen Co-localization zwischen den grünen und roten Signale erforderlich. Zur weiteren Abbildungszeit und Belichtung verringern, grün darf nur einmal alle 5 Zeitpunkten erworben werden, die Prächordalplatte Vorläuferzellen zu identifizieren, ausreichend ist. - Unter Verwendung solcher Einstellungen Bild bis zu 4 Embryonen innerhalb der Zwei-Minuten-Zeitintervall, das notwendig ist, Vorsprung Frequenz und Orientierung zu analysieren. Für die Analyse der Vorsprung Lebensdauer, Zeitintervall auf 30 Sekunden reduzieren, um höhere zeitliche Auflösung erhalten. Bild von 60% epiboly zu 80% epiboly.
9. Zelldynamik Analyse
- Laden Sie 4D-Bilder in ImageJ
Hinweis: Je nach der Software für den Erwerb verwendeten Bilder gespeichert sind, in verschiedenen Formaten (eine Datei pro Bild, eine Datei pro Z-Stapel, eine Datei für das ganze Experiment). Einige ImageJ Plugins sind online verfügbar 4D Stapel zu öffnen. Unsere Daten werden als eine Datei pro Z-Stapel gespeichert. Da die Datenmenge groß sein können, kann es zweckmäßig sein, nur einen Teil davon zu öffnen (einige time Punkte oder ein Unterpunkt der z-Stapel oder 8-Bit konvertiert Bilder ...). Wir verwenden eine maßgeschneiderte ImageJ-Plugin, so zu tun, was wir gerne auf Anfrage zu verteilen. - Die Analyse der Orientierung und Häufigkeit der Zell Vorsprünge
- Verwenden Sie GFP Bilder die Hauptrichtung der zukünftigen Prächordalplatte Migration zu bestimmen. Nehmen Sie diese als Referenz für die Zell Vorsprünge Winkelmessungen. Drehen, um den Stapel, so daß diese Bezugsrichtung zu einer Seite des Bildes parallel ist.
- Folgen Sie einer Zelle. Wählen Sie Winkel-Tool. Für jeden Rahmen und jedes Vorsprungs, verwenden , um die Winkel - Werkzeug um den Winkel zwischen dem Vorsprung und der Bezugsrichtung (3A) zu messen. Verwenden Sie die Analyse / Messen Befehl, um den Wert zu speichern (oder drücken Sie M auf der Tastatur). Speichern Sie die Ergebnisse als txt-Datei. Wiederholen Sie mit der nächsten Zelle.
- Importieren Sie die Daten in R und Plotten Winkelverteilung als Histogramme. Verwenden Sie den Kolmogorov-Smirnov-Test (ks.test in R) unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen.
Hinweis: Der Winkel Werkzeug stellt Werte zwischen 0 ° und 180 °, was die Verwendung der klassischen statistischen Tests ermöglicht und nicht kreisförmig Tests. - Mit diesem Datensatz, Emissionsfrequenz als die Anzahl der Vorsprünge pro Zelle pro Minute zu berechnen. Verwenden Student T-Test (t.test in R) unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen.
- Die Analyse der Zell Vorsprünge Lebensdauer
- Für jede Zelle und jeder Vorsprung, messen Vorsprung Dauer (Anzahl der Rahmen, in dem der Vorsprung vorhanden x Zeitintervall zwischen den Bildern ist).
- Importieren Sie die Daten in R. Verwenden Student T-Test (t.test in R) zu unterschiedlichen Bedingungen zu vergleichen.
Hinweis: Andere Migrationsfunktionen können interessant sein, zu analysieren, um die Zellmigration zu charakterisieren. Dazu gehören Zellspuren, für Geschwindigkeit, Richtung und Persistenz Messungen oder Zellmorphologie. Einige kommerzielle Software-Anwendungen sind verfügbar, um diese Funktionen zu messen, aber eine große Anzahl von Open-Source-Software-AnwenKationen und ImageJ Plugins auch zur Verfügung stehen, wie zum Beispiel Morphodynamik 12 zu analysieren ADAPT Diper zu betrachten Zelle Trajektorien und Richtungs Persistenz 13, 14 Celltrack während der Migration Zellgrenzen zu verfolgen.
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Representative Results
Die vorgestellte Technik wurde verwendet , um die Rolle der Sin1, einer der Kernkomponenten des Tor - Komplex 2 (TORC2), bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration zu analysieren. Die Verwendung von Zelltransplantation ermöglicht die Kennzeichnung von isolierten Zellen und Analyse von Zell-autonome Effekte. Film S1 zeigt die Migration von transplantierten Prächordalplatte Vorläuferzellen. Aktin Kennzeichnung mit ABP140 ermöglicht die einfache Visualisierung von Aktin-reichen Cytoplasma-Vorsprünge. Wir maßen ihre Frequenz und Orientierung. Wildtyp - Zellen produzieren häufig große zytoplasmatische orientierten Vorsprünge in Richtung des animalen Pol, dh in der Richtung der Migration (3B). Verlust der Funktion von Sin1 führt zu einer drastischen Reduzierung der Anzahl von Vorsprüngen und Randomisierung der verbleibenden, in die Steuerung Aktin-rich Standsbildung die Bedeutung sin1 demonstriert. Interessanterweise kann dieser Phänotyp durch e gerettet werdenxpression einer konstitutiv aktiven Form von 15 Rac1, was darauf hindeutet , dass stark TORC2 Aktindynamik steuert und Zellstandsbildung durch Rac1 (3B).
Die vorgestellte Technik wurde auch die Rolle von Arpin, einem kürzlich identifizierten Inhibitor des Arp2 / 3 - Komplex auf Zelldynamik 4 zur Charakterisierung verwendet. Verlust von Arpin Funktion führt zu einer Erhöhung der Vorsprung Frequenz (Durchschnittsrate von Zellen, die einen Vorsprung an einer gegebenen Zeit beherbergen). Dies könnte entweder zu häufigeren Standsbildung oder zu einer Erhöhung der Stabilität durch Vorsprungs sein. Messung ergab Vorsprung Lebensdauer , dass in Abwesenheit von Arpin, Vorsprung zeitliche Persistenz verdoppelt (3C). Dies steht im Einklang mit der Rolle der Arpin als Arp2 / 3-Hemmstoff, der Vorsprung Retraktion erleichtern würde, und schlägt vor, dass Arpin durch Modulieren Vorsprung Stabilität Vorsprung Frequenz beeinflusst, anstattVorsprung Initiation.
Abb . 1: Überblick über die Vorgehensweise Tg (gsc: gfp) Embryonen werden in der 4-Zellen - Stadium (1 h nach der Befruchtung) injiziert. Nach 5 h bei 28 ° C, zeigt Embryonen ABP140-mCherry positive Zellen innerhalb der Abschirmung (GFP +) als Donator Embryonen ausgewählt. Abschirmungs Zellen werden in der Transplantationsnadel und in die Abschirmung eines Wirtsembryo erstellt. Nach 0,5 Stunden der Erholung werden Wirts Embryonen montiert und mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop (40X-Objektiv) abgebildet. HPF:. Stunden nach der Befruchtung Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Transplantatiauf Dish und Imaging - Kammer. (A) Transplantation Gericht mit einzelnen Vertiefungen. (B) Form für Zelltransplantation Gericht. (C) Home-made Imaging - Kammer. (D) Schematische Darstellung des hausgemachten Abbildungskammer. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Die Ergebnisse aus Zelldynamik Analyse (A) Schema des Vorsprungs Winkelmessung. (B) Analyse der Zellüberstand Ausrichtung und Frequenz. In Abwesenheit von Sin1 (Mo-Sin1), emittieren Zellen weniger Vorsprünge und die verbleibenden Vorsprünge sind zufällig orientiert. Dieser Phänotyp kann durch Expression einer konstitutiv aktiven Form des GTPase Rac1 (Mo-Sin gerettet werden1 + CA-Rac1). Geändert von Dumortier und David, 2015 5. (C) Analyse der Vorsprung Lebensdauer. In Abwesenheit von Arpin (Mo-Arpin) wird Vorsprung Frequenz erhöht. Dies ist auf eine Erhöhung der Lebensdauer Vorsprungs. Eine arpin RNA unempfindlich gegen die Morpholino wieder einzuführen stellt diese hyper protrusive Phänotyp. Geändert von Dang et al., 2013 4. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. A: Anterior; P: posterior, L: links, R:. Rechts Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Sin1 Kontrollen Bildung von Zell Vorsprünge, durch Rac1 (Rechtsklick zum Download). Transplantierte Prächordalplatte Vorläuferzellen injiziertABP140-mCherrry RNAs und eine Steuer Morpholino, oder die sin1 Morpholino, oder die sin1 Morpholin und RNAs für die konstitutive Form von Rac1. Protrusion Frequenz und Orientierung wurden auf diesen Bildern gemessen.
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Discussion
Dieses Protokoll stellt eine einfache Möglichkeit , die Rolle eines Kandidaten - Gen in die Zellmigration in vivo zu untersuchen, durch die Schaffung von Chimären - Embryonen Kombination Zelltransplantation mit Live - Bildgebung.
Erstellung von Mosaik-Embryonen
Untersuchung der Dynamik einer Zelle erfordert die Visualisierung seiner Kontur zytoplasmatischen Erweiterungen zu analysieren. oder anders bezeichnet - - Dies kann durch Markierung isolierten Zellen in einem ansonsten unmarkierten erreicht werden Umwelt und damit eine gute visuelle Kontrast bietet.
Ein einfacher Weg , um einen Teil der Zellen im Embryo zu stochastisch Label ist plasmidischen DNA an der 1-Zellen - Stadium 16 einzuspritzen. Die injizierten Plasmide bilden Aggregate, die in Zellen während der Zellteilung zufällig und ungleicher getrennt sind. Dies führt zur Expression des Plasmids in einer zufälligen Teilmenge von Zellen und stellt somit eine sehr schnelle, einfache und nicht-invasive Verfahren zum Erzeugen mosaic Embryonen. Jedoch neigen die injizierten Zellen das Plasmid exprimiert Cluster zu bilden, und die Wahrscheinlichkeit von Embryonen mit wenigen isoliert exprimierenden Zellen in der prospektiven Prächordalplatte zu finden, ist sehr gering. Darüber hinaus bietet die Verwendung von Plasmid-DNA sehr begrenzte Kontrolle des Expressionsniveaus des injizierten Konstrukts. Die Schaffung von Chimären-Embryonen durch Zelltransplantation, obwohl technisch schwieriger als Plasmid-DNA-Injektion, bietet eine Reihe von Vorteilen: die Kontrolle über die Zahl der transplantierten Zellen, die Kontrolle des Expressionsniveaus der Konstrukte (RNA-Injektion), und nicht zuletzt , Zelltransplantationen ermöglichen zellautonome Effekte zu testen, indem in dem Mosaik Embryonen transplantierten Zellen Verlust oder Gewinn von Funktions Konstrukte enthalten. Umgekehrt können auch die Transplantationen nicht autonomen Rolle der Umwelt durch Verpflanzen Wildtyp-Zellen in Embryonen zu beurteilen, verwendet werden, die modifiziert wurden. Dies kann für die Prüfung von besonderem Interesse seinbeispielsweise die Funktion der extrazellulären Matrixkomponenten, die besonders relevant für die Zellmigration Analyse sind.
Ein detailliertes Protokoll für die Zelltransplantation hat bereits 10 beschrieben. Im Vergleich zu diesem Protokoll, möchten wir zwei wesentliche Unterschiede in unserem Verfahren zu diskutieren.
Der erste Unterschied ist auf der Stufe der Spenderembryonen Injektions verwandt. Nach unserer Erfahrung, Embryonen in der 1-Zellen-Stadium injiziert RNAs eines fluoreszierenden Protein nicht exprimieren homogen das fluoreszierende Protein in den Zellen aufgrund einer unvollständigen Diffusion der RNAs in der Zelle. Injektion von Spender Embryonen im 4-Zellen-Stadium in einer der vier Zellen erlaubt einen homogenen Klon von Zellen zu erhalten, die von besonderem Interesse ist, wenn RNAs des fluoreszierenden Proteins co-injiziert mit anderen RNAs, die nicht rückführbar sind.
Der zweite Hauptunterschied ist die Verwendung von Luft anstelle von Öl in dem TransplantatIonen-Spritze. Der Hauptnachteil eines luftgefüllten Systems ist die Trägheit von der Elastizität der Luft führt. Öl im Gegenteil, inkompressibel, bietet eine gute Kontrolle der Saug- und Druck. Jedoch mit wenig Training, und indem die Grenzfläche zwischen Luft und Embryomedium in den dünnen, sich verjüngenden Teil der Nadel gehalten wird, die Steuerung der Saug- und Druck mit einem luftgefüllten System ist ausreichend für Zellen an der Abschirmungsstufe Umpflanzen. Für späteren Stadien als Zellen kleiner und kohäsive werden, erfordert das Ansaugen einen hohen Druck, der sehr genau gesteuert werden muss, die mit einem luftgefüllten Einrichtung nicht erreicht werden kann. Luft anstelle von Öl erleichtert das Setup, wie Befüllen der Anlage mit Öl ohne Luftblase ist schwierig. Darüber hinaus vermeidet es mit Öl, die Transplantation Nadel füllen. Dies ermöglicht Transplantation Nadeln wiederverwendet werden, und daher sorgfältig vorbereitet werden. Wir sind der Meinung, dass eine Nadel ohne scharfe Kanten und des richtigen Durchmesser zu succe Schlüssel ist,ssful Transplantation. Diese Transplantation Schritt ist eindeutig einer der kritischen Schritte in dem Protokoll, das vor der Praxis erfordert einfach durchgeführt.
Wir haben auch vorgeschlagen, ein spezifisches Verfahren für die einzelnen Zellen Umpflanzen, die in Dissoziieren Zellen vor einer Transplantation besteht, um eine einzigartige Zelle in der Transplantationsnadel zu ziehen. Dies impliziert, dass transiente Zelldissoziation nicht ihre Identität zu verändern und / oder Verhalten. Für Prächordalplatte Vorläuferzellen, verhängen wir genetisch Zellidentität und wurden sorgfältig geprüft, dass diese Zellen wie nichtdissoziierten diejenigen verhalten. Wir können jedoch nicht formell, dass die Abspaltung ausschließen und / oder genetische Induktion unbemerkt Änderungen in den Zellen zu induzieren. Einzelzellen Umpflanzen ohne sie distanziert ist machbar. Die Zellen sollten sorgfältig bei der Transplantation Nadel gezogen werden. Aber zumindest in unseren Händen, ist Erfolgsquote recht niedrig, sei es, weil mehr als eine Zelle in die nee bekommtDLE, oder weil die Zell Schere, wenn erstellt und stirbt in der Nadel oder einmal transplantiert.
Epifluoreszenz gegen schnelle konfokale Bildgebung
Die Verwendung von Zelltransplantation zu Mosaik Embryonen schaffen ermöglicht die Kennzeichnung von isolierten Zellen von anderen markierten Zellen getrennt. In diesem Zusammenhang kann eine gute Abbildung der Zellmorphologie und die Dynamik mit Standard-Epifluoreszenzmikroskopie erreicht werden, wie in dem Protokoll vorgeschlagen. Dies hat den offensichtlichen Vorteil einer relativ weit verbreiteten Geräte und eine kostengünstige Alternative zu teureren konfokale Abbildungssysteme zu sein.
Für eine präzise subzelluläre Lokalisationen können konfokale Bildgebung verwendet werden, die Auflösung zu verbessern, insbesondere die axiale Auflösung. Um noch eine ausreichende zeitliche Auflösung, schnelle konfokale Bildgebung bekommen sollte verwendet werden. Aus unserer Erfahrung bieten Spinning-Disc-Mikroskope einen guten Kompromiss zwischen Auflösung, Geschwindigkeit und Phototoxizität. Schnelles Scannen konfokalen microscopes (wie Resonanz-Scanning-Mikroskope) sind auch gute Möglichkeiten, aber weniger häufig und teurer.
Zytoskelett Kennzeichnung
Gute Kennzeichnung von Aktin-Filamenten und deren Dynamik ist von entscheidender Bedeutung zu untersuchen Mechanismen der Aktin-basierte Zellmigration. Obwohl membrangebundenen Fluoreszenzmarker effizienter sind die Zell Umrisse zu analysieren, ermöglicht Aktin Kennzeichnung eine viel bessere Visualisierung der Zell Vorsprünge. Insbesondere wenn drei markierten Zellen in Kontakt kommen, ist es sehr schwierig, eine zytoplasmische Verlängerung zwischen zwei benachbarten Zellen, wie die Kontur der Erweiterung und der Membran der benachbarten Zellen angeordnet zu identifizieren können bis vermischen. Kennzeichnung Aktinfilamente ermöglicht die eindeutige Erkennung von Aktin-basierte Zellvorsprünge, auf die wir fokussiert. Wenn die Zellmorphologie zu quantifizieren war, wäre eine Membran Kennzeichnung vorzuziehen. Eine weitere Option ist es, sowohl die Kennzeichnung zu verwenden, entweder unter Verwendung von 3-Farb-Bildgebung (eine für die transgenen line, eine für Actin und eine für Membran) oder durch GFP Markierung der Membran. In der transgenen Linie ist GFP zytoplasmatischen und goosecoid-GFP positive Zellen so identifiziert werden kann, auch wenn die Membran GFP markiert ist.
In den letzten Jahren haben eine Reihe von Sonden verwendet worden Aktin in lebenden Proben zu kennzeichnen. Die ersten waren direkte Fusionen an Aktinmonomeren. Diese beiden Hauptnachteile dargestellt. Zunächst markierte sie alle Aktin und nicht speziell polymerisiert Actin. Zweitens wurden sie häufig toxisch. Die Sonden zur Zeit in Gebrauch sind filamentöse Aktin Bindungsdomänen zu fluoreszierenden Reportern fusioniert. In diesem Protokoll verwendeten wir ABP140 17 (Actin - Bindungsdomäne des Hefe - Actin - bindendes Protein 140), die derzeit die am häufigsten verwendeten Marker für filamentöses Aktin und Beschriftungen alle filamentösen Aktin. Utrophin 18 (Calponin Homologie - Domäne) Etiketten auch Aktinfilamenten, erscheint aber nur stabile Fäden zu beschriften. Dieser Unterschied wurde verwendet, um identifizieren dynamische Aktinfilamente, wie diejenigen , die von ABP140 und nicht Utrophin 19 gekennzeichnet.
Vor kurzem wurde in der Fliege berichtet , dass ABP140 und Utrophin toxische Wirkungen haben könnten, insbesondere über lange Ausdruck 20. Auch wenn wir keine Migration Defekte in ABP140 markierten Zellen nicht bemerkt haben, können wir nicht ausschließen, dass ABP140 Expression endogener Aktindynamik stören kann. Eine dritte Sonde für filamentöse Aktin wurde vor kurzem 21 berichtet. F-tractin (Aktin-bindende Domäne von Ratten - Inositoltriphosphat- 3-Kinase) wurde als treuer Reporter von Aktinfilamenten beschrieben, die nicht toxische Wirkungen 20,22 zeigen würde. Unseres Wissens wurde die Verwendung von F-tractin nicht in Zebrabärbling noch berichtet.
Neben Actin, könnten viele andere Zellbestand unser Verständnis der Zellmigration zu verbessern beschriftbar. Dies schließt andere Zytoskelett-Komponenten wie Myosin, Mikrotubuli, Zentrosomen sowie kneigene Regulatoren der Zellmigration (aktivierten Formen der kleinen GTPasen Rho, Rac und Cdc42, fluoreszierende Sonden für PIP3 ...) oder beteiligten Proteine in Zelladhäsion (Integrine, Cadherine, ...).
Insgesamt umgruppiert dieses Protokoll eine Anzahl der zuvor beschriebenen Instrumente und Techniken ein schnelles und einfaches System vorzuschlagen , bei der Steuerung der Zellmigration in vivo die Beteiligung eines Kandidatengens zu testen. Wir haben potenzielle Prächordalplatte Migration als es ein interessantes Modell der gerichteten kollektiven Migration ist, und weil der zur Verfügung stehenden transgenen Linie Kennzeichnung es. Jedoch könnte ein ähnliches Protokoll angepasst werden, um andere Migrationsereignisse während der Entwicklung auftreten, zu analysieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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