Abstract
当疟原虫的子孢子阶段接种到哺乳动物宿主的通过蚊子叮咬皮肤疟疾感染开始。高度能动的寄生虫不仅到达肝脏侵入肝细胞转化为红细胞感染形式。它也迁移到皮肤和引流注射部位，在那里它可以被识别和居民和/或招募骨髓细胞退化近侧淋巴结。活体成像报道在皮肤发明亮荧光的赖氨酸GFP阳性白细胞和在引流淋巴结的子孢子和的CD11c +细胞之间的相互作用的早期募集。在这里，我们提出了一个有效的步骤来恢复，识别和枚举招募到小鼠皮肤和引流淋巴结继小鼠模型免疫剂量子孢子的皮内注射骨髓细胞亚群。表型特征采用多参数流式细胞仪提供一个可靠的检测，以评估疟原虫感染的炎症反应在早期的动态细胞变化。
Introduction
疟疾是最致命的传染病在世界上，造成每年超过五十万的人。感染疟原虫 ，该疾病的致病因子，开始由预红细胞（PE）的阶段。在这个阶段中，注入到由阴按蚊宿主皮肤的子孢子达到通过血流肝脏和分化内肝细胞成感染红血细胞，并导致疾病的症状的寄生虫的形式。
疟原虫的PE阶段代表了抗疟疾疫苗特权的目标。事实上，对住这些阶段减毒疫苗，如辐射衰减孢子（RAS），基因逮捕寄生虫（GAP）或药物预防和孢子（CPS）已经证明他们保护啮齿类和人类宿主1-9的能力。在啮齿动物模型，大多数疫苗研究是利用进行静脉免疫，这是在保护效力方面的黄金标准。然而，皮肤阶段的描述，并在引发保护皮肤相关引流淋巴结（DLN）的重要性，已经改变了我们的PE阶段的感知，并强调喷射的皮内途径的重要性。 P的活体成像注入啮齿动物的皮肤疟原虫子孢子已经表明，只有〜25％的接种的到达经由血流肝脏。剩余的〜75％的基DLN（〜15％）和皮肤（〜50％）10,11，其中一小部分可以皮肤细胞12,13内变换和仍然存活数周之间分配。此外，随后的研究描述了皮内免疫后建立有效的保护性免疫的主要发生在皮肤-DLN，其中寄生虫特异性CD8 + T细胞被激活的地方，并且仅在脾或肝DLNS 14,15轻微。
而大多数研究集中于在建立保护性免疫应答的牵连的效应细胞的表征，较少被知道关于注射进皮肤活的减毒的寄生虫的命运，特别是它们的先天免疫系统的相互作用。特别是，涉及在寄生虫抗原摄取，加工和呈递至CD8 + T细胞的抗原呈递细胞的表征是至关重要的，因为知道PE抗原采集既可以在皮肤和DLN隔间发生。上一页活体成像的研究以下感染蚊子叮咬16，而在DLN 10,17观察孢子和树突状细胞之间的相互作用早在肌肤明亮描述荧光赖氨酸-GFP阳性细胞的早期涌入。最近，已经报道，在由蚊子皮肤接种孢子同时增加树突和调节性T细胞的运动中的皮肤小鼠中，而在DLN 18观察抗原呈递细胞的减少数量。
我们的目的是确定和量化更精确地招募在皮肤和相应DLN以及那些以下免疫剂量的RAS 19的皮内注射与寄生虫相互作用的白细胞亚群。在这方面，我们分离出两种组织的骨髓细胞（CD45 +细胞CD11b +）和由多=参数流特征的感兴趣的亚群术。在利什曼原虫皮肤感染20的早期阶段中描述的免疫应答相一致，主主机响应于子孢子注射由随后的炎性单核细胞（CD45 +细胞CD11b中性粒细胞（CD45 +细胞CD11b + Ly6G +的Ly6C INT）的一个连续招募+ Ly6G -的Ly6C +），这些differenti的基础上确定的在Ly6G和的Ly6C表面标记的人表达。
我们在这里描述用于从小鼠皮肤中分离的骨髓细胞和以下免疫从感染蚊唾液腺提取剂量的RAS的皮内注射DLN的协议。可重复的皮内注射和组织处理的量化感染的组织内浸润的细胞群的表型变化的关键步骤。下面详述的方法提供了一种可靠的测定法来评估皮肤和DLN炎性响应于疟原虫寄生虫和可扩展到各种实验系统。
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Protocol
所有的程序是由巴斯德研究所的委员会，由当地伦理委员会对动物实验（伦理委员会IDF-1巴黎，巴黎，法国，协议编号：2012-0015）批准，并按照适用的原则和规定执行。
1.材料与试剂
- 使用对感染小鼠产生和后部后3-5天喂如前面所述21雌性按蚊的蚊子（Sda500株）。
- 使用寄生虫疟原虫 ANKA克隆表达组成型热休克蛋白70（HSP70）启动子的控制下的绿色荧光蛋白（GFP）基因。这将产生在整个寄生虫生命周期的22明亮的荧光。
- 使用雌性C57BL / 6JRj小鼠（7周龄）。
注：所描述的协议中使用的所有试剂都列在T 能材料/设备 。
- 之间的传染性血粉后18-25天，收集并如先前21描述的冷麻醉蚊子成在冰上15毫升管。小心通过倒转该管将它们转移到培养皿。保持冰虫和揭露蚊子γ-或X线照射的12拉德剂量。
- 从辐照蚊虫唾液腺隔离减毒子孢子先前所描述的21。收集感染唾液腺在冰上1×Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中的一小体积（大约15微升），并轻轻粉碎他们释放子孢子。
注意：高度浓缩的寄生虫悬浮液中的小体积为临界的注射，这是因此，必须收获足够数量的唾液腺从大量预选良好感染蚊子，其稳健的表达所证明绿色荧光。 - 通过35微米的细胞过滤帽，以消除团块和蚊子碎片适于一个低粘附力1.5 ml离心管过滤孢子悬浮液。
- 算孤立子孢子总数如前所述21，用冷的1×DPBS调整寄生虫悬浮液的浓度，以获得83000孢子/微升。存储寄生虫冰同时继续下一步骤。
- 收集来自未感染的蚊子唾液腺将用作阴性对照和作为在步骤2.2和2.3中所述处理该样品的当量数。稀如上所述，得到在悬浮唾液腺提取物的类似浓度的样品。
注：子孢子可以存储在冰上最多2小时。然而，理想情况下他们是在一个小时内破碎唾液腺后注射。
3.注射孢子进入皮肤拉耳揭掉
- 通过腹腔注射氯胺酮（50毫克/千克）/赛拉嗪（5mg / kg的）混合物麻醉动物。等待5-8分钟的鼠标是在无意识的状态和应用眼药膏的眼睛，以防止角膜干燥。通过两个后双脚进行温和的脚趾捏评价麻醉深度。
注：麻醉的剂量持续少于20分钟，因此，下一个步骤必须迅速完成。 - 通过固定与先前立体显微镜（ 图1A）根据放置的透明胶带腹侧稳定鼠标的耳廓。轻压耳朵，避免血管损伤。
- 装入10微升注射器/ 35计斜面针与0.6微升悬浮寄生虫10。
- 通过仔细插入在耳朵上（ 图1A）的背部侧的针，表皮下面交付子孢子悬浮液在4注射部位（每个站点0.15微升），用斜面向上，注意避免血管。允许针保持在真皮为几秒钟，以防止注入剂的回流后，再取出。在步骤（ 图1B和1C）的端部观察在每个注射部位的特性丘疹。
- 注射后，小心地取出从磁带的耳朵。
- 由以下的步骤3.2-3.4注射对侧耳朵与相同剂量的寄生虫。
- 注入2用1×DPBS任0.6微升或0.6微升未感染的蚊子1X DPBS +唾液腺提取物的额外的小鼠，以评价由单独的注入和蚊子材料在真皮沉积介导的炎症反应。
- 把它放回笼子前，监视鼠标麻醉复苏。
注：在皮肤上的适当的子孢子沉积可通过荧光显微镜（ 图2A和2B进行监测），如previsously 23所述正在编写的鼠标。
4.皮肤和引流淋巴结清扫术
- 制备标准培养基（SM）如下：Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）+ 25毫4-（2-羟乙基）补充有400单位-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）/ ml胶原酶和50微克/毫升脱氧核糖核酸酶（DNA酶） 。
- 准备在冰两个6孔平底组织培养板用4.5ml SM + 70微米的细胞过滤每孔DLN样品（板甲）和每孔4.5毫升SM皮肤样本（板B）。
- 在以下的子孢子接种所需时间点，深受腹腔注射氯胺酮（125毫克/千克）/赛拉嗪（12.5毫克/千克）混合物之前颈脱位麻醉小鼠。确保鼠标演示临床死亡的迹象，并立即开始清扫。
注：骨髓细胞招聘的动力学可以在注射后的不同时间进行检查挠度（ 即 2小时，4小时，并如前所述14 24小时）。 - 消毒接种耳并用70％乙醇的相应颈部区域，以减少污染的可能性。
- 用无菌剪刀和镊子，无菌解剖近端耳DLN而不收集周围的脂肪。请在jugulo-carotidian沟第一切口，然后从工作现场取下毛发。伸展用2钳子切口以暴露相比周围组织出现灰色的DLN。
- 小心捏在DLN的顶部钳结缔组织，以促进其除去。通过将钳子的淋巴组织（ 图3A和3B）的下方提取DLN。放置在DLN井含4.5毫升SM + 70微米的细胞过滤（板甲）。
- 使用无菌锋利的剪刀和镊子（ 图4A）收获整个接种耳朵。 SEPAR捏和间隔开切两钳（ - 4E 图4B）结束吃耳朵的背部和腹部的方面。它们放到一个很好含4.5毫升SM（板B），确保这两个组织都完全沉浸在网上平台。
注意：为了提高实验的可靠性和增加所关注的细胞的数目，池2注入的耳朵或2 DLNS从每个样品相同的鼠标。 - 收获和并行处理的耳朵和与任一1X DPBS或唾液腺提取物接种的小鼠的DLNS。包括从幼稚鼠标负，单染补偿控制收获2个额外的耳朵和淋巴结样品。
5.淋巴结细胞分离
- 在37℃+ 5％CO 2孵育淋巴结（图版A），参考下缓慢搅拌15分钟。添加10mM的最终乙二胺四乙酸（EDTA），每孔中和胶原酶和DNA酶ACTIvities。进行冰下一个步骤。
- 分离使用5毫升注射器柱塞的顶端淋巴结。按在对阵过滤，直到所有剩下的打圈方式是白色的结缔组织。
- 用500μl1X DPBS + 1％胎牛血清（FBS）+ 2mM的EDTA冲洗细胞过滤两次。转移阱的整个体积在15ml管中。
- 冲洗用500μl1X DPBS + 2％FBS + 2mM的EDTA的阱两次，并且将体积转移到15毫升管。置于冰上管。
6.从耳朵皮肤细胞分离
- 在37℃+ 5％CO 2孵育耳小叶（图版B）为下温和搅拌1小时。
注：温育20分钟后，切穗小叶用剪刀切成小块，以促进组织消化，并把样品放回培养箱剩余的40分钟。所用的介质在温育时间结束时可以观察到单个的细胞。 - 添加10毫米最后每孔EDTA来中和胶原酶和DNA酶的活动。进行冰下一个步骤。
- 传送中使用1ml的吸管新井含有70微米的细胞过滤的耳组织碎片和介质的整个体积。从尖端的端部切成2〜3毫米更容易地收集耳组织碎片。
- 分离使用5毫升注射器柱塞的顶端耳组织碎片。按在对阵过滤，直到所有剩下的打圈方式是白色的结缔组织。
- 用500μl1X DPBS + 2％FBS + 2毫米EDTA冲洗过滤单元的两倍。
- 通过一个70微米的细胞滤网转移井的整个体积到50ml管。
- 冲洗孔用500μl1X DPBS + 2％FBS + 2mM EDTA的和体积转移到50毫升管。保持管冰。
注意：不同的步骤来的总细胞从皮肤分离和DLN组织总结于图5。
- 离心皮肤和DLN样品5分钟，在450 xg离心在4℃下，并丢弃上清液。轻轻地用300微升1X DPBS + 2％FBS + 2毫米EDTA悬浮颗粒。
- 收集每个样品的一个小体积，以计数从使用血细胞计数器对皮肤和DLN分离的细胞的总数。添加0.04％台盼蓝以确定细胞活力。
8.阻断非抗原特异性结合
- 加入10微克/毫升未标记CD16 / CD32的Fc块的抗体。孵育20分钟，在4°C（可以去更长）。
- 加入2毫升冷1X DPBS + 2％FBS + 2毫摩尔EDTA的。离心样品5分钟，在4℃450 XG并弃去上清液。轻轻重悬沉淀用300μl1X DPBS + 2％FBS + 2mM EDTA的并保持在冰上的样品。
9.染色皮肤和淋巴结的髓系细胞
- 此前孵育滑雪受阻n和DLN分离活/死跟踪（ 即 4'，6-二脒基-2-苯基或DAPI），抗CD45和抗CD11b特异性抗体的细胞。
注意：为了丰富感兴趣的髓样细胞亚群，尤其是稀有的人，CD45 +细胞和淋巴细胞可分别从皮肤纯化或通过磁珠促进细胞分选从DLN耗尽。因为大多数从DLN中分离的细胞是CD45 +，使用抗CD45的不是强制性的。其他标记物可以被包括在由正或负门控策略来识别感兴趣的髓样细胞亚群。在这个协议中，在DLN招募的骨髓细胞，通过排除CD8α+细胞富集的（全T细胞隔室可通过使用抗CD3特异性抗体靶向）。 - 在黑暗中孵育30分钟，在4℃下。在450 XG加入500μl1X DPBS + 2％FBS + 2mM EDTA的，离心样品5分钟，在4℃并丢弃苏佩rnatant。重复洗涤步骤两次。
- 重悬用300μl1X DPBS + 2％FBS + 2毫米EDTA样本。通过35微米的细胞滤网传送整个体积中在FACS管中。冲洗用100微升1X DPBS + 2％FBS + 2毫米EDTA过滤器。
- 运行在一个流式细胞染色细胞。门活的单细胞（DAPI - ，FSC-W）排除死细胞和双峰。情节的 CD45 +细胞CD11b +事件对皮肤（ 图6A）和（CD45 +）CD8α -细胞CD11b +用于DLN（ 图6B）的事件。
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Representative Results
我们最近表现出免疫剂量P的那针注射器注射疟原虫子孢子在小鼠皮肤诱导中性粒细胞，随后通过在皮肤和DLN 19炎性单核细胞的连续募集。该议定书部分所述上面详细说明了用于成功地分离从两个组织以下的在耳真皮大量孢子的多次注射活髓样细胞的方法（图1和2）。内的第一个24小时后，将DLN（图3）与皮肤注射部位（图4）分离并处理为总结在图5以分析由多参数流式细胞仪的细胞浸润。总体而言，这项技术使我们能够隔离的平均10 4 CD45 +细胞CD11b +和2.10 4的CD11b +活的单细胞分别用于皮肤和DLN。非碎片单细胞的可接受存活率从40％-70％的皮肤和用于DLN 70-90％不等。 如图6中所示，骨髓细胞在皮肤中的频率（CD45 +细胞CD11b +）和DLN（CD8α -细胞CD11b +）强烈非感染小鼠相比增大以下RAS的皮内注射。
图1：我ntradermal子孢子注入老鼠的耳朵 。表示在麻醉小鼠的耳廓的子孢子的皮内注射（A）的图像。耳腹侧用透明胶带以前在解剖显微镜下放在稳定。针小心地插入在耳的背侧，表皮下面，与锥起来。 （B - Ç）图片表示（0.1-0.2微升寄生虫悬浮液C）的皮内注射后的耳廓的背侧（B）之前和。一个特点丘疹（黑色箭头）是在手术结束时注射部位观察到。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在小鼠的耳真皮孢子沉积的成像 （A）的荧光显微镜示出的RAS从在小鼠皮肤15分钟后喷射（比例尺=60μm的注射部位（由虚线表示）迁移; 10X放大）。子孢子的路径是由所述荧光信号的最大强度投影表示。绿色和红色荧光重spectively显示在开始和采集的10秒后，在皮肤寄生虫位置。 （B）RAS（绿色）的高倍在皮肤注射（比例尺= 20微米，25X放大倍率）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：排水显示下列伊文思蓝皮内注射用于演示目的近端耳DLN的清扫淋巴结处理 （A）图片。鼠标颈脱位后，颈部消毒用70％的乙醇。第一切口与锋利的剪刀颈-颈区制成与皮肤从操作场中去除。切口用2镊子伸揭露出现GR中的DLNayish相比周围的组织。结缔组织然后小心地用钳子夹住的DLN的顶部和从它逐步分离。最后，DLN是通过将钳子淋巴组织下方萃取。 （B）显示在PBS一滴提取DLN图片， 请点击这里查看该图的放大版本。
图4：耳部皮肤处理中的图片示出了连续的步骤来处理接种耳。 （A）中的小鼠的颈脱位之后，耳朵消毒用70％乙醇，并使用无菌尖锐剪刀和镊子除去。 （B - D）耳朵的背部和腹部方面轻轻按捏和S分开除了踱步切两钳结束。 （E）图片放映的耳朵前酶处理的背部和腹部方面的问题。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：。协议内容的关键步骤，以隔离皮肤和组织DLN细胞总数示意图请点击这里查看该图的放大版本。
图6：骨髓细胞分离人口从耳朵皮肤和近端DLN代表FACS图显示。门控策略分析在皮肤（A）和DLN（B）髓室。 的 CD45 +细胞CD11b +和CD8α -的CD11b +细胞门控上分别用于皮肤和DLN总活单峰事件。对于每个条件，5×10 5个事件被收购（2耳朵和2 DLN每个样品池）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在使用全子孢子疟疾疫苗的人类大规模疫苗接种的角度来看，要克服的主要挑战之一是开发优化的路线和寄生虫的给药方法，以确保成功的免疫和保护24,25。在人类中，由减毒活寄生虫（LAP）介导的保护效力的评估具有以下自然蚊子被执行叮咬2，以及皮内，皮下25,26和IV免疫27。如在啮齿类动物28和非人灵长类25报道，LAP的IV施用相比，上述路线诱导更强的保护性免疫应答。然而，使用针头和注射器管理的非IV路线仍然更适合人体大规模的疫苗接种，目前正在努力优化其保护效果。
在老鼠身上进行最近的研究证明D，尤其是在ID的路由的情况下，在多个注射部位（4分）显著增加寄生虫感染子孢子悬浮液（1微升范围）相比寄生虫单个接种较大体积的稀释的小体积的沉积（50微升）24。在我们的实验系统（C57BL / 6小鼠- 伯氏疟原虫 ），完整保护在寄生虫高度浓缩的悬浮液的耳真皮多次注射后（在0.6微升，4注射部位50000 RAS）19来实现。在这方面，我们建立了上述分析更精确地免疫，使我们能够鉴定在皮肤和DLN招募2主要髓样细胞亚群中响应于寄生虫19剂量的RAS的本地宿主的免疫应答的协议。
多参数流式细胞仪可以准确地识别和免疫细胞变化的定量在宿主反应的情况下感染19,20。的大量活细胞的隔离因此关键来执行再现的表型分析。为了这个目的，酶浓度和组织消化的持续时间必须被优化。事实上，酶或孵育时间不足的低浓度可能会导致消化不全与细胞的产量低而长期组织消化，可能会导致降低细胞活力和细胞表面的抗原表达29的改变。然而，使用胶原酶处理既定协议已被证明对经常用于表型分析30相关表面的分子的可检测边缘的影响。
之间的几个参数，可以优化细胞分离的质量，耳朵皮肤的背侧和腹侧部分的分离是必要的，因为它允许胶原酶/ DNA酶来访问真皮。此外，切碎皮切成小件增加了酶访问的表面积，因此使消化的持续时间较短。最后，使用机械解离的有助于提高细胞数产率对皮肤和DLN两者。然而，过度分解会导致额外的压力，可以细胞活力产生负面影响。
我们主张采集活细胞的自定影导致次优的染色，复杂的兴趣罕见阳性事件的区别（数据未显示）。另外，死细胞的判别是更成问题。在需要细胞固定的情况下，我们建议使用LIVE / DEAD可以解决的死细胞的污渍。
使用定义的协议中，我们成功地分离骨髓细胞浸润进入皮肤和DLN响应于寄生虫注入（ 图6A和B）。我们通常相比的DLN（70-90％）获得更高水平的可行的单细胞皮肤（40-70％）。这种差异可以通过用机械解离的额外的步骤以分离的皮肤细胞（皮肤层分离，切碎和更强的糖化）所需的有效酶促消化一起较长的温育时间进行说明。
最后，分析该主机响应于ID注射的子孢子的时要考虑到的一个重要参数是炎症的皮肤中的19,20诱导两个针插入和蚊子唾液腺提取物沉积水平。因此，我们建议与单独的任1×PBS中，或从相同数量的非感染的蚊子，以评估由寄生虫特异性诱导的免疫应答的唾液腺提取物注入额外的小鼠。总之，我们建议剖析高负荷寄生虫感染蚊子的唾液腺和过滤寄生虫停牌限制，可以在皮肤上沉积蚊子物质的量。
一世Ñ 总之，从皮肤和DLN骨髓细胞的通过所述协议的隔离提供了可靠的检测，以对疟原虫感染的炎症反应过程中评估动态的细胞变化，并可以扩展到发送到宿主的皮肤的其它病原体。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢帕特里夏巴达西，凡妮莎Lagal和萨宾Thiberge为批判性阅读，伊琳娜·多布雷斯库和萨宾Thiberge的帮助在小鼠皮肤拍照和Pauline Formaglio教学中的子孢子蠕动体内成像。我们还要感谢马立克Szatanik和中心的生产和按蚊（CEPIA - 巴斯德研究所）感染蚊子饲养。这项研究是由安盛研究基金和基金从科特迪瓦了Laboratoire卓越“新发传染性疾病的综合生物学”（批准号。ANR-10的LabX-62-IBEID）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
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