Abstract
Plasmodium sporozoit aşaması bir sivrisinek ağzın içinden bir memeli konakçının derisine inoküle edildiğinde sıtma enfeksiyonu başlar. son derece hareketli parazit sadece hepatositler istila ve eritrosit-enfektif forma dönüşme karaciğere ulaşır. Aynı zamanda deri içine ve tanınan ve ikamet ve / veya işe miyeloid hücreleri tarafından bozulmuş olabilir enjeksiyon yerinde, drene yakın lenf nodu geçirir. Intravital görüntüleme parlak floresan Lys-GFP pozitif cilt lökositler ve lenf düğümünde sporozoitlerle ve CD11c'nin + hücreler arasındaki etkileşimlerin erken işe bildirdi. Biz burada, kurtarmak belirlemek ve fare cilde işe ve bir fare modelinde sporozoitlerine dozlarının immünizasyon intradermal enjeksiyonu takiben lenf nodu tüketiyor miyeloid hücre alt grupları numaralandırmak için verimli bir prosedür mevcut. Fenotipik karakterizasyonu kullanarak çok parametrik akış sitometri sağlargüvenilir bir tahlil Plasmodium enfeksiyona inflamatuar yanıt sırasında erken dinamik hücresel değişiklikler değerlendirmek.
Introduction
Sıtma her yıl yarım milyondan fazla kişi öldü dünyanın en ölümcül bulaşıcı hastalıklardan biridir. Plasmodium hastalığın nedensel maddesi ile enfeksiyon, bir eritrositik öncesi (PE), faz başlar. Bu aşamada, bir dişi anopheline türü sivrisinek tarafından konak deriye enjekte sporozoitler kan yoluyla karaciğere ulaşır ve hastalığın belirtilerini kırmızı kan hücreleri enfekte ve neden parazit formları içine iç hepatositler ayırt.
Plasmodium PE aşamaları, anti-sıtma aşısı için ayrıcalıklı bir hedef temsil etmektedir. Nitekim, bu tür radyasyon zayıflatılmış sporozoitlerle (RAS) olarak bu aşamaların karşı zayıflatılmış aşılar, canlı, genetik tutuklandı parazitler (GAP) ya da kemoprofilaksi ve sporozoitler (CPS) kemirgen ve insan ana 1-9 hem korumak için kapasitelerini ortaya koymuşlardır. kemirgen modelinde, çok aşılama çalışmaları intravenöz bağışıklık kullanılarak yürütülmektedirKoruyucu etkinlik açısından altın standart hangi. Ancak, cilt aşamasında tanımı ve koruması sağlamaya cilt ilişkili lenf düğümüne (DLN) önemi PE aşaması algı değişti ve enjeksiyon intradermal yolunun önemini vurgulamıştır. P. Intravital görüntüleme kemirgen derisine enjekte berghei sporozoitler aşı sadece ~% 25 kan yoluyla karaciğer ulaşır göstermiştir. ~ Geri kalan% 75, küçük bir oranda deri hücrelerinin 12,13 içinde haftalarca canlı dönüştürmek ve kalabilir proksimal dLn (~% 15) ve cilt (~% 50) 10,11 arasında dağıtır. Ayrıca, daha sonraki çalışmalarda, intradermal aşılamadan sonra etkin koruyucu bağışıklık kurulması özellikle parazit spesifik CD8 + T hücreleri, aktive deri dLn, yer alır ve sadece marjinal karaciğer veya dalak-dLNs 14,15 bu tarif.
İkençalışmaların çoğu koruyucu bağışıklık yanıtının kurulmasında rol efektör hücrelerin karakterizasyonu üzerine yoğunlaşmıştır, çok daha az doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile özellikle etkileşimleri, deri içine enjekte canlı zayıflatılmış parazitlerin akıbeti hakkında bilinmektedir. Özel olarak, CD8 + T hücreleri için, parazit antijen alımı, işleme ve sunumunda rol alan antijen sunan hücreler karakterizasyonu PE antijen alıcı deri ve dLn bölümlerinde hem oluşabilir bilerek kritik önem taşımaktadır. Önceki intravital görüntüleme çalışmaları sporozoitler ve dendritik hücreler arasındaki ilk etkileşimler dLn 10,17 gözlenmiştir ise enfeksiyon sivrisinek ısırığı 16 Aşağıdaki deri, parlak floresan Lys-GFP pozitif hücrenin erken akışını tarif. Daha yakın zamanda, sivrisinekler tarafından deri aşılanmış sporozoitler deri hem de dendritik ve düzenleyici T hücrelerinin hareketliliği artırdığı bildirilmiştirfareler, antijen sunan hücre bir azalma sayısı dLn 18 gözlenmediğini gösterdi.
Belirlemek ve daha kesin olarak, lökosit alt kümelerini cilt alınmış ve RAS 19 dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben parazit ile etkileşim gibi da dLn gelen ölçmek için amaçlanmıştır. Bu bağlamda, her iki dokulardan miyeloid hücreler (CD45 + CD11 +) izole edilmiş ve sitometrisi = çoklu parametre akış ilgi subpopülasyonunun karakterize edilir. Leishmania majör deri enfeksiyonu 20 erken evrede açıklanan immün yanıt ile tutarlı, enjeksiyon sporozoitlerden birincil konak yanıtı inflamatuar monositler (CD45 + CD11 b takip polimorfonükleer nötrofillerin (CD45 + CD11 b + Ly6G + Ly6C int) bir ardışık işe oluşur + Ly6G - differenti temelinde tanımlanan Ly6C +)Ly6G ve Ly6C yüzey belirteçleri al ifadesi.
Farenin deri miyeloid hücrelerin izole edilmesi ve dLn enfekte sivrisinek tükürük bezlerinden ekstre RAS dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben burada bir protokol açıklar. Tekrarlanabilir intradermal enjeksiyonları ve doku işleme enfekte dokular içinde hücre popülasyonu infiltre fenotipik değişiklikleri ölçmek için kritik adımlar vardır. Aşağıda ayrıntılı bir yaklaşım güvenilir bir deney Plasmodium paraziti cildin ve dLn enflamatuar tepkiyi değerlendirmek için çeşitli deney sistemlerinde uzatılabilir içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler Pasteur Enstitüsü komitesi tarafından ve yerel Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Etik kurul IDF-Paris 1, Paris, Fransa; anlaşma numarası: 2012-0015) tarafından onaylanmış ve yürürlükteki kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Malzemeler ve Reaktifler
- Daha önce 21 açıklandığı gibi 3-5 gün ortaya çıkması ve arka sonrası enfekte olmuş fareler üzerinde beslemek dişi Anopheles stephensi sivrisinek (Sda500 suşu) kullanın.
- Kullanım parazitler yapısal ısı şok proteini 70 (HSP70) promoteri kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) geni, Plasmodium berghei ANKA klonu. Bu parazit yaşam döngüsü 22 boyunca parlak floresan verir.
- Kullanım dişi C57BL / 6JRj fareleri (7 haftalık).
NOT: açıklanan protokol kullanılan tüm reaktifler Malzemeleri / Ekipman güçlü T listelenmiştir.
- Bulaşıcı kan yemekten sonra 18-25 gün arasında, toplamak ve daha önce 21 açıklandığı gibi buz üzerinde bir 15 ml tüp içine sivrisinekler soğuk uyutmak. Dikkatle tersini tüp Petri kabı üzerine aktarabilirsiniz. buz üzerinde böcekleri korumak ve γ- veya x-radyasyon 12 Krad dozuna sivrisinek maruz bırakmaktadır.
- Işınlanmış sivrisinek tükürük bezlerinden gelen zayıflatılmış sporozoit yalıtmak daha önce 21 nitelendirdi. sporozoit serbest ezmek yavaşça buz üzerinde 1 x Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) (15 ul) etrafında küçük bir hacme enfekte tükürük bezleri toplayın ve.
Not: kendi güçlü bir ifade ile kanıtlandığı gibi kritik bir küçük bir hacim içinde oldukça konsantre bir parazit süspansiyonu enjeksiyonu, önceden seçilmiş de enfekte sivrisinek yüksek sayıda tükürük bezi yeterli sayıda hasat etmek gereklidirYeşil-floresan. - kümeleri ve sivrisinek artıkları yok etmek için düşük bir yapışma 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü için uyarlanmış bir 35 um hücre filtresi kapağı ile sporozoit süspansiyon filtre.
- Daha önce 21 açıklandığı gibi izole sporozoitlerine toplam sayısını ve 83000 sporozoit / ul elde etmek için soğuk 1x DPBS ile parazit süspansiyonu konsantrasyonunu ayarlamak. Bir sonraki adımlar devam ederken buz üzerinde parazit saklayın.
- Negatif kontrol olarak kullanılan ve adım 2.2 ve 2.3 açıklandığı gibi örnek işleme edilecek bulaşmamış sivrisineklerden tükürük bezlerinin eşdeğer sayıda toplamak. süspansiyon içinde tükürük bezi özleri içindeki konsantrasyonu elde etmek için, yukarıda belirtildiği gibi örnek seyreltilir.
Not: Sporozoitler 2 saatlik bir süre için buz üzerinde saklanabilir. Ancak, ideal olarak da tükürük bezleri ezme sonra bir saat içinde enjekte edilir.
Dermal La içine sporozoitlerine 3. EnjeksiyonKulak Yer
- ketamin intraperitoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) karışımı, hayvanların anestezisi. Fare bilinçsizlik durumda olması ve kornea kurumasını önlemek için gözleri oftalmik merhem uygulamak için 5-8 dakika bekleyin. iki arka ayakları üzerinde yumuşak bir ayak tutam yaparak anestezi derinliği değerlendirin.
NOT: Anestezi dozu az 20 dakika sürer, bu nedenle sonraki adımlar hızla yapılmalıdır. - Daha önce bir stereomikroskopta (Şekil 1A) altına şeffaf bir bantla ventral tarafı sabitleme ile fare kulak kulak kepçesi stabilize. Yavaşça damarların zarar görmesini önlemek için kulak basın.
- Yeniden süspanse parazitlerin 10 0.6 ul 10 ul şırınga / 35 ölçü eğimli iğne yükleyin.
- Ile dikkatlice epidermis altında, kulak (Şekil 1A) dorsal tarafında iğne sokarak 4 enjeksiyon siteleri (site başına 0.15 ul) sporozoit süspansiyon sununkonik kadar herhangi bir kan damarları önlemek için özen. Birkaç saniye çıkarmadan önce, enjekte geri akmasını önlemek için iğne dermis kalmasına izin. Bir prosedür (Şekil 1B ve 1C) sonunda her enjeksiyon noktasında karakteristik papül dikkate alınmalıdır.
- Enjeksiyondan sonra, dikkatlice kasetten kulak çıkarın.
- adım 3.2-3.4 izleyerek parazitlerin aynı dozda karşı kulak enjekte edilir.
- yalnız enjeksiyon ve dermis sivrisinek materyalin birikimi ile oluşan iltihabi yanıtı değerlendirmek amacıyla 1x DPBS 0.6 ul veya enfekte olmayan sivrisineklerden 1x DPBS + tükürük bezi ekstraktı 0.6 ul ya 2 ek fareler enjekte edilir.
- kafes içine geri koymadan önce anestezi fare kurtarma izleyin.
Not: Cilt uygun sporozoit yerleştirme floresan mikroskobu (Şekil 2A ve 2B ile izlenebilirPrevisously 23 tarif edildiği gibi), fare hazırlanmaktadır.
4. Deri ve boşaltılması lenf nodu diseksiyonu
- standart ortam (SM) hazırlanması şu şekilde: Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) + 25 mM 4- (2-hidroksietil) 400 U ile takviye edilmiş 1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) / ml kolajenaz ve 50 ug / ml deoksiribonükleaz (Dnase) .
- dLn örnekleri için oyuk başına + 70 um hücre filtresi 4.5 mi SM (plaka) ve deri örnekleri için oyuk başına 4.5 mi SM (Levha B) buz üzerinde iki adet 6 gözlü düz dipli doku kültürü plakaları hazırlayın.
- sporozoit inokülasyondan sonra arzu edilen bir zaman noktasında, derin intraperitonal ketamin enjekte (125 mg / kg) / ksilazin (12.5 mg / kg) karışımı ile önceden servikal dislokasyon ile fare anestezi. Fare klinik ölüm belirtileri gösteren emin olun ve hemen diseksiyonu başlar.
Not: miyeloid hücre alımı kinetiği inj sonra farklı zamanlarda incelenebilirection (yani 2 saat, 4 saat ve daha önce tarif edildiği gibi 14 24 saat). - bulaşma olasılığını azaltmak için aşılanmış kulak ve% 70 etanol ile ilgili boyun bölgesini dezenfekte.
- Steril makas ve forseps kullanarak, aseptik çevreleyen yağ toplama olmadan proksimal aurikular dLn teşrih. jugulo-carotidian sulkusta bir ilk kesi gerçekleştirmek ve işletme alanında tüyleri. çevre dokuya kıyasla grimsi görünür dLn açığa 2 forseps ile kesi gerin.
- onun çıkarılmasını kolaylaştırmak için forseps ile dLn üstünde dikkatle bağ dokuları çimdik. Lenfoid doku (Şekil 3A ve 3B) altında bir forseps yerleştirerek dLn çıkarın. iyi içeren 4,5 ml SM + 70 mikron hücre süzgeç (Levha A) dLn yerleştirin.
- Steril keskin bir makas ve forseps (Şekil 4A) kullanarak tüm inoküle kulak hasat. Separkısma ve iki forseps (- 4E Şekil 4B) ile biten kesim dışında boşluk ile kulağın dorsal ve ventral yönlerini yedik. Her iki dokular tamamen ortamda batırılır emin iyi içeren 4.5 ml SM (Levha B) içine yerleştirin.
Not: Deney güvenilirliğini artırmak ve ilgi hücre sayısını arttırmak için, havuz 2 numune başına aynı fare kulağı ya da 2 dLNs enjekte edildi. - Kulakları ve 1x DPBS veya tükürük bezi özleri ya ile aşılanmış farelerin dLNs paralel olarak hasat ve süreç. Negatif ve tek boyama tazminat kontrolleri için naif bir fare hasat 2 ek kulak ve lenf nodu örnekleri ekleyin.
Lenf düğümleri 5. Hücre İzolasyonu
- Hafif ajitasyon altında 15 dakika boyunca 37 ° C ila +% 5 CO2 lenf düğümleri (plaka) inkübe edin. kolajenaz ve DNaz acti nötralize etmek için oyuk başına 10 mM son etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilavevities. buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin.
- 5 ml şırınga pistonu üst ucunu kullanarak lenf düğümleri ayırmak. kalan tüm kadar süzgeç karşı dairesel hareketlerle basın beyaz bağ dokusu olduğunu.
- 500 ul 1x DPBS +% 2 fetal sığır serumu (FBS) + 2mM EDTA ile iki defa hücre süzgecinden durulayın. 15 ml'lik bir tüp içinde oyuk tüm hacmi aktarın.
- +% 2 FBS + 2 mM EDTA, 500 ul 1 x DPBS ile de iki kez yıkayın ve 15 ml tüp içine ses transferi. buz üzerinde tüpler tutun.
Kulak Cilt 6. Hücre İzolasyonu
- Hafif ajitasyon altında, 1 saat boyunca 37 ° C'de 5% CO2 kulak bildiri (levha B) inkübe edin.
Not: inkübasyon 20 dakika sonra, doku sindirimi kolaylaştırmak ve kalan 40 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde tekrar örnek koymak için küçük parçalar halinde makas kulak bildiriler kesti. Tek hücre inkübasyon süresi sonunda ortam içinde görülmektedir. - 10 mM finalini ekle oyuk başına EDTA kolajenaz ve DNaz eylemlere karşı. buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin.
- Yeni kuyu bir 1ml pipet kullanarak 70 mikron hücre süzgeç içeren kulak doku parçaları ve orta tüm hacmi aktarın. daha kolay kulak doku parçaları toplamak için ucunun sonundan itibaren 2 ila 3 mm kesin.
- 5 ml şırınga pistonu üst ucunu kullanarak kulak doku parçaları ayırmak. kalan tüm kadar süzgeç karşı dairesel hareketlerle basın beyaz bağ dokusu olduğunu.
- 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile iki kez hücre gericileri durulayın.
- 70 mikron hücre süzgecinden 50 ml'lik tüp içine de tüm hacmi aktarın.
- de 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA yıkayın ve 50 ml'lik bir tüp içine ses transferi. buz üzerinde tüp tutun.
Not: farklı adımlar cilt toplam hücrelerin izole edilmesi ve dLn dokular Şekil 5'te özetlenmiştir.
- 4 ° C'de 450 x g'de 5 dakika boyunca deri ve dLn örnekleri santrifüj ve supernatant atın. Yavaşça 300 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile pelletini.
- Bir hemasitometre kullanarak deri ve dLn izole hücrelerin toplam sayısını saymak için, her numune, küçük bir hacim toplayın. % 0.04 hücre yaşayabilirliğini belirlemek için tripan mavisi ekleyin.
Sigara 8. Bloklama antijene özgü bağlanma
- işaretsiz CD16 / CD32 Fc Block antikorunun 10 ug / ml ilave edilir. (Daha uzun gidebilir), 4 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
- Soğuk 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA 2 ml ilave edilir. 4 ° C'de 450 x g'de 5 dakika boyunca numune santrifüj ve supernatant atın. Yavaşça +% 2 FBS + 2 mM EDTA, 300 ul 1 x DPBS pelletini ve buz üzerinde örneklerin korumak.
9. Boyama Deri ve Lenf Nodu Myeloid Hücreleri
- Daha önce bloke ski inküben ve dLn canlı / ölü izleyicinin (örneğin 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol ve DAPI), anti-CD45 ve anti-CD11 b özgü antikorlarla hücreleri izole edilmiştir.
NOTLAR: ilgi miyeloid hücre alt-popülasyonunu, özellikle az olanları zenginleştirmek için, CD45 + hücreleri ve lenfositler, sırasıyla deriden saflaştırılabilir veya manyetik boncuk kolaylaştırıcı hücre sıralama ile dLn tükenmiş. DLn izole hücrelerin çoğu bu yana CD45 +, anti-CD45 kullanılması zorunlu değildir bulunmaktadır. Diğer belirteçleri pozitif veya negatif-yolluk strateji ile ilgi miyeloid hücre alt popülasyonlarını belirlemek için dahil edilebilir. Bu protokol, dLn olarak silah miyeloid hücrelerin CD8α + hücreler hariç tutarak zenginleştirildi (tüm T hücresi bölümü, hem anti-CD3 spesifik antikor kullanılarak hedeflenebilir). - Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C'de 450 x g'de 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA, santrifüj numune 5 dakika ekleyin ve supe atınrnatant. iki kez yıkama adımı yineleyin.
- 300 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile örnekleri yeniden süspanse edin. 35 mikron hücre süzgecinden FACS tüp içinde tüm hacim aktarın. 100 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile durulayın.
- bir akış sitometresinin lekeli hücrelerin çalıştırın. Kapı tek hücreleri canlı (DAPI - FSC-W) ölü hücreleri ve ikilileri dışlamak için. DLN (Şekil 6B) için CD11b + olaylar - Deri (Şekil 6A) ve (CD45 +) CD8α için arsa CD45 + CD11b + olaylar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz son zamanlarda P. immünizasyon dozlarda o iğne şırınga enjeksiyonu gösterdi fare derisi, deri ve dLn 19 iltihaplı monositler ve ardından polimorfonükleer nötrofillerin ardışık işe indükler bölgesindeki berghei sporozoitler. Protokol Yukarıdaki bölümde başarılı kulak dermisteki sporozoitler çok sayıda çoklu enjeksiyonlardan sonra, her iki doku canlı miyeloid hücreleri izole etmek için kullanılan prosedürü detayları tarif edildiği gibi (Şekil 1 ve 2). Sitometrisi çok parametre akış hücresel infiltrasyon analizi için, Şekil 5'te özetlendiği gibi, ilk 24 saat içinde, dLn (Şekil 3) ve cilt enjeksiyon bölgesinde (Şekil 4) izole edildi ve işlenmiştir. Genel olarak, bu teknik bir ortalama 10 4 CD45 + CD11b + ve 2.10 4 CD11b + canlı tek hücreleri izole etmek için bize izinsırasıyla, deri ve dLn için. olmayan enkaz tek hücre kabul canlılığı cilt için% 40-70 ve dLn için% 70-90 arasında değişmektedir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, deri miyeloid hücrelerin frekansı (CD45 + CD11 b +) ve dLn (CD8α - CD11b +) kuvvetli olmayan enfekte edilmiş fareler ile karşılaştırıldığında, TAS ile intradermal enjeksiyonu takiben arttırır.
Şekil 1: Ben Fare Kulak içine sporozoitlerine Enjeksiyon ntradermal. Bir anestezi fare kulak kepçesi içinde sporozoitlerine intradermal enjeksiyon gösteren (A) Görüntü. Kulağın ventral yüzü açık bant önceden bir mikroskop altında yerleştirilir ile stabilize edilir. İğne dikkatle konik yukarı gelecek şekilde, epidermis altında, kulak sırt tarafında eklenir. (B - C) Parazit süspansiyonu 0.1-0.2 ul (C) deri altına enjeksiyonundan sonra kulak kepçesi dorsal tarafına önceden (B) ve gösteren resimler. Karakteristik papül (siyah ok) ameliyat sonunda enjeksiyon yerinde gözlemlenebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 2: Fare kulak dermisinde Sporozoitler biriken Görüntüleme sıçan derisine 15 dakika enjeksiyon sonrası (Ölçek çubuğu = 60 um olarak (kesikli çizgiler ile belirtilmiştir) enjeksiyon bölgesinde geçiş RAS gösteren (A) floresan mikroskobu; 10X büyütme). sporozoitler yolu floresan sinyalinin maksimum yoğunluğu projeksiyonu ile temsil edilmektedir. Yeşil- ve kırmızı floresanslığı yenidenspectively başında ve iktisap 10 saniye sonra deride parazit konumunu gösterir. (B) RAS (yeşil) Yükseköğretim büyütme deri enjekte (mikron Ölçek bar = 20; 25X büyütme). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Gösteri amaçlı Evans mavisi intradermal enjeksiyonu takiben proksimal aurikular dLn diseksiyonu gösteren lenf nodu İşleme (A) Resmi boşaltılması. fare servikal dislokasyon sonra, boyun,% 70 etanol ile dezenfekte edilir. İlk kesi keskin bir makas ile şah-karotid alanda yapılır ve cilt işletim alanından kaldırılır. Kesi gr görünen DLn açığa 2 forseps ile gerilirAyish çevredeki doku ile karşılaştırıldığında. bağ dokular daha sonra dikkatli bir şekilde dLn üstüne forseps ile bastırılır ve progresif olarak ayrılır. Son olarak, DLN lenf dokusu altında bir forseps koyarak ekstre edilir. PBS bir damla çıkarılan dLn gösteren (B) Resim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Kulak derisi işleme ardışık adımlarım gösteren Resimlerde inoküle kulak işleme. (A), fare servikal dislokasyon sonra, kulak,% 70 etanol ile dezenfekte edilir ve steril keskin bir makas ve forseps kullanılarak ayrılmıştır. (B - D) kulağın dorsal ve ventral yönleri hafifçe tutup s ayrılırkesme dışında ilerleme hızı iki forseps ile sona erer. (E) kulak öncesinde enzimatik tedavi dorsal ve ventral yönlerini gösteren resim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:.. Protokol Özeti cilt ve dLn dokulardan toplam hücreleri izole etmek için önemli adımlar şematik bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Kulak Deri ve Proksimal dLn İzole Myeloid Hücre Nüfus gösteren Temsilcisi FACS araziler.yolluk strateji cilt (A) ve DLN (B) miyeloid bölmesini analiz etmek. CD45 + CD11b + ve CD8α - CD11b + hücreler sırasıyla cilt ve dLn için toplam canlı tekli olaylar kapı bulundu. Her durum için, 5 x 10 5 toplam olaylar (2 kulaklar ve 2 dLn numune başına toplanmış) elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bütün sporozoit sıtma aşısı kullanan insanların büyük ölçekli aşılama perspektifinde, üstesinden gelmek için ana sorunlardan biri başarılı bağışıklama ve koruma 24,25 sağlamak için optimize yolları ve parazit uygulama yöntemlerini geliştirmektir. İnsanlarda, canlı azaltılmış parazitler (LAP) tarafından aracılık edilen koruyucu etkinlik değerlendirilmesi doğal sivrisinek takip gerçekleştirilmiştir 2, hem de intradermal, deri altı 25,26 ve IV'ün aşı 27 ısırır. Kemirgenler 28 ve insan olmayan primatlarda 25 rapor edildiği gibi, LAP IV uygulaması, yukarıda belirtilen yolların göre güçlü bir koruyucu bağışıklık tepkilerini indükler. Bununla birlikte, iğne ve şırınga kullanılarak, uygulamaya olmayan IV yolları hala insan yoğun aşılama için daha uygun kalır ve Konunun koruyucu etkinliği optimize etmek için yapılmaktadır.
Farelerde yapılan son çalışmalar göstermektedirÖzellikle ID rotası durumunda D, bu daha büyük bir hacim içinde seyreltilmiş parazitlerin tek aşılamadan göre birden fazla enjeksiyon bölgelerinde (4 puan) önemli ölçüde artmıştır parazit enfektivite sporozoit süspansiyonu (1 ul) in küçük bir hacmi biriktirme (50 ul) 24. Bizim deneysel sistem (C57BL / 6 fare - P. berghei), tam koruma 19 (0.6 ul, 4 enjeksiyon siteleri 50.000 RAS) parazitlerin yüksek konsantrasyonlu süspansiyon kulak dermis birden enjeksiyondan sonra elde edildi. Bu bağlamda, daha kesin olarak US parazit 19 yanıt olarak deri ve dLn olarak silah 2 önemli miyeloid hücre alt grupları tanımlamak için izin RAS dozlarda immünize yerel bağışıklık tepkisini analiz, yukarıda tarif edilen protokol kurulmuştur.
Çok parametre akış sitometri konakçı tepkisi bağlamında doğru bir tanımlama ve immün hücre değişiklikleri ölçümü sağlarenfeksiyon 19,20 ile. Canlı hücrelerin çok sayıda izole edilmesi tekrarlanabilir fenotipik analizi gerçekleştirmek için, bu nedenle çok önemlidir. Bu amaç için, enzim konsantrasyonu ve doku sinidiriminde süresi optimize edilmelidir. Uzun süreli Doku sindirimi azalma hücre canlılığı ve hücre yüzeyi antijeni ifade 29 değişikliklere yol Nitekim, enzimler veya yetersiz inkübasyon süresi düşük konsantrasyonda hücre, düşük verimle eksik sindirim yol açabilir. Bununla birlikte, kollajenaz muamelesi kullanılarak, iyi bilinen protokoller genellikle 30 analiz fenotipik için kullanılan ilgili yüzeyi moleküllerinin taranabilirlik marjinal bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir.
o kollajenaz / DNAz dermis erişmenize olanak sağlar çünkü hücre izolasyonu kalitesini optimize edebilirsiniz çeşitli parametreler arasında, kulak derisinin dorsal ve ventral bölümlerin ayrılması esastır. Buna ek olarak, küçük içine cildi kıymaParçalar, bu nedenle sindirim süresi daha kısa sağlayan enzim için erişilebilir yüzey alanını arttırır. Son olarak, mekanik ayrışma kullanımı cilt ve dLn hem hücre sayısındaki verimi artırmak için yardımcı olur. Ancak, aşırı ayrışma olumsuz hücre canlılığı etkileyebilir ek strese neden olabilir.
sabitleme ilgi nadir pozitif olayların ayrım zorlaştıran, optimal lekelenme neden çünkü biz canlı hücreler alımını tercih (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, ölü hücrelerden ayrımcılık daha sorunlu oldu. Hücre fiksasyon gereken durumlarda, CANLI / DEAD düzeltilebilir ölü hücre lekeleri kullanımını tavsiye ediyor.
Tanımlı protokolü kullanarak, yanıt olarak cilt ve dLn içine sızmakta başarıyla izole miyeloid hücrelerin enjeksiyon (Şekil 6A ve B) asalak için. Genellikle göre dLn (% 70-90) ile ilgili olarak tek hücrelerinin daha yüksek seviyelerinin elde edilmesiCilt (% 40-70). Bu fark, ilave deri hücreleri izole etmek için mekanik ayrıştırma aşamaları (deri tabakası ayrılması, kıyma ve daha güçlü ezme) ile birlikte etkili bir enzimatik sindirimi için gerekli uzun bir enkübasyon süresi ile açıklanabilir.
Son olarak, sporozoitlerine ID enjeksiyonuna konak yanıtı analiz ederken dikkate alınması gereken önemli bir parametre cilt 19,20 iğne sokulması ve sivrisinek tükürük bezi özü birikimi hem uyarılan inflamasyon seviyesidir. Bu nedenle 1x tek başına PBS veya özel parazit tarafından uyarılan bağışıklık tepkisini değerlendirmek için enfekte olmayan sivrisineklerin aynı sayıda tükürük bezi özleri ile ya ek fareler enjekte öneririz. Tamamen biz tükürük bezlerinde yüksek parazit yükü ile enfekte sivrisinekler incelemek ve deride biriken olabilir sivrisinek malzemenin miktarını sınırlamak için parazit süspansiyonu filtre tavsiye ederiz.
benN özeti, tarif edilen protokol ile deri ve dLn gelen miyeloid hücrelerin izolasyonu güvenilir bir deney Plasmodium inflamatuar yanıt sırasında dinamik hücresel değişiklikler değerlendirmek ve konağın derisine aktarılan diğer patojenlerin uzatılabilir içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar fare derisinde sporozoit motilite in vivo görüntüleme öğretim için resim ve Pauline Formaglio alarak yardım için Patricia Baldacci, Vanessa Lagal ve Sabine Thiberge eleştirel okuma, Irina Dobrescu ve Sabine Thiberge teşekkür ederiz. Biz de sivrisinek yetiştirme için Üretim ve Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) ve Enfeksiyon için Marek Szatanik ve Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Laboratoire d'Excellence "Infectious Diseases Yükselen ve Bütünleştirici Biyoloji" den AXA Araştırma Fonu ve fonlar tarafından desteklenmiştir (no. ANR-10-LabX-62-IBEID hibe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
