Abstract
Malaria infeksjon begynner når sporozoitten stadium av Plasmodium inokuleres inn i huden til en pattedyrvert gjennom et myggstikk. Den svært bevegelige parasitten ikke bare når leveren å invadere hepatocytter og forvandle seg til erytrocytt-infeksiøs form. Det vandrer også inn i huden og til den proksimale lymfeknute drenering injeksjonsstedet, der det kan bli anerkjent og degradert av fastboende og / eller rekruttert myeloide celler. Intra bildebehandling rapporterte tidlig rekruttering av sterkt fluorescerende Lys-GFP positive leukocytter i huden og samspillet mellom sporozoites og CD11c + celler i drenering lymfeknuter. Vi presenterer her en effektiv prosedyre for å komme seg, identifisere og spesifisere de myeloide celle undergrupper som er rekruttert til musen huden og drenering lymfeknute etter intradermal injeksjon av immuniserer doser av sporozoites i en musemodell. Fenotypisk karakterisering ved hjelp av multi-parametrisk flyt gir cytometrien pålitelig analyse for å vurdere tidlige dynamiske celleforandringer i løpet av inflammatoriske respons på Plasmodium infeksjon.
Introduction
Malaria er en av de dødeligste smittsomme sykdommer i verden, drepte mer enn en halv million mennesker i året. Infeksjon av Plasmodium, den kausale midlet av sykdommen begynner ved en pre-erythrocytisk (PE) fase. I løpet av denne fasen, sporozoitter injiseres i vertens hud ved en kvinnelig Anopheline mygg når leveren via blodet og differensiere inne hepatocytter til parasitten former som infiserer røde blodceller og forårsaker symptomene på sykdommen.
PE stadier av Plasmodium representerer en privilegert mål for anti-malaria vaksinasjon. Faktisk, svekkede levende vaksiner mot disse fasene, som for eksempel stråling dempes sporozoites (RAS), har genetisk arrestert parasitter (GAP) eller kjemoprofylakse og sporozoites (CPS) vist sin evne til å beskytte både gnager og menneskelige verter 1-9. I gnager modellen, er de fleste vaksinasjonsstudier utført utnytte intravenøs immunisering, Som er gullstandarden i form av beskyttende effekt. Imidlertid har beskrivelse av en hud scenen og viktigheten av huden assosierte drenering lymfeknute (DLN) i fremlokkende beskyttelse endret vår oppfatning av PE fase og understreket viktigheten av intradermal ruten for injeksjon. Intra avbildning av P. berghei sporozoitter injisert inn i huden av gnagere har vist at bare ~ 25% av inokulumet når leveren via blodet. De resterende ~ 75% fordeles mellom den proksimale DLN (~ 15%) og huden (~ 50%) 10,11, hvor en liten andel kan transformere og forblir i live i flere uker inne hudceller 12,13. Videre påfølgende studier beskrevet at etablering av effektive beskyttende immunitet etter intradermal immunisering skjer hovedsakelig i den hud-DLN, hvor parasitten spesifikke CD8 + T-celler blir aktivert, og bare marginalt i milt eller lever-dLNs 14,15.
Mensde fleste studier har konsentrert seg om karakterisering av effektorceller innblandet i etableringen av beskyttende immunrespons, er mye mindre kjent om skjebnen til levende svekkede parasitter injiseres i huden, spesielt deres interaksjon med det medfødte immunsystemet. Spesielt karakterisering av antigen-presenterende celler som er involvert i parasitt-antigen opptak, prosessering og presentasjon til CD8 + T-celler er av avgjørende betydning, og vite at PE-antigen anskaffelse kan skje både i huden og DLN kamrene. Tidligere intra imaging studier beskrevet en tidlig tilstrømning av sterkt fluorescerende Lys-GFP positive celler i huden etter en smittsom myggstikk 16 mens ble observert tidlig interaksjoner mellom sporozoites og dendrittiske celler i DLN 10,17. Mer nylig er det blitt rapportert at sporozoitter inokulert i huden av mygg øker motiliteten av både dendrittiske og regulatoriske T-celler i hudenmus, mens en reduksjon av antall antigen-presenterende celler ble observert i den DLN 18.
Vi forsøkte å identifisere og kvantifisere mer presist de leukocytt undergrupper rekruttert i huden og tilsvarende DLN så vel som de i samspill med parasitten etter intradermal injeksjon av immuniserer doser av RAS 19. I denne sammenheng, isolerte vi myeloide celler (CD45 + CD11b +) fra både vevet og karakterisert subpopulasjoner av interesse ved fler = parametre strømningscytometri. I samsvar med den immunrespons som beskrives i den tidlige fasen av Leishmania større hudinfeksjon 20, den primære vertsrespons til sporozoitten injeksjon består av en suksessiv rekrutteringen av polymorfonukleære neutrofiler (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) etterfulgt av inflammatoriske monocytter (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) som er identifisert på grunnlag av differensiertal uttrykk for Ly6G og Ly6C overflatemarkører.
Vi beskriver her en protokoll for å isolere myeloide celler fra mus hud og DLN etter intradermal injeksjon av immuniserer doser av RAS hentet fra infiserte mygg spyttkjertlene. Reproduserbare intradermale injeksjoner og behandling vev er viktige skritt for å kvantifisere fenotypiske endringer av infiltrerende cellepopulasjon innenfor infisert vev. Tilnærmingen beskrevet nedenfor gir en pålitelig analyse for å vurdere huden og DLN inflammatoriske respons på Plasmodium parasitten og kan utvides til ulike eksperimentelle systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av komiteen av Pasteur-instituttet og av den lokale etikkomiteen om forsøk med dyr (Etisk komité IDF-Paris en, Paris, Frankrike, avtalenummer: 2012-0015) og utført i samsvar med gjeldende retningslinjer og regelverk.
1. Materialer og reagenser
- Bruk kvinnelige Anopheles stephensi mygg (Sda500 belastningen) som beiter på infiserte mus 3-5 dager etter fremveksten og bak som beskrevet tidligere 21.
- Bruk parasitter Plasmodium berghei ANKA klon som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) genet under kontroll av den konstitutive varmesjokkprotein 70 (HSP70) promoter. Dette gir lyse fluorescens hele parasitten livssyklus 22.
- Bruk kvinnelige C57BL / 6JRj mus (7 uker gammel).
MERK: Alle reagenser som brukes i den beskrevne protokollen er oppført i T stand til materiell / utstyr.
- Mellom 18-25 dager etter den smittsomme blodmåltid, samle og kald bedøve mygg i en 15 ml tube på is som beskrevet tidligere 21. overføre dem forsiktig opp i en petriskål ved å snu røret. Opprettholde insekter på is og utsett mygg til en 12 KRÅD dose av γ- eller x-bestråling.
- Isoler svekkede sporozoites fra bestrålte mygg spyttkjertler som tidligere beskrevet 21. Samle infiserte spyttkjertlene i et lite volum (rundt 15 ul) av 1x Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) på is og forsiktig knuse dem til å frigi sporozoitter.
MERK: injeksjon av en meget konsentrert parasitt suspensjon i et lite volum å være kritisk, er det derfor viktig å høste et tilstrekkelig antall av spyttkjertler fra et stort antall på forhånd valgte vel-infiserte mygg, som gjenspeiles av deres robuste ekspresjon avgreen-fluorescens. - Filtrer sporozoitten suspensjonen gjennom et 35 mikrometer celle sil hetten innrettet til en lav adhesjon 1,5 ml mikrosentrifugerør for å fjerne klumper og mygg rusk.
- Telle det totale antall isolerte sporozoitter som tidligere beskrevet 21 og justere konsentrasjonen av parasitten suspensjon med kald 1x DPBS for å oppnå 83.000 sporozoitter / ul. Oppbevar parasitter på is mens du fortsetter de neste trinnene.
- Samle tilsvarende antall spyttkjertler fra infiserte mygg som vil bli brukt som negativ kontroll og behandle prøven som beskrevet i trinn 2.2 og 2.3. Fortynne prøven som angitt ovenfor for å oppnå samme konsentrasjon av spyttkjertelekstrakter i suspensjonen.
MERK: Sporozoitter kan lagres på is i maksimalt to timer. Men ideelt sett de injiseres innen en time etter knuse spyttkjertlene.
3. Injeksjon av Sporozoitter inn i Dermal Layer av øret
- Bedøve dyrene ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (50 mg / kg) / xylazin (5 mg / kg) blanding. Vent 5-8 min for musen til å være i en tilstand av bevisstløshet og gjelder oftalmisk salve til øynene for å hindre hornhinnen tørking. Evaluere anestesidybden ved å utføre en mild tå klype på begge bakre føttene.
MERK: Dosen av anestesi varer i mindre enn 20 min, så neste skritt må gjøres raskt. - Stabil øret pinna av musen ved å feste ventral side med klar tape tidligere plassert under et stereomikroskop (figur 1A). Trykk forsiktig øret for å unngå skade på blodkar.
- Legg i en 10 mL sprøyte / 35 sporvidde skrå nål med 0,6 mL av resuspendert parasitter 10.
- Lever sporozoitten suspensjonen i 4 injeksjonssteder (0,15 mL per område) ved forsiktig innsetting av nålen på den dorsale side av øret (figur 1A), under epidermis, medskråkant opp, ta vare å unngå blodårer. La nålen å forbli i dermis for noen sekunder for å hindre tilbakestrømning av injectant før du fjerner den. Observere en karakteristisk Papuler på hvert injeksjonssted ved slutten av fremgangsmåten (figur 1B og 1C).
- Etter injeksjon, forsiktig fjerne øret fra båndet.
- Injisere kontralaterale øret med samme dose av parasitter ved å følge trinnene 3,2-3,4.
- Injisere to ytterligere mus med enten 0,6 ul av 1 x DPBS eller 0,6 ul av 1x DPBS + spyttkjertelekstrakt fra uinfiserte mygg for å evaluere den inflammatoriske respons mediert ved injeksjon alene, og avsetning av mygg materiale i dermis.
- Monitor mus utvinning fra anestesi før du legger den tilbake i buret.
NB: Den riktige sporozoitt deponering i huden kan overvåkes ved fluorescens mikroskopi (figur 2A og 2B), Musen blir fremstilt som beskrevet previsously 23.
4. Hud og Drenering lymfeknutetoalett
- Fremstille standard medium (SM) som følger: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) supplert med 400 U / ml kollagenase og 50 ug / ml deoksyribonuklease (DNase) .
- Forbered to seks godt flatbunnede vevskulturplater på is med 4,5 ml SM + 70 mikrometer celle sil per brønn for DLN prøver (Plate A) og 4,5 ml SM per brønn for hudprøver (Plate B).
- Ved ønsket tidspunkt etter inokulering sporozoitt, dypt bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (125 mg / kg) / xylazin (12,5 mg / kg) blandingen før cervikal dislokasjon. Kontroller at mus viser tegn til klinisk død og starte disseksjon umiddelbart.
MERK: kinetikk myeloid celle rekruttering kan bli undersøkt på ulike tidspunkter etter injection (dvs. 2 timer, 4 timer og 24 timer som tidligere beskrevet 14). - Desinfisere den inokulerte øret og den tilsvarende halsområdet med 70% etanol for å redusere muligheten for forurensning.
- Ved hjelp av steril saks og pinsett, aseptisk dissekere den proksimale auricular DLN uten å samle den omkringliggende fett. Utfør et første snitt i jugulo-carotidian sulcus og fjerne hårene fra operasjonsfeltet. Strekk snitt med 2 pinsett for å avsløre DLN som vises gråaktig i forhold til omkringliggende vev.
- Klem bindevev forsiktig på toppen av DLN med tang for å lette fjerning. Pakk ut DLN ved å plassere en pinsett under lymfevev (figur 3A og 3B). Plasser DLN i en brønn som inneholder 4,5 ml SM + 70 mikrometer celle sil (Plate A).
- Høste hele inokulert øret ved hjelp av sterile skarp saks og pinsett (Figur 4A). Separspiste dorsal og ventral sider ved øret ved å knipe og avstand fra hverandre kuttet avsluttes med to tang (Figur 4B - 4E). Legg dem i en brønn som inneholder 4,5 ml SM (Plate B) gjør at begge vev er helt oppslukt i mediet.
NB: For å forbedre påliteligheten av eksperimentet og øke antallet av celler av interesse, basseng 2 injisert ører eller 2 dLNs fra den samme mus per prøve. - Harvest og prosess parallelt ørene og dLNs av mus inokulert med enten 1x DPBS eller spyttkjertelekstrakter. Inkluder 2 ekstra øre og lymfeknuteprøver høstet fra en naiv mus for negative og enkle flekker kompensasjon kontroller.
5. Cell Isolasjon fra lymfeknuter
- Inkuber lymfeknuter (Plate A) ved 37 ° C + 5% CO2 i 15 minutter under forsiktig omrøring. Tilsett 10 mM endelig Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) per brønn for å nøytralisere collagenase og DNase aktisomhet. Utfør de neste trinnene på is.
- Distansere lymfeknuter som bruker den øverste enden av en 5 ml sprøyte stempelet. Trykk i sirkulære bevegelser mot silen inntil alt som gjenstår er hvite bindevev.
- Rens elementet sil to ganger med 500 ul 1x DPBS + 2% føtalt bovint serum (FBS) + 2 mM EDTA. Overfør hele volumet av brønnen i et 15 ml rør.
- Skyll godt to ganger med 500 mL 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA og overføre volum inn i 15 ml tube. Hold rørene på is.
6. Cell Isolasjon fra Skin av øret
- Inkuber øret brosjyrer (Plate B) 37 ° C + 5% CO 2 for 1 time under forsiktig omrøring.
MERK: Etter 20 min inkubasjon kuttet øret flygeblader med saks i små biter for å lette vev fordøyelsen og sette prøven tilbake i inkubatoren for de resterende 40 min. Enkeltceller kan observeres i mediet ved slutten av inkubasjonstiden. - Legg til 10 mM slutt EDTA per brønn for å nøytralisere kollagenase og DNase aktiviteter. Utfør de neste trinnene på is.
- Overfør øret vevfragmenter og hele volum av medium i en ny brønn inneholdende et 70 mikrometer celle sil ved hjelp av en 1 ml pipette. Kutt 2 til 3 mm fra enden av spissen for å samle øre vevfragmenter lettere.
- Distansere øret vev fragmenter ved hjelp av den øverste enden av en 5 ml sprøyte stempelet. Trykk i sirkulære bevegelser mot silen inntil alt som gjenstår er hvite bindevev.
- Skyll celle siler to ganger med 500 mL 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Overfør hele volumet av brønnen inn i en 50 ml-rør gjennom et 70 mikrometer celle sil.
- Skyll godt med 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA og overføre volum til 50 ml røret. Hold røret på is.
MERK: De ulike tiltak for å isolere celler totalt fra huden og DLN vev er oppsummert i figur 5.
- Sentrifuger huden og DLN prøvene i 5 min ved 450 x g ved 4 ° C og kast supernatanten. Forsiktig resuspender pelleten med 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Samle et lite volum av hver prøve for å telle det totale antall celler isolert fra huden og DLN ved hjelp av et hemocytometer. Legg 0,04% trypan blått for å bestemme cellenes levedyktighet.
8. Blokkering av Non Antigen-spesifikk binding
- Tilsett 10 ug / ml umerket CD16 / CD32 Fc-blokk-antistoff. Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C (kan gå lengre).
- Tilsett 2 ml kaldt 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Sentrifuger prøven i 5 min ved 450 x g ved 4 ° C og kast supernatanten. Forsiktig resuspender pelleten med 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA og holde prøvene på is.
9. Farging Hud og lymfeknute myeloide celler
- Inkuber tidligere blokkert skin og DLN isolerte celler med levende / døde tracker (dvs. 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole eller DAPI), anti-CD45 og anti-CD11b spesifikke antistoffer.
MERKNADER: For å berike myeloide celle subpopulasjoner av interesse, spesielt sjeldne de, CD45 + celler og lymfocytter kan henholdsvis renset fra huden eller utarmet fra DLN av magnetiske kuler tilrettelegging cellesortering. Siden de fleste av celler isolert fra den DLN er CD45 +, bruk av anti-CD45 er ikke obligatorisk. Andre markører kan være inkludert for å identifisere myeloid celle subpopulasjoner av interesse ved positiv eller negativ-gating strategi. I denne protokollen ble myeloide celler rekruttert i DLN beriket ved å utelukke CD8a + celler (hele T-celle kan målrettes ved hjelp av anti-CD3 spesifikt antistoff). - Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørket. Legg 500 pl 1 x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, sentrifuger prøven 5 minutter ved 450 xg ved 4 ° C og kast supernatant. Gjenta vasketrinn to ganger.
- Suspender prøvene med 300 mL 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Overfør hele volumet i en FACS rør gjennom et 35 mikrometer celle sil. Skyll filteret med 100 mL 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Kjør fargede celler i et flowcytometer. Gate leve enkeltceller (DAPI - FSC-W) for å utelukke døde celler og dubletter. Plot CD45 + CD11b + hendelser for huden (Figur 6A) og (CD45 +) CD8a - CD11b + hendelser for DLN (figur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har nylig vist at p-sprøyte injeksjon av immuniserende doser av P. berghei sporozoites i musen huden induserer en suksessiv rekruttering av polymorfonukleære nøytrofile fulgt av betennelses monocytter i huden og DLN 19. Protokollen seksjon som er beskrevet ovenfor viser prosedyren brukt for å kunne isolere levende myeloide celler fra begge vevene etter gjentatte injeksjoner med stort antall av sporozoitter i øret dermis (figurene 1 og 2). I løpet av den første 24 h, DLN (figur 3), og huden på injeksjonsstedet (figur 4) ble isolert og behandlet som oppsummert i figur 5 for å analysere cellulær infiltrasjon av multi-parametriske strømningscytometri. Samlet denne teknikken tillot oss å isolere en gjennomsnittlig 10 4 CD45 + CD11b + og 2,10 4 CD11b + levende enkeltcellerfor henholdsvis huden og DLN. Den akseptable levedyktigheten av ikke-avfalls enkle celler varierte fra 40-70% for huden og 70-90% for DLN. Som vist i figur 6, hyppigheten av myeloide celler i huden (CD45 + CD11b +) og DLN (CD8a - CD11b +) øker sterkt etter intradermal injeksjon av RAS sammenlignet med ikke-infiserte mus.
Figur 1: Jeg ntradermal Injeksjon av Sporozoitter i øret på Mus. (A) Bildet viser intradermal injeksjon av sporozoites i øret pinna av en bedøvet mus. Den ventrale siden av øret er stabilisert med klar tape tidligere plassert under en dissekere mikroskop. Nålen er nøye inn på den dorsale side av øret, under epidermis, med skråkant opp. (B - C) Bilder som viser den dorsale side av øret pinna før (B) og etter (C) intradermal injeksjon på 0,1-0,2 pl av parasitt suspensjon. Et karakteristisk papule (svart pil) er observerbar på injeksjonsstedet på slutten av operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2: Imaging av Sporozoitter avsatt i øret dermis av Mouse (A) Fluorescensmikroskopi viser RAS migrerer fra injeksjonsstedet (indikert med stiplede linjer) i mus huden 15 min etter injeksjon (Scale bar = 60 mikrometer; 10X forstørrelse). Banen av sporozoitter er representert ved den maksimale intensitet projeksjonen av det fluorescerende signal. Grønn og rød fluorescens resvis vise parasitt posisjon i huden i begynnelsen, og etter 10 sek av oppkjøpet. (B) Høyere forstørrelse av RAS (grønn) injiseres i huden (Scale bar = 20 mikrometer; 25X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Drenering Lymph Node Processing (A) Bilde som viser disseksjon av den proksimale auricular DLN etter intradermal injeksjon av Evans blått for demonstrasjonsformål.. Etter cervical forvridning av musen, er halsen desinfiseres med 70% etanol. Et første snitt i den jugulare-carotis område med skarp saks og huden fjernes fra operasjonsfeltet. Snittet er strukket med 2 pinsett for å avsløre DLN som vises grayish i forhold til omkringliggende vev. Bindevev blir deretter forsiktig klemt med pinsett på toppen av DLN og progressivt separeres fra den. Endelig er DLN hentet ved å plassere en pinsett under lymfevev. (B) Bilde som viser den utpakkede DLN i en dråpe PBS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: Ear folie Processing bilder som viser de suksessive trinn for å behandle inokulert øret. (A) Etter halshugging av musen, øret desinfiseres med 70% etanol og fjernet ved hjelp av sterile skarp saks og pinsett. (B - D) Rygg og ventral aspekter av øret er lett skilles ved å knipe og spacing hverandre kuttet avsluttes med to tang. (E) Bilde som viser dorsal og ventral sider ved øret før enzymatisk behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:.. Protokoll Oppsummering Skjematisk fremstilling av de viktigste trinnene for å isolere totale celler fra huden og DLN vev Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: myelogen Cell Befolkning isolert fra Ear Hud og den proksimale DLN Representative FACS plott viser.gating strategi for å analysere myeloid rommet i huden (A) og den DLN (B). CD45 + CD11b + og CD8a - CD11b + celler ble inngjerdet på total live-singlet arrangementer for henholdsvis huden og DLN. For hver tilstand, ble 5 x 10 5 totalt hendelser kjøpt (2 ører og to DLN samlet per prøve). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det perspektivet i stor skala vaksinasjon av mennesker som bruker en hel sporozoitt malaria vaksine, er en av hovedutfordringene for å overvinne for å utvikle optimaliserte ruter og metoder for parasitten administrasjon for å sikre vellykket immunisering og beskyttelse 24,25. Hos mennesker har evalueringen av beskyttende effekt mediert av levende svekkede parasitter (LAP) utført følgende naturlig myggstikk 2, samt intradermal, subkutan 25,26 og IV vaksinasjoner 27. Som rapportert i gnagere 28 og ikke-humane primater 25, IV-administrering av LAP induserer sterkere beskyttende immunresponser i forhold til de ovennevnte ruter. Likevel er ikke-IV administrasjonsveier ved hjelp av nål og sprøyte enda mer egnet for menneskelig massevaksinasjon og det arbeides for tiden med å optimalisere sin beskyttende effekt.
Nyere studier utført på mus viserd, spesielt i tilfelle av ID rute, at avsetningen av et lite volum av sporozoitt suspensjon (rekke 1 pl) på flere injeksjonssteder (4 poeng) signifikant øket parasitt infektivitet sammenlignet med en enkelt inokulering av parasitter fortynnet i større volumer (50 pl) 24. I vårt eksperimentelle system (C57BL / 6 mus - P. berghei), ble fullstendig beskyttelse oppnås etter flere injeksjoner i øret dermis av svært konsentrert suspensjon av parasitter (50.000 RAS i 0,6 mL, 4 injeksjonssteder) 19. I denne sammenheng etablerte vi protokollen beskrevet ovenfor for å analysere mer presist den lokale verten immun respons til immunisering av doser av RAS som mulig for oss å identifisere 2 store myeloide celleundergrupper rekruttert i huden og DLN i respons til parasitten 19.
Multi-parametriske strømnings tillater cytometri nøyaktig identifikasjon og kvantifisering av immuncelleforandringer i sammenheng med vertsresponstil infeksjon 19,20. Isolering av store antall levedyktige celler er derfor viktig å utføre reproduserbare fenotypeanalyser. For dette formål må den enzymkonsentrasjon og varighet av vevsfordøyelse optimaliseres. Faktisk kan lav konsentrasjon av enzymer eller utilstrekkelig inkubasjonstid føre til ufullstendig nedbrytning med lavt utbytte av celler mens langvarig vevsfordøyelse kan resultere i redusert cellelevedyktighet og endring av celleoverflate-antigen ekspresjon 29. Likevel har godt etablerte protokoller ved hjelp av kollagenase behandling er vist å ha marginal innvirkning på detekterbarheten av relevante overflatemolekyler som brukes ofte for fenotypisk analyser 30.
Blant de mange parametre som kan optimalisere kvaliteten av celleisolasjon, er separeringen av den dorsale og ventrale deler av øret hud viktig fordi det gjør det mulig for kollagenase / DNAse for å få tilgang til dermis. I tillegg, kverning huden i småbrikker øker overflatearealet tilgjengelig for enzymene, derfor tillater kortere varighet av fordøyelse. Endelig er bruken av mekanisk dissosiasjon bidrar til å øke utbyttet av celletall for både hud og DLN. Imidlertid kan overdreven dissosiasjon føre til ekstra stress som kan negativt påvirke celle levedyktighet.
Vi favorisert kjøp av levende celler siden fiksering fører til suboptimal flekker, kompliserer æren av sjeldne positive hendelser av interesse (data ikke vist). Videre er diskriminering av døde celler ble mer problematisk. I tilfeller der celle fiksering er nødvendig, vil vi foreslå bruk av Live / DEAD låses død celle flekker.
Ved hjelp av den definerte protokollen, til vi lykkes isolerte myeloide celler infiltrere inn i huden og DLN svar parasitt injeksjon (Figur 6A og B). Vi vanligvis oppnå høyere nivåer av levedyktige enkeltceller fra DLN (70-90%) sammenlignet med denhud (40-70%). Denne forskjellen kan forklares ved den lengre inkubasjonstid er nødvendig for effektiv enzymatisk fordøyelse sammen med ytterligere trinn for mekanisk dissosiasjon for å isolere hudceller (hudlaget separasjon, hakking og sterkere mose).
Til slutt, en viktig parameter for å ta hensyn til ved analyse av vertsrespons til ID injeksjon av sporozoitter er nivået av inflammasjon indusert av både nålestikk og mygg spyttkjertelekstrakt avsetning i huden 19,20. Vi foreslår derfor å injisere ekstra mus med enten 1x PBS alene eller spyttkjertelekstrakter fra samme antall ikke-infiserte mygg å vurdere immunresponsen spesifikt indusert av parasitten. Til sammen, anbefaler vi å dissekere infiserte mygg med høy parasittbelastning i spyttkjertlene og for å filtrere parasitten suspensjon for å begrense mengden av mygg materiale som kan deponeres i huden.
jegn sammendrag, isolering av myeloide celler fra huden og DLN gjennom den beskrevne protokoll gir en pålitelig analyse for å vurdere dynamiske celleforandringer i løpet av inflammatoriske respons på infeksjon Plasmodium og kan utvides til andre patogener som sendes inn i huden til verten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Patricia Baldacci, Vanessa Lagal og Sabine Thiberge for kritisk lesing, Irina Dobrescu og Sabine Thiberge om hjelp i å ta bilder og Pauline Formaglio for undervisning in vivo avbildning av sporozoitt motilitet i musen huden. Vi vil også gjerne takke Marek Szatanik og Senter for Produksjon og infeksjon av Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) for mygg oppdrett. Denne studien ble støttet av AXA forskningsfond og midler fra Laboratoire d'Excellence "Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases" (gi no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
