Abstract
Malariainfektion börjar när sporozoit stadiet av Plasmodium ympas in i huden hos en däggdjursvärd genom ett myggbett. Den mycket rörliga parasiten inte bara når levern att invadera hepatocyter och förvandlas till erytrocyt-infektiösa formen. Det migrerar också in i huden och den proximala lymfkörteln dränering av injektionsstället, där det kan kännas igen och bryts ned av inhemska och / eller rekryterade myeloidceller. Intravital avbildning rapporterade tidigt rekrytering av ljust fluorescerande Lys-GFP positiva leukocyter i huden och samspelet mellan sporozoiter och CD11c + celler i dränerande lymfkörteln. Vi presenterar här ett effektivt förfarande för att återhämta sig, identifiera och räkna de myeloida cellgrupper som rekryteras till mushud och dränerande lymfkörteln efter intradermal injektion för immunisering doser av sporozoiter i en musmodell. Fenotypisk karaktärisering med hjälp av multi-parametrisk flöde ger cytometryen tillförlitlig analys för att bedöma tidiga dynamiska cellförändringar under inflammatoriska svaret på Plasmodium infektion.
Introduction
Malaria är en av de dödligaste infektionssjukdomar i världen och dödade mer än en halv miljon människor per år. Infektion av Plasmodium, det orsakande medlet av sjukdomen, börjar med en pre-erytrocyt (PE) fas. Under denna fas, sporozoiter injicerade in i värd huden genom en kvinnlig Anopheline mygga når levern via blodströmmen och differentieras inne hepatocyter in i parasitformer som infekterar röda blodkroppar och orsaka symptomen på sjukdomen.
PE stadier av Plasmodium utgör en privilegierad mål för anti-malaria vaccination. Faktum är levande försvagade vacciner mot dessa stadier, såsom strålning dämpas sporozoiter (RAS), har genetiskt gripits parasiter (GAP) eller kemoprofylax och sporozoiter (CPS) visat sin förmåga att skydda både gnagare och mänskliga värdar 1-9. I gnagare modell, de flesta vaccinationsstudier genomfördes med användning av intravenös immunisering, Vilket är den högsta standarden när det gäller skyddande effekt. Däremot har beskrivningen av en hud skede och vikten av huden associerade dränerande lymfkörteln (DLN) för att framkalla skydd ändrat vår uppfattning av PE-fasen och betonade vikten av intradermalt injektionsstället. Intravital avbildning av P. berghei-sporozoiter injicerade in i huden hos gnagare har visat att endast ~ 25% av inokulatet når levern via blodomloppet. De återstående ~ 75% fördelas mellan den proximala DLN (~ 15%) och huden (~ 50%) 10,11, där en liten del kan förändra och förblir levande för veckor i hudceller 12,13. Dessutom senare studier beskrev att inrättandet av en effektiv skyddande immunitet efter intradermal immunisering sker främst i huden-DLN, där parasit specifika CD8 + T-celler aktiveras och endast marginellt i mjälten eller levern-DLN-er 14,15.
Medande flesta studier har koncentrerat sig på karaktärisering av effektorceller inblandade i upprättandet av skyddande immunsvar, är mycket mindre känt om ödet för levande försvagade parasiter injiceras i huden, särskilt deras interaktion med det medfödda immunförsvaret. I synnerhet, är karakterisering av antigenpresenterande celler som är involverade i parasitantigenupptag, bearbetning och presentation till CD8 + T-celler av avgörande betydelse, att veta att PE-antigen förvärv kan förekomma både i huden och DLN fack. Tidigare intravital imaging studier beskrev ett tidigt inflöde av ljust fluorescerande Lys-GFP-positiva celler i huden efter en smittsam myggbett 16 medan tidiga växelverkan mellan sporozoiter och dendritiska celler observerades i DLN 10,17. På senare tid har det rapporterats att sporozoiter inympade i huden av myggor ökar rörligheten både dendritiska och regulatoriska T-celler i hudenmöss, medan en minskning antalet antigenpresenterande celler observerades i DLN 18.
Vi syftar till att identifiera och kvantifiera mer exakt leukocyter delmängder rekryteras i huden och motsvarande DLN liksom de interagerar med parasiten efter intradermal injektion för immunisering doser av RAS 19. I detta sammanhang, isolerade vi myeloidceller (CD45 + CD11b +) från både vävnader och kännetecknas subpopulationer av intresse genom flera = parametrisk flödescytometri. I överensstämmelse med immunsvaret beskrivs i ett tidigt skede av Leishmania major hudinfektion 20, den primära värden svar på sporozoit injektion består av en successiv rekrytering av polymorfonukleära neutrofiler (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) följt av inflammatoriska monocyter (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) som identifieras på grundval av differential uttryck av de Ly6G och Ly6C ytmarkörer.
Vi beskriver här ett protokoll för att isolera myeloidceller från mus hud och DLN efter intradermal injektion för immunisering doser av RAS extraherade från infekterade myggor spottkörtlar. Reproducerbara intradermala injektioner och vävnadsbehandling är viktiga steg för att kvantifiera fenotypiska förändringar av infiltrerande cellpopulation inom infekterade vävnader. Det tillvägagångssätt som beskrivs i detalj nedan ger en tillförlitlig analys för att bedöma den hud och DLN inflammatoriska svaret på Plasmodium parasit och kan utvidgas till olika experimentella system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av kommittén för Pasteurinstitutet och av den lokala etiska kommittén djurförsöks (Etiska kommittén IDF-Paris 1, Paris, Frankrike, avtalsnummer: 2012-0015) och genomförs i enlighet med gällande riktlinjer och regler.
1. Material och reagens
- Använd kvinnliga anopheles stephensi myggor (Sda500 stam) som livnär sig på infekterade möss 3-5 dagar efter uppkomst och bak som beskrivits tidigare 21.
- Använd parasiter Plasmodium berghei ANKA klon som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) genen under kontroll av den konstitutiva Heat Shock Protein 70 (HSP70) promotor. Detta ger ljusa fluorescens hela parasitens livscykel 22.
- Använd kvinnliga C57BL / 6JRj möss (7 veckor gamla).
OBS: Samtliga reagenser som används i den beskrivna protokollet listas i T kunna of Materials / utrustning.
- Mellan 18-25 dagar efter infektionsblodmjöl, samla och kall söva myggor i en 15 ml rör på is som beskrivits tidigare 21. Noggrant överföra dem på en petriskål genom att vända röret. Bibehålla insekter på is och utsätta myggor till en 12 krad dos av γ- eller röntgenstrålning.
- Isolera försvagade sporozoiter från bestrålade mygga spottkörtlarna som tidigare beskrivits 21. Samla infekterade salivkörtlar i en liten volym (cirka 15 fil) av 1x Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) på is och försiktigt krossa dem att frisätta sporozoiter.
OBS: injektion av en högkoncentrerad parasit suspension i en liten volym vara kritisk, är det därför viktigt att skörda ett tillräckligt antal spottkörtlarna från ett stort antal förvalda väl infekterade myggor, vilket framgår av deras robusta uttryck avgrön-fluorescens. - Filtrera sporozoit suspensionen genom ett 35 | im cellfilter cap anpassas till en låg vidhäftning 1,5 ml mikrocentrifugrör i syfte att eliminera klumpar och mygga skräp.
- Räkna det totala antalet isolerade sporozoiter såsom beskrivits tidigare 21 och justera koncentrationen av parasit suspensionen med kall 1x DPBS för att erhålla 83.000 sporozoiter / il. Förvara parasiter på is samtidigt som man fortsätter nästa steg.
- Samla motsvarande antal salivkörtlar från oinfekterade myggor som kommer att användas som negativ kontroll och bearbeta provet som beskrivs i steg 2.2 och 2.3. Späda provet såsom anges ovan för erhållande av liknande koncentration av spottkörtelextrakt i suspensionen.
OBS: Sporozoiter kan lagras på is under högst två timmar. Emellertid idealt de injiceras inom en timme efter krossning spottkörtlarna.
3. Injektion av Sporozoiter in i Dermal Layer Örats
- Söva djuren genom intraperitoneal injektion av ketamin (50 mg / kg) / xylazin (5 mg / kg) blandningen. Vänta 5-8 minuter för musen för att vara i ett tillstånd av medvetslöshet och tillämpa oftalmologiska salva till ögonen för att förhindra hornhinnan torkning. Utvärdera anestesidjupet genom att utföra en mild tå nypa på båda bakre fötterna.
OBS: Dosen av anestesi varar mindre än 20 minuter, så nästa steg måste göras snabbt. - Stabilisera ytterörat av musen genom att fastställa den ventrala sidan med genomskinlig tejp som tidigare hänförts till ett stereomikroskop (Figur 1A). Tryck försiktigt örat för att undvika skador på kärl.
- Ladda en 10 ul spruta / 35 gauge avfasade nål med 0,6 pl resuspenderade parasiter 10.
- Leverera sporozoit suspension i 4 injektionsställen (0,15 l per plats) genom att försiktigt föra in nålen på ryggsidan av örat (Figur 1A), under överhuden, medvinkel upp, var noga med att undvika blodkärl. Låt nålen kvar i dermis för några sekunder för att förhindra backflöde av injicerings innan du tar bort den. Observera en karakteristisk papule vid varje injektionsställe vid slutet av förfarandet (figur 1B och 1C).
- Efter injektion, försiktigt bort örat från bandet.
- Injicera den kontralaterala örat med samma dos av parasiter genom att följa stegen 3,2-3,4.
- Injicera två ytterligare möss med antingen 0,6 | il av 1 x DPBS eller 0,6 | il av 1 x DPBS + salivkörtelextrakt från oinfekterade myggor för att utvärdera det inflammatoriska svaret som förmedlas av injektionen ensam och avsättningen av mygga material i dermis.
- Övervaka musen återhämtning från anestesi innan du sätter tillbaka den i buren.
OBS: Det korrekta sporozoit avsättning i huden kan övervakas genom fluorescensmikroskopi (figur 2A och 2B), Varvid musen som framställts såsom beskrivits previsously 23.
4. Hud och dränerande lymfkörteln Dissection
- Förbereda standardmedium (SM) enligt följande: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) kompletterad med 400 U / ml kollagenas och 50 | ig / ml deoxiribonukleas (DNas) .
- Förbered två 6 väl flatbottnade vävnadsodlingsplattor på is med 4,5 ml SM + 70 ìm cell sil per brunn för DLN prover (Plate A) och 4,5 ml SM per brunn för hudprover (Plate B).
- Vid den önskade tidpunkt efter sporozoit-inokulering, djupt söva musen genom intraperitoneal injektion av ketamin (125 mg / kg) / xylazin (12,5 mg / kg) blandningen före cervikal dislokation. Se till att musen visar tecken på klinisk död och starta dissektion omedelbart.
OBS! Kinetik myeloid cellrekrytering kan undersökas vid olika tidpunkter efter injektionvsnitt (dvs 2 timmar, 4 timmar och 24 timmar som tidigare beskrivits 14). - Desinficera inokulerade öra och den motsvarande halsområdet med 70% etanol för att minska risken för kontaminering.
- Använda steril sax och pincett, aseptiskt dissekera proximala öron DLN utan att samla den omgivande fett. Utför en första snitt i jugulo-carotidian sulcus och ta bort hår från operationsområdet. Sträck snittet med 2 pincett för att exponera DLN som visas gråaktig jämfört med den omgivande vävnaden.
- Nyp den bindväv försiktigt på toppen av DLN med pincett för att underlätta dess avlägsnande. Extrahera DLN genom att placera en tång under lymfoid vävnad (Figur 3A och 3B). Placera DLN i en brunn som innehåller 4,5 ml SM + 70 ìm cell sil (Plate A).
- Skörda hela ympade örat med steril vassa sax och pincett (Figur 4A). separåt rygg och ventrala delar av örat genom att klämma och avstånd isär snittet slutar med två pincett (Figur 4B - 4e). Placera dem i en brunn som innehåller 4,5 ml SM (Plate B) att se till att båda vävnaderna är helt nedsänkt i mediet.
NOTERA: För att förbättra tillförlitligheten av experimentet och öka antalet celler av intresse, pool 2 injicerade öronen eller 2 DLN-er från samma mus per prov. - Skörd och process parallellt öronen och DLN-er hos möss ympade med antingen 1x DPBS eller spottkörtelextrakt. Inkludera ytterligare 2 örat och lymfkörtelprover skördats från en naiv mus för negativa och enkla kontroller färgning ersättning.
5. Cell Isolering från lymfkörtlar
- Inkubera lymfkörtlarna (platta A) vid 37 ° C + 5% CO2 under 15 min under försiktig omrörning. Lägga till 10 mM slutlig etylendiamintetraättiksyra (EDTA) per brunn för att neutralisera kollagenas och DNas actisamheten. Utför nästa steg på is.
- Dissociera lymfkörtlar som använder den övre änden av en 5 ml sprutkolv. Tryck i cirkulära rörelser mot silen tills allt som återstår är vita bindväv.
- Skölj cellfilter två gånger med 500 | j, l 1x DPBS + 2% fetalt bovint serum (FBS) + 2 mM EDTA. Överföra hela volymen av brunnen i en 15 ml tub.
- Skölj väl två gånger med 500 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA och överföra volym i 15 ml rör. Hålla rören på is.
6. Cell Isolering från Skin Örats
- Inkubera öron broschyrer (Plate B) vid 37 ° C + 5% CO2 under 1 h under försiktig skakning.
OBS: Efter 20 min inkubation, skär örat broschyrer med sax i små bitar för att underlätta vävnads matsmältningen och sätta provet tillbaka i inkubatorn för resterande 40 min. Enskilda celler kan observeras i mediet vid slutet av inkubationstiden. - Tillsätt 10 mM slutlig EDTA per brunn för att neutralisera kollagenas och DNas aktiviteter. Utför nästa steg på is.
- Överföra öronvävnadsfragment och hela volymen av medium i en ny brunn innehållande ett 70 | im cellfilter med användning av en 1 ml pipett. Klipp 2 till 3 mm från slutet av spetsen för att lättare samla öronvävnadsfragment.
- Dissociera öronvävnadsfragment med hjälp av den övre änden av en 5 ml sprutkolv. Tryck i cirkulära rörelser mot silen tills allt som återstår är vita bindväv.
- Skölj cell silar två gånger med 500 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Överföra hela volymen av den väl in i en 50 ml-rör genom ett 70 | im cellfilter.
- Skölj väl med 500 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA och överföra volym i 50 ml rör. Hålla röret på is.
OBS: De olika stegen för att isolera totala celler från huden och DLN-vävnader är sammanfattade i Figur 5.
- Centrifugera huden och DLN-prover under 5 minuter vid 450 xg vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Försiktigt resuspendera pelleten med 300 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Samla in en liten volym av varje prov för att räkna det totala antalet celler som isolerats från huden och DLN med hjälp av en hemocytometer. Lägg 0,04% trypanblått för att bestämma cellviabiliteten.
8. Blockering av icke-antigen-specifik bindning
- Tillsätt 10 mikrogram / ml omärkt CD16 / CD32 Fc-blocket antikropp. Inkubera 20 minuter vid 4 ° C (kan gå längre).
- Tillsätt 2 ml kall 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugera provet under 5 min vid 450 xg vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Försiktigt resuspendera pelleten med 300 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA och hålla proverna på is.
9. Färgning Hud och Lymph Node myeloidceller
- Inkubera tidigare blockerade skidn och DLN isolerade celler med Live / Dead tracker (dvs. 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol eller DAPI), anti-CD45 och anti-CD11b specifika antikroppar.
OBS: För att berika myeloid cellpopulationer av intresse, särskilt ovanliga sådana, CD45 + celler och lymfocyter kan respektive renas från huden eller utarmat från DLN genom magnetisk pärla lätta cellsortering. Eftersom de flesta av cellerna som isolerats från DLN är CD45 +, användning av anti-CD45 är inte obligatoriskt. Andra markörer kan inkluderas för att identifiera myeloida cell subpopulationer av intresse genom positiv eller negativ-slussning strategi. I detta protokoll ades myeloidceller rekryteras i DLN berikas genom att utesluta CD8a + celler (kan hela T-cellfacket riktas genom användning av anti-CD3-specifik antikropp). - Inkubera 30 minuter vid 4 ° C i mörker. Tillsätt 500 | il 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifugera provet 5 min vid 450 xg vid 4 ° C och kasta supernatant. Upprepa tvättsteg två gånger.
- Resuspendera prover med 300 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Överföra hela volymen i en FACS rör genom en 35 ìm cell sil. Skölj filtret med 100 l 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Köra de färgade cellerna i en flödescytometer. Gate bor enstaka celler (DAPI - FSC-W) för att utesluta döda celler och dubbletter. Tomt CD45 + CD11b + händelser för huden (Figur 6A) och (CD45 +) CD8a - CD11b + händelser för DLN (figur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visade nyligen att nål injektionsspruta för immunisering doser av P. berghei-sporozoiter i mushud inducerar en successiv rekrytering av polymorfonukleära neutrofiler följt av inflammatoriska monocyter i huden och DLN 19. Protokollet avsnitt beskrivs ovan anger det förfarande som används för att framgångsrikt isolera levande myeloida celler från båda vävnader efter flera injektioner av stort antal sporozoiter i örat dermis (figurer 1 och 2). Inom de första 24 h, det DLN (Figur 3) och huden injektionsstället (Figur 4) isolerades och behandlades som sammanfattas i figur 5 för att analysera cellulär infiltration av multi-parametrisk flödescytometri. Sammantaget denna teknik tillät oss att isolera en genomsnittlig 10 4 CD45 + CD11b + och 2,10 4 CD11b + levande enstaka cellerför huden och DLN respektive. Den acceptabla livskraft icke-skräp enstaka celler varierade från 40-70% för huden och 70-90% för den DLN. Som visas i figur 6, frekvensen av myeloidceller i huden (CD45 + CD11b +) och DLN (CD8a - CD11b +) starkt ökar efter intradermal injektion av RAS jämfört med icke-infekterade möss.
Figur 1: Jag ntradermal Injektion av Sporozoiter i örat på mus. (A) Bilden visar intradermal injektion av sporozoiter i ytterörat av en sövd mus. Den ventrala sidan av örat stabiliseras med genomskinlig tejp som tidigare hänförts till ett dissektionsmikroskop. Nålen är noggrant införas på ryggsidan av örat, under epidermis, med den nedåtlutande upp. (B - C) Bilder som visar den dorsala sidan av ytterörat före (B) och efter (C) intradermal injektion av 0,1-0,2 pl av parasit suspensionen. Ett karakteristiskt Papule (svart pil) kan observeras vid injektionsstället vid slutet av operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2: Imaging sporozoiter deponeras i örat dermis i mus (A) Fluorescensmikroskopi visar RAS migrera från injektionsstället (indikeras av streckade linjer) i mushud 15 min efter injektion (Skala bar = 60 um; 10X förstoring). Banan för sporozoiter representeras av maximal intensitet projektion av den fluorescerande signalen. Grön och röd fluorescens reriktat visar parasit position i huden i början och efter 10 sekunder av förvärvet. (B) Högre förstoring av RAS (grön) injiceras i huden (Skala bar = 20 pm, 25X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: dränerande lymfkörteln Processing (A) Bild som visar dissektion av proximala öron DLN efter intradermal injektion av Evans blå för demonstrationssyfte.. Efter halsdislokation av musen, är halsen desinficeras med 70% etanol. En första snitt görs i hals-halsområdet med vassa saxar och huden tas bort från operationsområdet. Snittet sträcks med 2 pincett för att exponera DLN som visas grayish jämfört med den omgivande vävnaden. Den bindväv är sedan försiktigt klämmas med pincett på toppen av DLN och progressivt separeras från det. Slutligen är DLN heras genom att placera en tång under lymfoid vävnad. (B) Bild som visar den extraherade DLN i en droppe PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Ear Skin Processing Bilder som visar de successiva stegen att bearbeta ympade örat. (A) Efter halsdislokation av musen, är örat desinficeras med 70% etanol och avlägsnas med användning av sterila vassa sax och pincett. (B - D) Den dorsala och ventrala aspekter av örat är lätt separeras genom att klämma och spacing isär snittet slutar med två pincett. (E) Bild som visar rygg och ventrala delar av örat före enzymbehandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:.. Protokoll Sammanfattning Schematisk representation av de viktigaste stegen för att isolera totala celler från huden och DLN vävnader Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Myeloid cellpopulation isolerat från örat Hud och proximala DLN Representativa FACS tomter visar.gating strategi för att analysera den myeloida fack i huden (A) och den DLN (B). CD45 + CD11b + och CD8a - CD11b + celler gated på totala levande sing händelser för huden och DLN respektive. För varje tillstånd, var 5 x 10 5 totala händelser förvärvade (2 öron och två DLN poolade per prov). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I perspektivet av storskalig vaccinering av människor som använder en hel sporozoit malariavaccin, är en av de största utmaningarna att övervinna för att utveckla optimerade rutter och metoder för parasit förvaltningen för att säkerställa framgångsrik immunisering och skydd 24,25. Hos människor, har utvärderingen av skyddande effekt medieras av levande försvagade parasiter (LAP) utförts efter naturlig myggbett 2, såväl som intradermal, subkutan 25,26 och IV immuniseringar 27. Såsom rapporteras i gnagare 28 och icke-mänskliga primater 25, inducerar iv administrering av LAP starkare skyddande immunsvar jämfört med de ovannämnda linjer. Ändå fortfarande mer lämpade för massvaccinering human icke-IV administrations använder nål och spruta och insatser för närvarande görs för att optimera deras skyddande effekt.
Nya studier på möss visard, i synnerhet i fallet av ID rutten, att avsättningen av en liten volym av sporozoit-suspension (intervallet 1 | j, l) i multipla injektionsställen (4 poäng) signifikant ökad parasit infektivitet jämfört med en enda inokulation av parasiter utspädd i större volymer (50 | j, l) 24. I vår experimentella system (C57BL / 6 mus - P. berghei), var fullständigt skydd uppnås efter flera injektioner i örat dermis av högkoncentrerad suspension av parasiter (50.000 RAS i 0,6 pl, 4 injektionsställen) 19. I detta sammanhang har vi etablerat det protokoll som beskrivits ovan för att mer exakt analysera den lokala värden immunsvar mot immunisering doser av RAS som tillät oss att identifiera 2 stora myeloida cellgrupper rekryteras i huden och DLN som svar på parasiten 19.
Multi-parametrisk flöde tillåter cytometry korrekt identifiering och kvantifiering av immuncellförändringar i samband med värdsvarför infektion 19,20. Isolering av stort antal livskraftiga celler är därför avgörande att utföra reproducerbar fenotypisk analys. För detta ändamål måste enzymkoncentrationen och varaktigheten av vävnad matsmältningen optimeras. I själva verket kan låg koncentration av enzymer eller otillräcklig inkubationstid leda till ofullständig uppslutning med låg avkastning av celler medan långvarig vävnad matsmältning kan leda till minskad cellviabilitet och förändring av cellytantigen uttryck 29. Ändå har väletablerade protokoll använder kollagenas behandling visat sig ha en marginell inverkan på detekterbarheten relevanta ytmolekyler som ofta används för fenotypisk analys 30.
Bland de många parametrar som kan optimera kvaliteten på cellisolering, är separationen av dorsala och ventrala delar av örat hud viktigt, eftersom det gör det möjligt för kollagenas / DNAse för att komma åt dermis. Dessutom mals huden i småbitar ökar ytarean tillgänglig för de enzymer, därför tillåta kortare varaktighet för matsmältningen. Slutligen är användningen av mekanisk dissociation bidrar till att öka utbytet av cellantalet för både hud och DLN. Däremot kan överdriven dissociation orsaka ytterligare stress som negativt kan påverka cellernas livskraft.
Vi föredrog förvärv av levande celler eftersom fixering leder till suboptimal färgning, vilket komplicerar åtskillnad av sällsynta positiva händelser av intresse (data visas ej). Dessutom diskriminering av döda celler var mer problematisk. I de fall där det krävs cellfixering, föreslår vi användning av LIVE / DEAD ställbara döda cell fläckar.
Med hjälp av definierade protokoll, att vi framgångsrikt isolerade myeloidceller infiltrerar in i huden och DLN svar parasit injektion (figur 6A och B). Vi får oftast högre nivåer av livskraftiga enstaka celler från DLN (70-90%) jämfört medhuden (40-70%). Denna skillnad kan förklaras av den längre inkubationstiden behövs för effektiv enzymatisk digerering tillsammans med ytterligare stegen mekanisk dissociation för att isolera hudceller (hud skiktseparation, hackning och starkare mäskning).
Slutligen är en viktig parameter att ta hänsyn till när man analyserar värd svar på ID-injektion av sporozoiter nivån av inflammation som induceras av både nål insättning och mygga spottkörtelextrakt nedfall i huden 19,20. Vi föreslår därför att injicera ytterligare möss med antingen 1 x PBS enbart eller salivkörtelextrakt från samma antal icke-infekterade myggor för att utvärdera immunsvaret specifikt induceras av parasiten. Sammantaget rekommenderar vi att dissekera infekterade myggor med hög parasit belastning i spottkörtlarna och att filtrera parasiten fjädring för att begränsa mängden mygga material som kan deponeras i huden.
jagn Sammanfattningsvis ger isolering av myeloida celler från huden och DLN genom den beskrivna protokollet en tillförlitlig analys för att bedöma dynamiska cellförändringar under inflammatoriska svar på Plasmodium infektion och kan utvidgas till andra patogener som överförs in i huden hos värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Patricia Baldacci, Vanessa Lagal och Sabine Thiberge för kritisk läsning, Irina Dobrescu och Sabine Thiberge för hjälp med att ta bilder och Pauline Formaglio för undervisning in vivo avbildning av sporozoit rörlighet i mushud. Vi vill också tacka Marek Szatanik och Centrum för Produktion och infektion av Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) för mygga uppfödning. Denna studie stöddes av AXA Research Fund och medel från Laboratoire d'Excellence "integrativ biologi av Emerging Infectious Diseases" (bevilja nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
