Dieses Verfahren beschreibt , wie Cytochrom c zu kapseln (cyt. C) in Kieselsäure (SiO 2) Sol-Gele, Verfahren diese Gele bioaerogels zu bilden, und diese bioaerogels verwenden , um schnell Stickstoffmonoxid (NO) durch eine Gasphasenreaktion zu erkennen. Diese Art von Protokoll kann bei der zukünftigen Entwicklung von Biosensoren oder andere bioanalytische Geräte unterstützen.
Anwendungen wie Sensoren, Batterien und Brennstoffzellen wurden durch die Verwendung von hochporösen Aerogelen verbessert, wenn funktionelle Verbindungen innerhalb der Aerogele eingekapselt sind. Jedoch nur wenige Berichte über Proteine in Sol-Gelen einkapselt, die verarbeitet werden Aerogele zu bilden, existieren. Ein Verfahren zum Einkapseln von Cytochrom c (cyt. C) in Siliciumdioxid (SiO 2) Sol-Gele , die überkritisch verarbeitet werden bioaerogels mit Gasphasenaktivität für Stickstoffmonoxid (NO) zu bilden , dargestellt. Cyt. C wird einem gemischten Kieselsol unter kontrollierten Proteinkonzentration zugegeben und Festigkeitsbedingungen puffern. Das Sol Mischung wird dann geliert und die Flüssigkeit in die Gelporen Füllen wird durch eine Reihe von Lösungsmittelaustausch mit flüssigem Kohlendioxid ersetzt. Das Kohlendioxid wird auf seinen kritischen Punkt gebracht und entlüftet trockenen Aerogele mit cyt zu bilden. C eingekapselt. Diese bioaerogels sind mit UV-VIS-Spektroskopie ein gekennzeichnetd Zirkulardichroismus-Spektroskopie und kann verwendet werden, um die Anwesenheit von Gasphasen Stickstoffmonoxid zu detektieren. Der Erfolg dieses Verfahrens beruht auf Regulieren des cyt. C die Konzentration und die Pufferkonzentration und erfordert keine andere Komponenten wie Metallnanoteilchen. Es kann möglich sein, andere Proteine machen dieses Verfahren wichtig für die Entwicklung bioanalytische Geräte mögliche zukünftige Verwendung eines ähnlichen Ansatz zu verkapseln.
Cytochrom – c (Cyt. C) ist ein Schlüsselelektronentransferproteins in der Zellatmung Reaktionen des Körpers beteiligt. Es wurde in die Apoptose, eine kontrollierte Form des Zelltods, und es kann eine solche kleine detektieren toxische Moleküle wie Stickoxid und Kohlenmonoxid 1-3 einbezogen werden gezeigt. Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Vorgänge im Nerven, Herz-Kreislauf nehmen, und das Immunsystem. Während cyt c . Typischerweise eine wässrige Umgebung auf einen pH-neutral gepufferte Werte erfordert strukturell intakt und aktiv bleiben, hat die Forschung , dass cyt gezeigt. C seine Struktur und Funktion in festen Materialien , bekannt als Aerogele unter bestimmten Bedingungen 4-9 beibehalten kann.
Aerogele sind hochporöse Materialien oft gebildet durch Sol-Gel-Metalloxide Synthetisieren (Während Metalloxid Aerogele sind sehr häufig, Kohlenstoff und andere Arten von Aerogelen synthetisiert. Ein Beispiel hierfür ist InP aerogels) 10 und diese Sol-Gele derart Trocknen daß die poröse feste Matrix 11-14 unverändert. Alle der Poren in fester Aerogele führen in viel Aerogele Bereich zur Verfügung zu Oberfläche äußerst nützlich für alle Anwendungen, bei denen Oberflächenreaktionen wichtig sind. Wenn chemische oder biochemische Funktionalität innerhalb des Aerogels Nanoarchitektur zusammengesetzt ist, wurde gezeigt, dass die physische Porosität und verbesserter Oberfläche der Aerogele Sensoren zu verbessern, sowie Elektroden zur Batterie, Brennstoffzelle und supercapacitor Anwendungen 11,15-23 . Um Aerogele in einer Weise zu trocknen, dass die poröse feste Matrix unverändert lässt, ist es typisch, das Lösungsmittel, das in den Poren nach dem Sol-Gel-Synthese durch überkritische Lösungsmittelextraktion bleibt zu entfernen. Jede Pore collapse, die aus dem Gel als Lösungsmittel verdampft durch Oberflächenspannungskräfte verursacht werden, da in überkritischen Trocknen eine Flüssigkeit-Dampf-Grenzfläche nie Formen minimiert.
<p class="jove_content"> Es gibt viele Berichte von Häm Proteine wie cyt. c in Sol-Gel eingekapselt ist , die gehalten wurden nass oder die getrocknet wurden bei Umgebungsbedingungen 24-30. Berichte über Einkapseln Biomolekülen in Sol-Gele, die dann getrocknet werden kritisch Aerogele aufgrund der notwendigen Verarbeitung seltener sind zu bilden, die auf die Struktur vieler Proteine nachteilig sein kann. Im Falle von cyt. C, bestimmte Bedingungen ermöglichen es , die Fähigkeit von cyt. C zu halten , um Gasphasen Stickstoffmonoxid innerhalb Aerogele zu erkennen und darauf zu reagieren. Einmal im Aerogel stabilisiert, die hochwertige Porenstruktur des Aerogels erleichtert die Reaktion zwischen cyt. C und Stickoxid – 4,8,9. Cyt. C kann zunächst innerhalb Aerogele eingekapselt werden , indem sie in mehreren Schichten um Gold oder Silber – Nanopartikel in Lösung 4-8 zuordnen. Diese mehrschichtige Aufbauten dienen dazu, das Protein in der Aerogel-Matrix zu schützen. In der jüngsten Approach , die wir entwickelt haben, wenn die Proteinkonzentration und Pufferstärke werden zusammen mit anderen Synthesebedingungen gesteuert, cyt. c behält Integrität innerhalb der Aerogele auch ohne Metallnanopartikel anfängliche Assoziation 9.Die Synthese beginnt wie viele Aerogel Synthesen beginnen mit Silica Sol-Gel-Vorstufen für einen bestimmten Zeitraum zu mischen. Es ist nach einer bestimmten Zeit das Mischen dass cyt. C als eine gepufferte Lösung in das Gemisch zugesetzt wird. Gelierung erfolgt dann eine poröse Kieselsäure feste Struktur zu bilden, in dem die Poren gefüllt sind, mit Wasser, Methanol, verbleibenden Reaktanden und Nebenprodukten. Diese Flüssigkeit, die die Poren füllt sich mit verschiedenen Lösungsmitteln ausgespült durch eine Reihe von Lösungsmittelaustausch werden kann, werden die letzten Austausch mit flüssigem Kohlendioxid innerhalb eines kritischen Punkt Trocknungsvorrichtung unter gehalten bei niedriger Temperatur. Bringen des Gels über der kritischen Temperatur (31,1 ° C) von Kohlendioxid erleichtert die Bildung alsupercritical Flüssigkeit im Inneren des unter Druck stehenden Vorrichtung, die entlüftet werden kann trocken, hochporöse Aerogele zu bilden. Die relativ niedrige Temperatur für Kohlendioxid benötigt, um ein überkritisches Fluid zu bilden, ist vorteilhaft im Vergleich zu anderen Lösemitteln, da es das Protein unterhalb einer Temperatur, bei der es hält denaturieren könnten.
Unsere Metallnanoteilchen freien Ansatz zur Verkapselung cyt. C in Aerogele ist vorteilhaft , da es ein einfaches Verfahren ist, die auch auf die Entwicklung eines allgemein anwendbares Protokoll zum Einkapseln anderer Proteine führen kann. Viele Proteine können nicht mit Metall – Nanopartikel in der gleichen Weise interagieren , die cyt. C hat und Metallnanopartikelsynthese oder Beschaffungs fügt zusätzliche Zeit und Kosten für das Verfahren. Die wenigen Berichte über Einkapseln Proteine in Aerogele, um die Entwicklung dieses Verfahrens ein wichtiger Schritt nach vorne, eine allgemeinere Verfahren zum Einkapseln von anderen Proteinen in Aerogele zu finden, dass ich helfen kann,n potentielle zukünftige bioanalytische Geräte.
Das Protokoll Abschnitt dieses Manuskript beschreibt , wie Kieselsol-Gele zu synthetisieren, kapseln cyt. C in diese Sol-Gele, trocknen diese Komposit – Sol-Gel – Aerogele zu bilden, zeichnen diese bioaerogels mit UV-Vis und Circulardichroismus – Spektroskopie und die Anwesenheit erfassen von Gasphasen Stickoxid mit diesen bioaerogels. Cyt. C wurde in Aerogele erfolgreich eingekapselt wenn zuerst in 4,4-70 mM wässrige Lösungen von Phosphatpuffer gelöst. Jedoch optimierte Proteinstruktur in Aerogelen wurde , wenn 40 mM Phosphat – gepufferte Lösungen von cyt Verkapselung führt gefunden. C Herstellung loaded Aerogel cyt. C – Konzentrationen im Bereich von 5 bis 15 & mgr; M 9. Daher angesichts der Protokoll ist unten Aerogele zu synthetisieren unter Verwendung von 40 mM Phosphat – gepufferte Lösungen von cyt. C in einer geladenen cyt resultiert. C – Konzentration in den Aerogelen von 15 uM. </ P>
Wie beschrieben, hat diese Vorgehensweise konsequent tragfähige cyt hergestellt. C innerhalb Aerogele eingekapselt. Die Konzentration des cyt. C innerhalb der Aerogele können , können 4,4 bis 70 mM Phosphat ohne schwere nachteilige Wirkungen auf die Protein Lebensfähigkeit variiert werden innerhalb der Aerogele eingekapselt 5 bis 15 um , und die Pufferkonzentration des anfänglichen cyt. C Lösung variiert werden. Doch die Spitzenmitte und Peakbreite des charakteristischen cyt. C Soret-Bande in Aerogele am nächsten sind , was sie sind für cyt. C in Lösung , wenn cyt. C in Aerogele aus Lösungen von 40 mM Puffer 9 eingekapselt ist.
Die Synthese des cyt. C -SiO 2 Aerogele wird im Alter von einigen der Ausgangsreagenzien beeinflusst. Methanol, Tetramethoxysilan und Ammoniumhydroxidlösung sind hygroskopisch und sollte alle ein bis zwei Monate ausgetauscht werden. Die erhöhte Wasser, das nach oben baut indiese Reagenzien im Laufe der Zeit wirkt sich auf die Gel-strukturelle Merkmale und die Sol-zu-Gel-Übergangszeit.
Wenn überkritische Trocknung durchgeführt wird, die kritischen Transfer Bootes Punkt Trocknungsvorrichtung kann dick, 1 cm Durchmesser Gele bis achtzehn 0,5 cm halten. Wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, sollte eine bestimmte Füll- und Entleerungs verfahren werden, um Kohlendioxid in die Sol-Gel zu übertragen. Es ist wichtig, dass zu Beginn der Ablaufprotokoll zu beachten, das Entwässern Mischung von Kohlendioxid und Aceton fließt bei einer so hohen Geschwindigkeit, die das Ablaßrohr steif friert mit Feuchtigkeit auf der Außenseite zu Eis kondensiert. Die Mischung Ablassen aus etwas Wasser enthält, da das Aceton nicht wasserfrei ist und dieses Wasser kann gefrieren gelegentlich in einem Ausmaß, dass das Ablaufrohr tatsächlich verstopft. Es ist notwendig, für solche Verstopfungen zu beobachten und zu einem Stillstand der Strömung hört. Das Ablassventil sollte für ein paar Minuten geschlossen werden, so dass die Clog schmilzt, wenn eine Verstopfung erkannt wird. Imim schlimmsten Fall, wenn das Ablassventil nicht geschlossen ist, kann eine Verstopfung so viel Druck bewirken, dass der Ablaufschlauch knallt weg gewaltsam den Apparat aufzubauen, dass. Nach den ersten paar Ablaufzeiten wird sich die Mehrheit der Aceton wurde aus der Apparatur gespült, und das Auftreten von nassen Eisbrocken dramatisch sinken. Die Entladung wird ähnlich progressiv Trockeneis als die Trockenlegung Protokoll mit restlichem Nachweis von Aceton Gegenwart (wie Duft) immer nicht nachweisbar durch das Ende des Trockenlegung Prozess wird fortgesetzt.
Nachdem das Kohlendioxid in der Vorrichtung von der Flüssigkeit auf überkritische Fluid und der Entlüftungsvorgang begonnen hat , übergegangen ist, ist es notwendig , mindestens 45 min die Flüssigkeit freizugeben , mit einer langsamen Geschwindigkeit über als 9 in dem Verfahren angegeben. Eine höhere Geschwindigkeit der Freisetzung kann die Lebensfähigkeit von cyt verringern. C innerhalb der Aerogele und die Aerogele selbst brechen tatsächlich (wie in Abbildung 9 gezeigt) auseinander , wie the Fluid strömt aus den Gelen zu entkommen. In der Regel, auch wenn die Aerogele intakt bleiben, nachdem das Gerät Tür zu öffnen, ist es wichtig, sie sorgfältig und schonend zu behandeln, da sie spröde sind und leicht brechen kann.
Die Steuer Kieselgele die neben dem cyt gegossen werden. C -SiO 2 Gele werden nach dem überkritischen Trocknung verwendet , um festzustellen , ob der Kohlendioxidübertragung in den Gelen erfolgreich war. Manchmal ist die cyt. C -SiO 2 Gele können trüb erscheinen und es ist wichtig , zu bestimmen , ob dies zu einer unvollständigen Lösungsmittel Übertragung zurückzuführen ist oder ob es kann mit der Konzentration des cyt. C zu tun , oder innerhalb der Gele eingekapselt Puffer. Wenn die Kieselgele ohne cyt. C erscheinen eine homogene, durchscheinendes Aussehen im ganzen zu haben, kann dies als Beweis dafür genommen werden , dass das Lösungsmittel Transfer vollständig , selbst wenn die cyt aufgetreten. C -SiO 2 Gele haben eine gewisse Trübung zu ihnen. Trübungen innerhalb der Kieselgeleohne cyt. c nach dem Trocknen zeigt an, dass einige Aceton innerhalb der Gele während des Entlüftungs blieb.
Wie in dem Protokollabschnitt angegeben ist, müssen wichtige Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden, wenn mit Stickstoffmonoxid (NO) zu arbeiten. Zur Erkennung von NO die Aerogele verwendet wird, ist es notwendig, die Küvette sehr gut zu verschließen und das Gas fließt über die Aerogele in einer Abzugshaube zu erschöpfen. Alternativ kann das ganze Spektrophotometer in einer Abzugshaube Einwirkung NO-Gas zu begrenzen, zusammen mit dem NO-Gaszylinder als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme bewegt werden. Bei Kontakt sofort mit Luft NO, um den hochgiftigen Stickstoffdioxid, Distickstofftetroxid oder beides erzeugen. NO kann auch mit Wasser reagieren auf Hitze und korrosive Dämpfe abgeben. Daher aufrechterhalten Exposition NO kann zu direkten Gewebetoxizität.
Wenn die cyt verwenden. C -SiO 2 Aerogele die Anwesenheit von Stickstoffmonoxid zu erfassen, werden die Soret – Bande wird zunächst bei ~ 408 nm und verschiebt sichauf ~ 414 nm in Gegenwart von Stickstoffmonoxid. Nach dem Einschalten wieder zu Stickstoff sollte die Soret-Bande umkehren wieder bei ~ 408 nm zentriert ist. Es kann auch möglich sein , den cyt zu verwenden. C -SiO 2 Aerogele 27 das Vorhandensein von anderen Liganden, wie Kohlenmonoxid zu detektieren.
Verschiedene veröffentlichten Verfahren umfassen einen zusätzlichen Schritt zum Kombinieren Gold oder Silber – Nanopartikel mit cyt. C in Lösung , bevor sie mit dem Sol Mischen und kritischer Trocknung von Aerogelen zu bilden 4-8. Vergleich des UV-VIS – Spektroskopie von cyt. C eingekapselt in Aerogele mit Metall – Nanoteilchen zu der cyt. C in Aerogelen ohne Metallnanoteilchen eingekapselt zeigt , dass diese beiden Typen von Einkapselungsverfahren erzeugen cyt. C ähnlicher Lebensfähigkeit innerhalb der Aerogele (Figur 5) . Doch die cyt. C mit Metall – Nanopartikeln verkapselt ist etwas stabiler als cyt. C kapselnd ohne Metall – Nanopartikel innerhalb der Aerogele 9. Die CD – Spektren der beiden Arten von cyt. C Aerogele sind ebenfalls ähnlich, obwohl beide aus dem Spektrum des cyt unterscheiden. C in Puffer gewissen Entfaltung cyt. C innerhalb der Aerogele (Abbildung 7) anzeigt. Frühere Berichte über cyt. C in Aerogele eingekapselt legen nahe , dass der Zirkulardichroismus – Spektroskopie ist wahrscheinlich die äußerste Schicht der Protein Beurteilung, ungefaltet bei Kontakt mit dem Silicagel, entweder innerhalb Metallnanoteilchen nukleierten mehrlagigen cyt. C Strukturen oder lose Strukturen organisiert, bilden wenn keine Metall – Nanopartikel sind in Aerogele 4,9. Der Großteil des cyt. C innerhalb jeder Art von selbstorganisierten Aufbau innerhalb der Aerogele bleibt durch die UV-Vis – Spektroskopie , obwohl gemessen gefaltet. Der Vorteil des beschriebenen Protokolls hier sans Nanopartikel ist, dass teure Anschaffung oder zeitaufwändige Synthese von MetallNanopartikel ist nicht erforderlich. Proteine sind oft nicht erfolgreich innerhalb Aerogele gekapselt und so dieses Verfahren ist wichtig, daß es zum Einkapseln von anderen Proteinen in Aerogele mit potentiellen Bedeutung für zukünftige bioanalytische Geräte zur Entwicklung eines allgemeineren Verfahrens führen kann.
The authors have nothing to disclose.
Unterstützung für diese Arbeit und / oder Veröffentlichung wurde von der Science Institute of Fairfield University College of Arts and Sciences, Fairfield University Faculty Research Grant, ein Cottrell College-Science Award von der Research Corporation für Wissenschaft Förderung, Fairfield University College of Arts & Sciences und fair~~POS=TRUNC field~~POS=HEADCOMP University Chemistry & Biochemistry Department. Wir danken Jean Marie Wallace für viel hilfreiche Einblicke und Ratschläge in Bezug auf diese allgemeinen Forschungsgebiet anzuerkennen. Darüber hinaus erweitern wir ein ganz besonderes Dankeschön an alle vergangenen, gegenwärtigen und zukünftigen Bachelor-Forscher von der Harper-Leatherman Research Lab.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |