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Bioengineering

encapsular citocromo Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

Este procedimiento describe cómo encapsular citocromo c (cit. C) en sílice (SiO2) sol-gel, procesos estos geles para formar bioaerogels, y el uso de estos bioaerogels reconocer rápidamente el óxido nítrico (NO) a través de una reacción en fase gaseosa. Este tipo de protocolo puede ayudar en el futuro desarrollo de biosensores u otros dispositivos de bioanálisis.

Abstract

Las aplicaciones como sensores, baterías y pilas de combustible se han mejorado mediante el uso de los aerogeles altamente porosas cuando los compuestos funcionales son encapsulados dentro de los aerogeles. Sin embargo, existen pocos informes sobre encapsular proteínas dentro de sol-geles que son procesados ​​para formar aerogeles. Un procedimiento para la encapsulación de citocromo c (cyt. C) en sílice (SiO 2) sol-geles que se procesan para formar supercríticamente bioaerogels con actividad en fase gaseosa para el óxido nítrico (NO) se presenta. Cyt. C se añade a un sol de sílice mezclado bajo concentración de proteína controlada y el tampón condiciones de fuerza. La mezcla de sol se gelifica y el líquido de llenado de los poros del gel se sustituye a través de una serie de intercambios de disolvente con dióxido de carbono líquido. El dióxido de carbono se lleva a su punto crítico y ventilado fuera para formar aerogeles secos con cyt. C encapsulado en el interior. Estos bioaerogels se caracterizan con una espectroscopía UV-visibled espectroscopía de dicroísmo circular y se puede utilizar para detectar la presencia de óxido nítrico en fase gaseosa. El éxito de este procedimiento depende de la regulación de la concentración c cyt. Y la concentración de tampón y no requiere otros componentes tales como nanopartículas metálicas. Puede ser posible encapsular otras proteínas usando un enfoque similar haciendo de este procedimiento importante para el potencial desarrollo futuro dispositivo de bioanálisis.

Introduction

El citocromo c (cyt. C) es una proteína de transferencia de electrones clave implicada en las reacciones de la respiración celular del cuerpo. Se ha demostrado estar involucrados en la apoptosis, una forma controlada de muerte celular, y se puede detectar pequeñas moléculas tóxicas tales como el óxido nítrico y el monóxido de carbono 1-3. El óxido nítrico (NO) desempeña un papel en una variedad de procesos fisiológicos que tienen lugar en los sistemas nervioso, cardiovascular y del sistema inmune. Mientras cyt. C requiere típicamente un medio acuoso tamponado a valores de pH neutro a permanecer estructuralmente intacto y activo, la investigación ha demostrado que cyt. C puede retener su estructura y función en materiales sólidos conocidos como aerogeles bajo ciertas condiciones 4-9.

Los aerogeles son materiales muy porosos a menudo formados mediante la síntesis de óxidos metálicos de sol-gel (Mientras que los aerogeles de óxido de metal son muy comunes, de carbono y otros tipos de aerogeles se han sintetizado. Un ejemplo es InP aerogels) 10 y el secado de estos sol-geles de tal manera que la matriz sólida porosa se ​​deja sin cambios 11-14. Todos los poros de aerogeles sólidas resultan en aerogeles disponible Superficie hacer mucho extremadamente útiles para cualquier aplicación en reacciones superficiales son importantes. Cuando la funcionalidad química o bioquímica se monta dentro de la nanoarquitectura aerogel, se ha demostrado que la porosidad física y área de superficie mejorada de los aerogeles de ayuda para mejorar los sensores, así como electrodos para baterías, pilas de combustible, y aplicaciones de supercondensadores 11,15-23 . Con el fin de aerogeles de una manera que sale de la matriz sólida porosa sin cambios secar, es típico para eliminar el disolvente que queda en los poros después de la síntesis sol-gel a través de la extracción con disolvente supercrítico. Cualquier colapso de poros que puede ser causada por las fuerzas de tensión superficial como un solvente se evapora desde el gel se reducen al mínimo debido a que en el secado supercrítico, una interfaz líquido-vapor nunca forma.

c está encapsulado en sol-geles que se han mantenido húmedo o que se han secado ambiently 24-30. Informes de encapsular biomoléculas en Sol-geles que a continuación se secan supercríticamente para formar aerogeles son más raros debido al procesamiento necesario que puede ser perjudicial para la estructura de muchas proteínas. En el caso de cyt. C, ciertas condiciones hacen posible retener la capacidad de cyt. C para detectar y responder a óxido nítrico en fase gaseosa dentro de los aerogeles. Una vez estabilizado en el aerogel, la estructura de poros de alta calidad del aerogel facilita la reacción entre cyt. C y 4,8,9 óxido nítrico. Cyt. C se puede encapsular dentro de aerogeles por primera asociándolo en múltiples capas alrededor de las nanopartículas de oro o plata en la solución de 4-8. Estas superestructuras de varias capas sirven para proteger a la proteína dentro de la matriz de aerogel. En el más reciente approach que hemos desarrollado, cuando la concentración de proteína y el tampón de fuerza son controlados junto con otras condiciones sintéticas, cit. c conserva la integridad dentro de los aerogeles incluso sin nanopartícula metálica asociación inicial 9.

La síntesis comienza como muchas síntesis de aerogel empiezan mezclando precursores de sílice sol-gel por un período determinado de tiempo. Es después de un tiempo que cyt. C se añade como una solución tampón en la mezcla mezclando conjunto. La gelificación se produce entonces para formar una estructura sólida de sílice porosa en la que los poros están llenos de agua, metanol, reactivos y subproductos restantes. Este líquido que llena los poros se puede enjuagar a cabo con varios disolventes a través de una serie de intercambios de disolvente, los últimos intercambios con dióxido de carbono líquido que tiene lugar dentro de un aparato de punto de secado crítico mantenerse a baja temperatura. Llevar los geles por encima de la temperatura crítica (31,1 ° C) de dióxido de carbono facilita la formación de comoupercritical fluido a presión en el interior del aparato que puede ser ventilado a formar aerogeles secos, altamente porosas. La temperatura relativamente baja requerida para el dióxido de carbono para formar un fluido supercrítico es ventajoso en comparación con otros disolventes, ya que mantiene la proteína por debajo de una temperatura a la que podría desnaturalizar.

Nuestro enfoque libre de nanopartícula metálica para encapsular cyt. C en aerogeles es ventajoso porque es un procedimiento simple que puede conducir al desarrollo de un protocolo de aplicación más general para encapsular otras proteínas también. Muchas proteínas no pueden interactuar con nanopartículas metálicas de la misma manera que cyt. C hace y la síntesis de nanopartículas de metal o la compra añade tiempo y gasto adicional para el procedimiento. Los pocos informes sobre encapsular proteínas en aerogeles hacen que el desarrollo de este procedimiento un importante paso adelante para encontrar un procedimiento más general para encapsular otras proteínas en los aerogeles que pueden ayudar in potencial de futuros dispositivos de bioanálisis.

La sección del protocolo de este manuscrito describe cómo sintetizar sílice sol-gel, encapsular cit. C en estos sol-geles, secar estos compuestos sol-gel para formar aerogeles, caracterizan a estos bioaerogels utilizando espectroscopia UV-visible y dicroísmo circular y detectar la presencia de óxido nítrico en fase gaseosa con estas bioaerogels. Cyt. C se ha encapsulado con éxito en aerogeles cuando se disuelve primero en 4,4 a 70 mM de soluciones acuosas de tampón de fosfato. Sin embargo, la estructura de proteínas optimizada en aerogeles se ha encontrado para dar lugar al encapsular 40 mM de fosfato de soluciones tamponadas de cyt. C, produciendo cyt aerogel cargado. Concentraciones de C en el intervalo de 5 a 15 micras 9. Por lo tanto, el protocolo dado a continuación es para sintetizar los aerogeles el uso de soluciones de fosfato 40 mM tamponadas de cyt. C que resulta en un cyt cargado. Concentración c en los aerogeles de 15 mM. </ P>

Protocol

gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de laboratorio deben ser usados ​​en todo momento durante el procedimiento. Nunca haga funcionar el aparato de secado de punto crítico sin necesidad de gafas o anteojos de seguridad. Todas las soluciones que contienen tetrametoxisilano, metanol, etanol, acetona, amoniaco y deben ser procesados ​​dentro de una campana de humos.

1. Asegúrese de búfer y Cit. C Soluciones

  1. Para hacer ~ 750 ml de pH 7, tampón de fosfato de potasio 40 mM, primero preparar 500 ml de fosfato monobásico de potasio 0,04 M pesando 2,72 g de fosfato de potasio monobásico y disolviendo en agua usando un matraz de 500 ml.
  2. Preparar 500 ml de fosfato dibásico de potasio 0,04 M pesando 3,48 g de fosfato dibásico de potasio y disolviendo en agua usando un matraz de 500 ml.
  3. Verter la solución de sal dibásico en un gran vaso de precipitados con una barra de agitación y comenzar la agitación de la solución en una placa de agitación.
  4. Poco a poco agregue partes de la sal monobásico sOlution a la solución de sal dibásico mientras se monitoriza el pH con un electrodo de pH y metro hasta que el pH es 7.00. Se utilizarán aproximadamente 250-300 ml de la solución de sal monobásico.
  5. Pesar aproximadamente 0,023 g de cyt. C y se pone en un vial de centelleo de vidrio. Añadir 2.000 l de tampón de fosfato de potasio preparado utilizando una micropipeta y luego agitar suavemente la solución a la mezcla hasta que todo el sólido cyt, rojo. C se ha disuelto en la solución y no la materia particulada que queda.
  6. Tomar 20 l de la solución preparada c cyt. Y añadir a un 1 cm de longitud del camino cubeta de plástico. Añadir 3 ml de tampón preparado.
  7. Tome espectro UV-vis 300-700 nm usando tampón en la celda de referencia. Utilice el cyt. C absorbancia (A) a 409 nm, el coeficiente de extinción 31 (ε) de 106.100 M -1 cm -1, la longitud del camino cubeta (l), y la ley de Beer-Lambert para determinar la concentración (c) de la solución (A = εlc).
  8. Volver calcular la concentración de la solución preparada originales. Los 2 ml prepararon cyt. Solución C está típicamente entre 0,7 a 0,9 mM en la concentración.
  9. Diluir la solución c preparado cyt. Original de 800 l de 0,105 mM pipeteando 117 l de 0,72 mM preparado cyt. Solución C en un vial de centelleo. A continuación, añadir el resto de los 800 l (683 l en este caso) de tampón preparado. Agitar para mezclar. Los volúmenes exactos variarán dependiendo de la concentración exacta de la cyt preparado originales. Solución C como el volumen de cyt. C de pipeta se calcula como (800 l * 0,105 mM) / (cyt originales. Concentración c en mM).
  10. Almacenar cyt preparado y diluido originales. C soluciones a 2-8 ° C en un refrigerador hasta que esté listo para su uso durante un máximo de dos semanas.

2. Sintetizar sílice (SiO2) Sol

  1. Etiquetar un desechable de 50 ml vaso de polipropileno 'SeaAker A '. Coloque un vaso sobre el plato de una balanza analítica y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para añadir 1,88 g tetrametoxisilano en el vaso. Cero la balanza y luego una pipeta 2,88 g de metanol en 'vaso Un'.
  2. Cubierta 'vaso Un' con Parafilm.
  3. Etiquetar un desechable de 50 ml vaso de polipropileno 'Vaso B'. Añadir una barra de agitación magnética y el lugar en el platillo de una balanza analítica. Utilice una pipeta de vidrio para añadir 0,75 g de agua y 3,00 g de metanol.
  4. Cubierta 'Vaso B' con Parafilm.
  5. Comience a agitar el contenido de 'Vaso B' en una placa de agitación dentro de una campana de humos, a continuación, utilizar una jeringa para insertar 5 l de solución de hidróxido de amonio 28,0 a 30,0% a través del Parafilm cubrir en la mezcla mientras se agita.
  6. Tan pronto como se haya completado el paso 2.5, añadir el contenido de 'Vaso A' a 'Vaso B'. Se agita la mezcla durante 20 min mientras está cubierto en Parafilm.

3. Preparar gel Moldes

Nota: Noes tiempo para preparar los moldes de gel, mientras que la mezcla de sol de sílice se agita en el paso 2.6.

  1. Adquirir 8-9 viales de polipropileno de centelleo (16 mm x 57 mm, tamaño de volumen de 6,5 ml, con fondo en rodajas fuera) y las correspondientes tapas. Ponga una envoltura de plástico sobre el extremo de la tapa del frasco para crear una superficie plana para el gel para formar en la tapa y coloque sobre ella asegurándose de que la envoltura de plástico se mantiene intacta dentro de la tapa.
  2. Alinear los viales con tapón de extremo-abajo en la parte superior del banco y abrió fondos hacia arriba.

4. Preparar Cit. C -silica Sol-geles

  1. Tras la finalización de la mezcla sol (paso 2.6), añadir 3 ml de la mezcla de sol a un vaso de precipitados desechable de 50 ml de polipropileno limpio.
  2. Utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para soltar lentamente 500 l de los 0,105 mM diluido cyt. Solución C (realizada en el paso 1.9) a la mezcla de sol 3 ml en el transcurso de ~ 1 min. Asegúrese de agitar suavemente la mezcla durante la adición del cyt. C para evitar la formación de grandesgrupos rojas. Suponiendo que los volúmenes son aditivos, mediante la dilución de 500 l de la solución 0,105 mM cyt. C a 3500 l, la concentración c cyt. Ahora en el sol es, en teoría, 15 mM.
  3. Pipetear 0,5 ml de la resultante cyt. Sol de sílice c en cada molde preparado. También pipetear 0,5 ml de permanecer 'normal' sol de sílice en una o dos moldes para su uso como muestras de control durante el proceso de secado supercrítico.
  4. Cubrir las aberturas cara arriba de los moldes con Parafilm y poner en el refrigerador (~ 2-8 ° C) durante la noche o durante al menos 12 horas para producir sol-gel.
  5. Tome los moldes de la nevera. Retire el Parafilm desde lo alto de un molde que contiene un cyt c sol-gel.; También retire la tapa y una envoltura de plástico de la parte inferior.
  6. Después de la adición de un poco de etanol a partir de una botella de lavado en el molde, utilice el extremo de disco circular de un émbolo de jeringa para empujar cuidadosamente el gel del molde y en una limpieza 20 ml cont vial de centelleo de vidrioaining aproximadamente 5 ml de etanol.
  7. Repita este procedimiento de extracción de gel (pasos 4.5 y 4.6) hasta que todo el cyt. Geles c se añaden al vial y todos los geles de sílice se añaden a un vial separado. Si se ha hecho más de una concentración de gel de cyt c., Asegúrese de guardarlo como geles juntos dentro de viales separados. A continuación, llenar los viales a la cima con etanol, la tapa y almacenar entre 2-8 ° C.
  8. Cada cuatro horas durante el día, eliminar los geles de la nevera, se decanta el etanol fuera de los geles y se reemplazan con etanol fresco.
  9. Durante un período adicional de tres días, sumergir los geles húmedos sol en acetona, la decantación y la adición de acetona fresca tres veces al día.

5. supercríticamente Cit seco. C -silica Sol-geles

  1. Enfriar un aparato de punto de secado crítico (véase la Figura 1) a 10 ° C mediante el establecimiento de la temperatura de un termostato conectado a 8 ° C.
  2. Una vez que el aparato tiene reached 10 ° C, lleve a cabo una prueba de fugas en el aparato llenando un barco de transporte con acetona y sellándolo en el interior del aparato.
    1. Abra la válvula de llenado del aparato y añadir dióxido de carbono hasta que el aparato está medio lleno.
    2. Cierre la válvula de llenado y escuchar atentamente para sibilante en las puertas y válvulas, donde las juntas tóricas o los sellos pueden estar deteriorándose.
    3. Reemplazar cualquier juntas tóricas o los sellos si se detecta una fuga.
  3. Después de completar la prueba de fugas, abra la válvula de drenaje para liberar la acetona y el dióxido de carbono en el desagüe de una campana de humos. A continuación, retire el barco de transporte del aparato.
  4. Después de asegurarse de que el aparato está libre de fugas, se vierte cuidadosamente los geles húmedos de los viales de centelleo, junto con la mayor parte de la acetona, en tres secciones largas de la embarcación de transferencia (cestas de muestras o cubiertas de gasa no son necesarios). Delicadamente empujar y mover los geles dentro de la embarcación con una pinza para asegurar que todos los geles i se sumergen completamenten acetona. Añadir más acetona si es necesario antes de sellar el bote dentro del aparato.
  5. Abrir la válvula de llenado del aparato de añadir dióxido de carbono, a continuación, abrir la válvula de drenaje para liberar acetona durante cinco minutos tan pronto como se observe la mezcla con el dióxido de carbono acetona para hundirse a la parte inferior del aparato a través de la ventana aparato. Este filtrándose de la acetona a la parte inferior se producirá antes de que el aparato está completamente lleno de dióxido de carbono, por lo que la válvula de llenado debe permanecer abierta en la medida necesaria durante el vaciado de manera que el aparato continuará para llenar incluso mientras el drenaje está abierta.
  6. Cierre la válvula de drenaje. Mantenga la válvula de llenado agrietada abierta ligeramente.
  7. Cinco minutos más tarde, abrir la válvula de drenaje durante cinco minutos de nuevo y ajustar la válvula de llenado para ser abierto lo suficiente para que el aparato permanece lleno durante todo el tiempo de drenaje. Cierre la válvula de drenaje, mantener la válvula de llenado resquebrajó, a continuación, repetir este paso de drenaje una vez más de cincominutos más tarde.
  8. Después de estos tres primeros pasos de drenaje, abrir el desagüe durante 5 minutos a una hora aproximadamente cada 40 min en el lapso de al menos seis horas para asegurar la sustitución completa de acetona por el dióxido de carbono líquido dentro de los geles. Siempre ajuste la válvula de llenado de estar abierto lo suficiente durante cada drenaje de modo que el nivel de líquido en el aparato nunca cae por debajo de la parte superior del barco durante el drenaje.
  9. Una vez que los pasos de drenaje hayan terminado, cierre la válvula de llenado, y drene el dióxido de carbono líquido, de manera que el nivel permanece visible justo por encima de los dientes en el barco mirando a través de la ventana del aparato.
  10. Ajuste la temperatura del termostato adjunta aparato a 40 ° C para asegurar que los aumentos de dióxido de carbono líquido por encima de su temperatura crítica y la presión (Tc = 31 ° C; P c = 7,4 MPa).
  11. Después de aproximadamente 15 min, observar la transición de líquido a fluido supercrítico a través de la ventana aparato como el líquido meniscnosotros por encima de las púas del barco desaparece. Deje por lo menos 15 minutos de tiempo de equilibrio, a continuación, abra la válvula de purga una pequeña cantidad para comenzar a liberar el fluido supercrítico.
  12. En el transcurso de aproximadamente 45 min, seguir abriendo progresivamente la válvula de ventilación más y más de modo que un silbido constante, pero muy bajo de líquido de liberación puede ser oído y se observa el indicador de presión para disminuir lentamente a cero.
  13. Después de que la presión del aparato se ha ido a cero, abrir la puerta de aparato, retire el barco, y el uso de fórceps para colocar los aerogeles recién secos en viales de centelleo de vidrio limpio.

6. Caracterizar Cit. C -silica aerogeles con UV-visible y dicroísmo circular (CD) Espectroscopia

  1. Preparar una plataforma de cartón para contener los monolitos de aerogel en la trayectoria del haz del espectrofotómetro o CD espectrómetro UV-Visible.
    1. Cortar un trozo de 2,5 cm x 2,5 cm de cartón ligero (tal como cartón de una caja de labotejido ratorio), doblar por la mitad, cortado a media altura en el pliegue, luego doblar las dos solapas, creados por el corte, hacia atrás.
    2. Cortar un 5 cm x 5 cm pedazo de cartón ligero, con un orificio de 1,5 cm x 1,5 cm cuadrado en el centro. A continuación, utilice cinta aislante negro para disminuir el tamaño de la bodega de 0,5 cm x 0,5 cm.
    3. Cinta de las solapas del cartón plegado y corte contra la pieza de 5 cm x 5 cm de cartón de manera que se crea una pequeña superficie curvada para un monolito de aerogel para sentarse directamente delante del orificio de 0,5 cm x 0,5 cm (véase la Figura 2) . A continuación, pegue la pieza de la espalda de cartón para el espectrofotómetro UV-visible por lo que el agujero está en línea con la trayectoria del haz.
  2. Medir el espesor de los geles, que se utilizarán para longitudes de trayectoria, con un micrómetro.
  3. Coloque un gel en la plataforma de cartón y medir un espectro de 300 a 800 nm con el aire en el compartimiento de referencia del espectrofotómetro UV-visible.
  4. Montar un polinomio, A = a n, a la región de longitud de onda (λ), donde la absorbancia (A) se debe principalmente a fondo la dispersión, ~ 700-800 nm. El coeficiente de ajuste es típicamente a un número entre ~ 1 x 10 8 y 1 x 10 6 y el coeficiente de n es típicamente en forma de un número entre 2 y 3 ~.
  5. Calcular la dispersión en otras longitudes de onda, utilizando los coeficientes, a y n, que se obtiene a partir del ajuste.
  6. Restar este calculado absorbancia de fondo de dispersión del espectro bruto para obtener un espectro de dispersión corregido.
  7. Montar el espectro de dispersión resta con una curva de Gauss en la región de 370 a 490 nm usando el software apropiado (gramos / AI 8,0) para determinar la altura del pico, centro del pico, y la anchura de pico del pico Soret del aerogel.
  8. Aplicar la Ley de Beer-Lambert utilizando los espesores medidos del gel para la longitud del trayecto (l), el coeficiente de extinción 31 (ε) de 106.100 M -1 cm -1 c en el aerogel (A = εlc).
  9. Comparar el cyt calculado. Concentración c a la concentración teóricamente en el gel (15 M) para determinar la viabilidad de cyt. C dentro del aerogel. Por ciento viabilidades típicos son cercanas al 100%, pero debe tenerse en cuenta que estas viabilidades son sólo estimaciones debido a que el cálculo se basa en el coeficiente de extinción de cyt. C en solución 31 que se presume que es un poco diferente que el coeficiente de extinción de cyt. c en los aerogeles que no se conoce.
  10. nitrógeno ejecutar en el instrumento CD de al menos 5 minutos antes de encender la lámpara.
  11. Tape el soporte de cartón al espectrómetro de CD de modo que el agujero está en línea con la trayectoria del haz.
  12. Medir un espectro de longitudes de onda continua en blanco sin nada en el soporte de cartón de 350-500 nm a 100 nm / min, teniendo un promedio de tres exploraciones.
  13. Coloque un gel (espesor medido previamente en el paso 6.2) en la plataforma de cartón y medir un espectro que va desde 350-500 nm a 100 nm / min, teniendo un promedio de tres exploraciones.
  14. Repetir las mediciones UV-visible y CD para todos los monolitos de aerogel de interés.

7. detectar la presencia de gas óxido nítrico (NO) con Cit. C -silica aerogeles

PRECAUCIÓN: El trabajo con el NO es peligroso y todo el gas NO debe ser manejado en una campana de humos o agotada en una campana de humos. La exposición sostenida a NO es tóxico para los tejidos como dióxido de nitrógeno altamente venenoso y / o tetróxido de nitrógeno formará cuando NO entra en contacto con el aire. Calor y corrosivos humos también se producen cuando NO entra en contacto con agua.

  1. Coloque un cilindro de óxido nítrico 8 L (óxido de nítrico al 10%, el 90% de nitrógeno) en una campana extractora bien ventilada y ajustar la presión a 4 psi.
  2. Conectar los tubos a tanto el cilindro de óxido nítrico y a un cilindro de nitrógeno (presión ajustado a 6 psi) y enlazar los extremos de la tubería a una válvula en T (véase la figura 3a).
  3. Elija un monolito aerogel para el experimento y medir el espesor (o longitud de la trayectoria) con un micrómetro.
  4. Coloque el aerogel (~ 3 mm de espesor) en una cubeta desechable con tapa de plástico y poner la cubeta en el espectrofotómetro. Cortar el aerogel ligeramente si es necesario para adaptarse a la cubeta.
  5. Insertar dos agujas de jeringa en el tapón de plástico de la cubeta, uno conectado a la salida de la válvula en T, y una conectada a un tubo para servir como escape en la campana de humos (véase la figura 3b). Use Parafilm para sellar las agujas para el tubo y el tapón a la cubeta.
  6. Coloque una cubeta desechable vacío en la celda de referencia.
  7. Ajustar la posición de cubeta aerogel para asegurar que el aerogel está en la trayectoria del haz antes de iniciar el experimento.
  8. Tomar un espectro inicial 800-300 nm.
  9. Monitorear la diferencia entre la absorbancia a 414 nm y la absorbancia a 408 nm mientras se gira la válvula en T para cambiar entre nitrógeno y la mezcla de óxido nítrico / nitrógeno a intervalos de tiempo establecidos asegurándose de que en ningún momento es la tasa de flujo de nitrógeno o de la mezcla de óxido nítrico / nitrógeno tan alta que el aerogel se mueve en la cubeta.
  10. Tome un espectro final a partir de 800 a 300 nm, una vez que los ciclos de exposición están acabados.
  11. Repetir el procedimiento con tres a cuatro monolitos para obtener una respuesta promedio de detección.

Representative Results

Los resultados procedimiento descrito en aerogeles que contienen cyt viable. C. Tal como se especifica en el final de la introducción, cyt. C puede ser encapsulado a partir de soluciones tampón acuosas que van desde 4,4 a fosfato de 70 mM. Ejemplos de cyt. C -silica (cyt. C SiO 2) aerogeles a partir de soluciones que contienen diferentes concentraciones de tampón se muestran en la Figura 4. Todos los geles son relativamente translúcido, con los geles elaborados a partir de 70 mM de tampón de los más opaco.

Una comparación de la espectroscopia de cyt. C bajo diferentes condiciones se muestra en la Figura 5. Un típico espectro (Figura 5c) muestra el pico grande Soret alrededor de 408 nm para cyt. C SiO 2 aerogeles y es muy similar al espectro de cyt . c en solución (Figura 5a). Además, un espectro de cyt.c encapsulado dentro de aerogeles con nanopartículas de metal también se muestra (Figura 5b) y el cyt. c SiO espectro 2 aerogel es similar a este espectro también. Cuando el cyt. C SiO 2 aerogel está expuesto a óxido nítrico, un cambio típico del pico de Soret se observa (Figura 5d).

Los espectros UV-vis para geles hechos de cyt. Soluciones de C en diferentes concentraciones de tampón se muestran en la Figura 6. Todos estos geles muestran característica espectroscópica UV-visible que indica que cuenta con cyt. C no está en un estado desnaturalizado dentro de los geles. Sin embargo, la disminución de la translucidez de los geles hechos de 70 resultados mM de tampón en una relación más baja de señal a ruido para estos espectros.

Los espectros de CD de cyt. C SiO 2 aerogeles son similares a los espectros de cyt. C c en solución tamponada (Figura 7).

La Figura 8 muestra una respuesta de la supervisión de óxido nítrico típico para cyt. C SiO 2 aerogeles y aerogeles correspondientes que también contienen nanopartículas de metal además de cyt. C. La diferencia entre la absorbancia a 414 nm y que en 408 nm se ve para aumentar y luego disminuir cuando los geles se expusieron a óxido nítrico y luego nitrógeno respectivamente en sucesión.

Si el dióxido de carbono supercrítico no se libera a una velocidad lo suficientemente lenta, la viabilidad de la cyt. C dentro de los aerogeles formados se verá comprometida. Esto se revela mediante la comparación resultante espectros UV-visible después de formar geles por la liberación de dióxido de carbono en diferentestasas (Figura 9).

Figura 1
Figura 1: aparato de punto de secado crítico El aparato de punto de secado crítico se muestra desde la (A) frontal y (B) de nuevo con la puerta barco transferencia y aparato que se muestra junto a la parte posterior del aparato..

Figura 2
Figura 2: Plataforma de Cartón La plataforma de cartón montado para la celebración de un aerogel en la trayectoria del haz de un instrumento..

figura 3
Figura 3: detección nítrico óxido de configuración se muestra la detección de óxido nítrico set-up que incluye (a) la campana de humos cerrado óxido nítrico 10%., 90% cilindro de nitrógeno, tubos, y T-válvula, y (B) de la cubeta con las agujas insertadas.

Figura 4
Figura 4:.. Cit muestra C-SiO 2 aerogeles aerogeles encapsular 15 cyt c M en 4,4 mM, 40 mM, y tampón de fosfato de potasio 70 mM se muestran en comparación con una moneda de diez centavos de izquierda a derecha.. Estos aerogeles son aproximadamente 0,2-0,5 cm de altura. Reproducido con permiso 9.

Figura 5
Figura 5:. Cyt c SiO espectroscopia 2 aerogel espectros visible de 15 M citocromo c en (a) 50 mM de tampón de fosfato sol.lución; (B) Au (5 nm) ~ cyt c-SiO2 aerogel.; (C) cyt c-SiO2 aerogel (expuesta al aire).; (D) cit. C-SiO2 aerogel (expuesta al óxido nítrico durante 3,5 min). Estos espectros representativas de los tipos de gel se compensan para mayor claridad, y la línea discontinua indica la posición del pico de Soret de cyt. C en tampón. Mientras que cada espectro es de 15 M cyt. C, los espesores de gel (o alturas) sólo son 0,2-0,5 cm en comparación con la cubeta solución de 1-cm resulta en una absorbancia solución superior. Reproducido con permiso 9.

Figura 6
Figura 6: espectroscopia de aerogel como la concentración del tampón encapsulado es variado Averaged UV-visible absorbancia espectral de aerogeles dividido por gel de longitud de recorrido para los geles de encapsulación 15 _.6; M cyt c en 70 mM (negro) (promedio de 4 espectros), 40 mM (rojo, punteada) (media de 8 espectros), y 4,4 mM (verde, discontinua) (promedio de 9 espectros) de tampón de fosfato de potasio. . Reproducido con permiso 9.

Figura 7
Figura 7:... Aerogel espectroscopía de dicroísmo circular espectros de dicroísmo circular de cyt c en solución tamponada de fosfato de sodio (sólido), dos espectros representativos de cyt c SiO 2 aerogeles (discontinua), y dos espectros representativos de Au (5-nm) ~ cit. c SiO- 2 aerogeles (de puntos). Reproducido con permiso 9.

Figura 8
Figura 8: Detección de óxido nítrico con cyt c-SiO2. . sub> aerogeles Monitoreo del cambio (? A = A 414 nm - A 408 nm). en la intensidad de Soret de cyt c (rojo sólido) y Au ~ cyt c (discontinua azul) encapsulado en SiO2 compuestos nanoarquitecturas de aerogel como el flujo de gas. cambia entre nitrógeno (donde Soret pico máximo es a ~ 408 nm) y óxido nítrico (donde Soret pico máximo es a ~ 414 nm). Cada curva es un promedio de 3-4 ensayos, con dos de los cyt c SiO 2 ensayos controlados en? A = a 414 nm -. A 407 nm desde el pico máximo inicial Soret estaba en 407 nm para estos ensayos. Reproducido con permiso 9.

Figura 9
Figura 9:. Efecto de la descarga de fluido supercrítico tiempo promediado UV-visible absorbancia espectral dividida por la longitud del camino de gel para cyt c-SiO2 aerogeles enca.psulating 10 cyt M. C en 50 mM de tampón de fosfato en el que los aerogeles supercríticamente secos se hacen por cualquiera de la liberación de dióxido de carbono supercrítico durante 45 min (sólido, negro (promedio de 9 espectros)) o 7 min (línea de puntos, rojo (promedio de 4 Los espectros)). Reproducido con permiso 9.

Discussion

Como se describe, este procedimiento ha producido consistentemente cyt viable. C encapsulado dentro de los aerogeles. La concentración de cyt. C dentro de los aerogeles se puede variar desde 5 a 15 mM y de la concentración del tampón de la solución inicial c cyt. Encapsulado dentro de los aerogeles se pueden variar de 4,4 a 70 mM de fosfato sin graves efectos perjudiciales para la viabilidad de la proteína. Sin embargo, el centro del pico y la anchura del pico de la cyt característica. C Soret pico en aerogeles están más cerca de lo que son para el cit. C en solución cuando cit. C se encapsula en aerogeles de soluciones de tampón 40 mM 9.

La síntesis de la cyt. C SiO 2 aerogeles se ve afectado por la edad de algunos de los reactivos de partida. Metanol, tetrametoxisilano, y la solución de hidróxido de amonio son higroscópicas y deben ser reemplazados cada uno a dos meses. El aumento de agua que se acumula enestos reactivos con el tiempo afecta a las características estructurales de gel y el tiempo de transición sol-gel.

Cuando se realiza el secado supercrítico, barco de transporte del aparato de secado de punto crítico puede contener hasta dieciocho 0,5 cm de espesor, geles 1 cm de diámetro. Como se indica en la sección de protocolo, un relleno específico y procedimiento de drenaje se deben seguir para transferir dióxido de carbono en el método sol-gel. Es importante tener en cuenta que al comienzo del protocolo de drenaje, la mezcla de drenaje de dióxido de carbono y acetona fluye a una alta velocidad tal que el tubo de drenaje queda rígido con la humedad de condensación de hielo en el exterior. La mezcla se escape hacia afuera contiene un poco de agua ya que la acetona no es anhidro y esta agua de vez en cuando puede congelar en una medida que el tubo de drenaje se obstruye en realidad. Es necesario poner atención a tales obstrucciones y escuchar a un paro de flujo. La válvula de drenaje debe estar cerrada durante unos minutos por lo que la obstrucción se derretirá si se detecta una obstrucción. Enel peor de los casos, si la válvula de drenaje no está cerrado, una obstrucción puede causar tanto la presión se acumule que el tubo de drenaje aparece con fuerza fuera del aparato. Después de los primeros períodos de drenaje pocos, la mayoría de la acetona se habrá enjuagado fuera del aparato, y la aparición de trozos de hielo mojado disminuirá dramáticamente. La descarga se parecerá progresivamente hielo seco como el protocolo de drenaje continúa con cualquier evidencia residual de la presencia de acetona (por ejemplo, olor) convertirse en indetectables por el final del proceso de drenaje.

Después de que el dióxido de carbono en el aparato ha hecho la transición de líquido a fluido supercrítico y el proceso de ventilación ha comenzado, es necesario para liberar el fluido a una velocidad lenta durante al menos 45 min, como se indica en el procedimiento de 9. Una mayor tasa de liberación puede disminuir la viabilidad de cyt. C (como se muestra en la Figura 9) dentro de los aerogeles y los aerogeles sí mismos en realidad puede romperse como THe fluido se apresura a escapar de los geles. En general, incluso cuando los aerogeles permanecen intactos después de abrir la puerta de aparato, es importante para manejar con cuidado y suavemente, ya que son frágiles y pueden romperse fácilmente.

Los geles de sílice de control que se vierten junto con el cyt c. -SiO 2 geles se utilizan después del secado supercrítico para determinar si la transferencia de dióxido de carbono en los geles se realizó correctamente. A veces el cit. C SiO 2 geles pueden aparecer turbia y es importante para determinar si esto es debido a la transferencia incompleta disolvente o si pueden tener que ver con la concentración de la cit. C o tampón encapsulado dentro de los geles. Si C aparecer los geles de sílice sin cit. Tener un aspecto homogéneo, transparente en todo, esto puede ser tomado como evidencia de que la transferencia se produjo disolvente por completo, incluso si el cit. C-SiO2 geles tienen algo de turbidez a ellos. Nubosidad dentro de los geles de sílicesin cit. c después del secado indica que algo de acetona se mantuvo dentro de los geles durante la ventilación.

Como se indica en la sección de protocolo, importantes medidas de seguridad se deben tomar cuando se trabaja con el óxido nítrico (NO). Para detectar NO usando los aerogeles, es necesario para sellar la cubeta muy bien y de agotamiento de gas que fluye a lo largo de los aerogeles en una campana de humos. Por otra parte, todo el espectrofotómetro se puede mover en una campana de humos junto con el cilindro de gas NO como una precaución adicional para limitar la exposición al gas NO. En contacto con el aire NO producirá inmediatamente el dióxido de nitrógeno, tetróxido de nitrógeno altamente venenoso o ambos. NO también puede reaccionar con agua para producir vapores de calor y corrosivos. Por lo tanto, la exposición sostenida a NO puede producir toxicidad tisular directa.

Cuando se utiliza el cyt. C SiO 2 aerogeles para detectar la presencia de óxido nítrico, la banda Soret será inicialmente a ~ 408 nm y se desplazaráa ~ 414 nm en presencia de óxido nítrico. Después de cambiar de nuevo a nitrógeno, la banda Soret debe revertir de nuevo a estar centrado en ~ 408 nm. También puede ser posible utilizar el cyt. C SiO 2 aerogeles para detectar la presencia de otros ligandos tales como monóxido de carbono 27.

Diferentes procedimientos publicados incluyen un paso adicional de la combinación de las nanopartículas de oro o plata con cyt. C en solución antes de la mezcla con el sol y supercríticamente secado para formar aerogeles 4-8. La comparación de la espectroscopía UV-visible de cyt. C encapsulado en aerogeles con nanopartículas metálicas a la de cyt. C encapsulado en aerogeles sin nanopartículas de metal muestra que estos dos tipos de técnicas de encapsulación producen cyt. C de la viabilidad similares dentro de los aerogeles (Figura 5) . Sin embargo, el cyt. C encapsulada con nanopartículas de metal es ligeramente más estable que cyt. C encapsulard sin nanopartículas de metal en los aerogeles 9. Los espectros de CD de ambos tipos de cyt. Aerogeles c también son similares, aunque ambos se diferencian a partir del espectro de cyt. C en tampón que indica algún despliegue de cyt. C dentro de los aerogeles (Figura 7). Los informes anteriores sobre cyt. C encapsulados en aerogeles sugieren que la espectroscopia de dicroísmo circular es más probable evaluando la capa más externa de la proteína, desplegado al contacto con el gel de sílice, dentro de cualquiera de metal cyt de varias capas de nanopartículas nucleado. Estructuras c o estructuras poco organizadas que forman cuando no hay nanopartículas metálicas en aerogeles de 4,9. La mayoría de la cyt. C dentro de cualquier tipo de estructura auto-organizado dentro de los aerogeles permanece plegada tal como se mide por la espectroscopía UV-visible sin embargo. La ventaja del protocolo descrito en el presente documento nanopartículas sans es que compra cara o síntesis tiempo de metalesnanopartículas no es necesario. Las proteínas a menudo no se han encapsulado con éxito dentro de aerogeles, y por lo que este procedimiento es importante ya que puede conducir al desarrollo de un método más general para encapsular otras proteínas en aerogeles con importancia potencial para dispositivos bioanalíticos futuras.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

El apoyo a este trabajo y / o publicación fue proporcionado por el Instituto de Ciencias de la Facultad de Letras de la Universidad de Fairfield y Ciencias, Facultad de Becas de Investigación de la Universidad de Fairfield, un Premio Ciencia Cottrell Colegio de la Corporación de Investigación para la Ciencia Adelanto de la Facultad de Artes y Ciencias de la Universidad de Fairfield y Departamento de Química y Bioquímica de la Universidad de Fairfield. Agradecemos Jean Marie Wallace por visión mucho más útil y asesoramiento en lo que respecta a esta área de investigación general. Además, extendemos un agradecimiento muy especial a todos los pasados, actuales y futuros investigadores universitarios del laboratorio de investigación de Harper-Leatherman.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

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References

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Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

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