Summary
Deze procedure wordt beschreven hoe u cytochroom c (cyt. C) in te kapselen silica (SiO 2) sol-gels, proces deze gels te bioaerogels te vormen en gebruiken deze bioaerogels om stikstofoxide (NO) snel te herkennen door middel van een gas-fase reactie. Dit type protocol kan helpen bij de toekomstige ontwikkeling van biosensoren of andere bioanalytische apparaten.
Abstract
Toepassingen zoals sensoren, batterijen en brandstofcellen zijn verbeterd door het gebruik van zeer poreuze aerogel als functionele verbindingen worden ingekapseld in de aerogels. Echter, weinig rapporten over inkapselen eiwitten in sol-gels die worden verwerkt tot aerogels vormen bestaan. Een procedure voor het inkapselen van cytochroom c (cyt. C) siliciumoxide (SiO 2) sol-gels die supercritically worden verwerkt tot bioaerogels met gasfase-activiteit nitric oxide (NO) wordt gepresenteerd. Cyt. C toegevoegd aan een gemengde silicasol onder gecontroleerde eiwitconcentratie en buffersterkte omstandigheden. Het mengsel wordt vervolgens sol gegeleerd en de vloeistof vullen van de poriën gel wordt vervangen door een reeks oplosmiddel uitwisseling met vloeibaar kooldioxide. De kooldioxide wordt om zijn kritiek punt gebracht en afgeblazen droge aerogel met cyt vormen. C binnen ingekapseld. Deze bioaerogels kenmerken met UV-spectroscopie eend circulair dichroïsme spectroscopie en kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de gasfase stikstofoxide detecteren. Het succes van deze procedure is gebaseerd op de regulering cyt. C concentratie en de bufferconcentratie en geen andere componenten zoals metaal nanodeeltjes vereisen. Het kan mogelijk zijn om andere eiwitten met een soortgelijke aanpak waardoor deze procedure belangrijke potentiële toekomstige ontwikkeling bioanalytische apparaat kapselen.
Introduction
Cytochroom c (cyt. C) is een belangrijke elektronenoverdrachtsmiddel eiwit betrokken bij het lichaam cellulaire ademhaling reacties. Het is aangetoond dat betrokken is bij apoptose, een gecontroleerde vorm van celdood, en kunnen dergelijke kleine toxische moleculen zoals stikstofmonoxide en koolstofmonoxide 1-3 detecteren. Stikstofoxide (NO) speelt een rol in diverse fysiologische processen in het zenuwstelsel, cardiovasculaire en immuunsysteem. Terwijl cyt. C meestal vereist een waterige omgeving gebufferd tot pH-neutrale waarden structureel intact en actief te blijven, heeft onderzoek aangetoond dat cyt. C kan de structuur en functie in vaste materialen bekend als aerogels onder bepaalde voorwaarden 4-9 te behouden.
Aerogel is sterk poreuze materialen vaak gevormd door het synthetiseren sol-gel metaaloxiden (terwijl metaaloxide aerogel is zeer vaak hebben koolstof en andere vormen van aërogels gesynthetiseerd. Een voorbeeld is InP aerogels) 10 en drogen deze sol-gels zodanig dat de poreuze vaste matrix ongewijzigd gelaten 11-14. Alle poriën in vaste aërogels leiden tot veel beschikbare oppervlakte waardoor aerogels zeer nuttig voor toepassingen waarbij oppervlaktereacties belangrijk. Wanneer chemische of biochemische functionaliteit is gemonteerd binnen de aërogel nanoarchitecture, is aangetoond dat de fysische porositeit en verbeterde oppervlakte van de aerogels helpen sensoren en elektroden voor batterijen, brandstofcellen en supercondensator toepassingen 11,15-23 verbeteren . Om aerogels zodanig dat de poreuze vaste matrix ongewijzigd laat drogen, is het kenmerkend voor het oplosmiddel in de poriën achterblijft nadat sol-gel-synthese met superkritische vloeistofextractie verwijderen. Elke porie instorting die door oppervlaktespanningskrachten worden veroorzaakt als oplosmiddel verdampt uit de gel worden geminimaliseerd door in superkritisch drogen een vloeistof-lucht grensvlak niet vormen.
c wordt ingekapseld in sol-gels die nat zijn gehouden of die zijn ambiently 24-30 gedroogd. Verslagen van inkapselen biomoleculen in sol-gels die vervolgens supercritically gedroogd onder vorming aerogel is zeldzamer, omwille van de verwerking die schadelijk is voor de structuur van veel eiwitten zijn. Bij cyt. C, bepaalde voorwaarden maken het mogelijk om het vermogen van cyt. C te sporen en aan te gasfase stikstofoxide in aerogels behouden. Eenmaal gestabiliseerd in de aerogel, de hoogwaardige poriestructuur van de aërogel vergemakkelijkt de reactie tussen cyt. C en stikstofmonoxide 4,8,9. Cyt. C kan binnen aerogelen worden ingekapseld door eerst te associëren in meerdere lagen rond gouden of zilveren nanodeeltjes in oplossing 4-8. Deze meerlagige bovenbouw dienen om het eiwit in de aërogel matrix te beschermen. In de meest recente approach die we hebben ontwikkeld, wanneer de eiwitconcentratie en buffer sterkte worden gecontroleerd en andere synthetische omstandigheden cyt. c integriteit behoudt in de aerogels zelfs zonder metaal nanodeeltje initiële associatie 9.
De synthese begint als vele aerogel syntheses beginnen door het mengen van silica sol-gel-voorlopers voor een bepaalde periode van tijd. Het is na een bepaalde mengtijd die cyt. C wordt toegevoegd als een gebufferde oplossing in het mengsel. Gelering plaatsvindt, een poreuze silica stevige structuur waarin de poriën zijn gevuld met water, methanol, resterende reagentia en bijproducten vormen. Deze vloeistof die de poriën vult gespoeld worden met verschillende oplosmiddelen door een reeks van oplosmiddel uitwisseling, de laatste uitwisseling met vloeibaar kooldioxide plaatsvinden binnen een kritisch punt drooginrichting bewaard bij lage temperatuur. Waardoor de gels boven de kritische temperatuur (31,1 ° C) kooldioxide vergemakkelijkt de vorming van alsupercritical vloeistof in het onder druk staande inrichting die kan worden ontlucht droog, sterk poreuze aerogels vormen. De relatief lage temperatuur vereist voor koolstofdioxide een superkritische vloeistof te vormen voordelig in vergelijking met andere oplosmiddelen omdat het eiwit onder een temperatuur waarbij het kan denatureren houdt.
De metaal nanodeeltjes-vrij benadering inkapselen cyt. C in aërogels is voordelig omdat het een eenvoudige procedure die kan leiden tot de ontwikkeling van een algemener toepasbaar protocol voor het inkapselen van andere eiwitten ook. Veel eiwitten geen interactie met metalen nanodeeltjes op dezelfde manier cyt. C doet en metaal nanodeeltjes synthese of eerst voegt extra tijd en kosten voor de procedure. De enkele rapporten over inkapselen eiwitten in aërogels maken de ontwikkeling van deze procedure een belangrijke stap om met een meer algemene procedure voor het inkapselen van andere eiwitten in aerogels die ik kan helpenn potentiële toekomstige bioanalytische apparaten.
Het protocol deel van dit manuscript beschrijft hoe silica sol-gels te synthetiseren, te kapselen cyt. C in deze sol-gels, drogen deze samengestelde sol-gels te aerogels te vormen, karakteriseren deze bioaerogels met UV-zichtbaar en circulair dichroïsme spectroscopie en opsporen van de aanwezigheid van gasfase stikstofoxide met deze bioaerogels. Cyt. C met succes ingekapseld in aërogels bij de eerste in 4,4-70 mM waterige oplossingen van fosfaatbuffer opgelost. Echter geoptimaliseerd eiwitstructuur in aërogels gebleken ontstaan wanneer inkapselen 40 mM fosfaatgebufferde oplossingen cyt. C produceren loaded aerogel cyt. C concentraties in het bereik van 5-15 uM 9. Daarom is het protocol hieronder is aerogels synthetiseren middels 40 mM fosfaatgebufferde oplossingen cyt. C waardoor een geladen cyt. C concentratie in het aerogels van 15 uM. </ P>
Protocol
Veiligheidsbril, labjas en laboratorium handschoenen worden gedragen op elk moment tijdens de procedure. Gebruik nooit het kritieke punt drooginrichting zonder een veiligheidsbril. Alle oplossingen die tetramethoxysilaan, methanol, ethanol, aceton, ammoniak en moeten binnen een zuurkast worden verwerkt.
1. Zorg Buffer en Cyt. C Solutions
- Ervoor ~ 750 ml pH 7, 40 mM kaliumfosfaatbuffer, eerst bereiden 500 ml 0,04 M monobasisch kaliumfosfaat door weging uit 2,72 g monobasisch kaliumfosfaat en oplossen in water met een 500 ml maatkolf.
- Bereid 500 ml 0,04 M dibasisch kaliumfosfaat door weging uit 3,48 g dibasisch kaliumfosfaat en oplossen in water met een 500 ml maatkolf.
- Giet het dibasische zoutoplossing in een grote bak met een roerstaaf en beginnen roeren van de oplossing op een roer plaat.
- Voeg langzaam delen van het monobasisch zout sPLOSSING de dibasische zoutoplossing tijdens het monitoren van de pH met een pH-elektrode en meter tot de pH 7,00. Ongeveer 250-300 ml van de monobasische zoutoplossing gebruikt.
- Weeg ongeveer 0,023 g cyt. C en plaats in glazen scintillatieflesje. Voeg 2000 ul geprepareerde kaliumfosfaatbuffer met een micropipet en dan zachtjes wervelen van de oplossing te mengen totdat alle vaste, rode cyt. C is opgelost in de oplossing en er geen deeltjes blijft.
- Neem 20 ul van de bereide cyt. C-oplossing en toe te voegen aan een 1 cm padlengte plastic cuvet. Voeg 3 ml van bereide buffer.
- Neem UV-vis spectrum 300-700 nm met behulp van buffer in de referentie-cel. Gebruik de cyt. C absorptie (A) bij 409 nm, de extinctiecoëfficiënt 31 (ε) van 106.100 M-1 cm -1, de lengte cuvette pad (l), en de Beer-Lambert wet om de concentratie te bepalen (c) van de oplossing (A = εlc).
- Terug Bereken de titer van de oorspronkelijke bereide oplossing. De 2 ml bereid cyt. C oplossing ligt typisch tussen 0,7-0,9 mM concentratie.
- Verdun de oorspronkelijke bereid cyt. C oplossing van 800 gl 0,105 mM pipetteren 117 pi 0,72 mM bereid cyt. C oplossing in een scintillatieflesje. Voeg vervolgens de rest van de 800 pl (683 pl in dit geval) van bereide buffer. Swirl te mengen. De precieze hoeveelheden zullen variëren afhankelijk van de precieze concentratie van de oorspronkelijke bereid cyt. C oplossing als het volume van cyt. Com pipet wordt berekend als (800 pi * 0,105 mM) / (oorspronkelijke cyt. C concentratie in mM).
- Bewaar originele voorbereid en verdund cyt. C oplossingen bij 2-8 ° C in een koelkast totdat klaar om te gebruiken voor maximaal twee weken.
2. Synthetiseren Silica (SiO 2) Sol
- Label een wegwerp 50 ml polypropyleen beker 'BeAker A '. Plaats de beker op de pan van een analytische balans en gebruik een glas Pasteur pipet om 1,88 g tetramethoxysilaan toe te voegen in de beker. Zero de balans en vervolgens pipet 2,88 g methanol in 'Beaker A'.
- Cover 'Beker A' met Parafilm.
- Label een wegwerp 50 ml polypropyleen beker 'Beaker B'. Voeg een magnetische roerstaaf en leg ze op de pan van een analytische balans. Gebruik een glazen pipet tot 0,75 g water en 3,00 g methanol toe te voegen.
- Cover 'Beaker B' met Parafilm.
- Begin met het roeren van de inhoud van 'Beaker B' op een roer plaat in een zuurkast, gebruik dan een spuit om 5 ul van 28,0-30,0% ammoniumhydroxideoplossing steek door de Parafilm te dekken in het mengsel al roerend.
- Zodra 2,5 stap is voltooid, voeg de inhoud van "Beker A" tot "B beker. Roer het mengsel gedurende 20 minuten onder bedekt met Parafilm.
3. Bereid Gel Mallen
Let op: Ertijd om de gel vormen werken en daarbij de silicasol mengsel roeren in stap 2,6.
- Acquire 8-9 polypropyleen scintillatieflesjes (16 mm x 57 mm, grootte van het volume 6,5 ml, met bodems afgesneden) en de bijbehorende caps. Doe plasticfolie over de dop einde van het flesje op een vlakke ondergrond te creëren voor de gel te vormen op en plaats de kap erover om ervoor te zorgen dat de plastic verpakking blijft intact in de dop.
- Line-up van de flesjes met cap-end op de bank top en opende bodems naar boven.
4. Bereid Cyt. C -silica Sol-gels
- Na voltooiing van de sol te mengen (stap 2,6), voeg 3 ml van de sol naar een schone 50 ml wegwerp polypropyleen beker.
- Gebruik een glazen pasteurpipet langzaam dalen 500 gl van de verdunde 0,105 mM cyt. C oplossing (in stap 1,9) aan de 3 ml sol mengsel in de loop van ~ 1 min. Zorg ervoor dat u zachtjes wervelen het mengsel tijdens het toevoegen van de cyt. C om vorming van grote voorkomenrode klonten. Ervan uitgaande dat de volumes additief, door het verdunnen van 500 pl van de 0,105 mM cyt. C oplossing van 3500 ui, de cyt. C concentratie nu de sol in theorie 15 uM.
- Pipetteer 0,5 ml van de resulterende cyt. C silicasol in elk voorbereide vorm. Pipetteer ook 0,5 ml resterende 'plain' silicasol in één of twee matrijzen gebruikt als controlemonsters tijdens het superkritisch drogen.
- Bedek de face-up openingen van de mallen met Parafilm en zet in de koelkast (~ 2-8 ° C), 's nachts of gedurende ten minste 12 uur tot sol-gels te produceren.
- Neem de mallen uit de koelkast. Verwijder de Parafilm uit de top van een matrijs met een cyt c sol-gel.; Ook de dop en plastic verpakking van de bodem te verwijderen.
- Na toevoegen van enkele ethanol uit een wasfles in de mal, gebruik de ronde schijf uiteinde van een zuiger voorzichtig duwen de gel uit de vorm en in een schone 20 ml glazen scintillatieflesje containing ongeveer 5 ml ethanol.
- Herhaal deze procedure gel verwijderd (stap 4,5 en 4,6) totdat alle cyt. C gels worden toegevoegd aan het flesje en alle silicagels worden toegevoegd aan een afzonderlijk flesje. Als er meer dan een concentratie van cyt. C gel is gemaakt, moet u om samen op te slaan, zoals gels in afzonderlijke flacons. Vul dan de flesjes naar de top met ethanol, cap en op te slaan tussen 2-8 ° C.
- Om de vier uur gedurende de dag, verwijder de gels uit de koelkast, giet de ethanol uit de gels en te vervangen door verse ethanol.
- Gedurende een aanvullende drie dagen onderdompelen natte sol gel in aceton, decanteren en het toevoegen van verse aceton driemaal daags.
5. Supercritically Dry Cyt. C -silica Sol-gels
- Cool Een kritisch punt drooginrichting (zie figuur 1) tot 10 ° C door de temperatuur van een aangesloten circulator tot 8 ° C.
- Zodra de inrichting reached 10 ° C, uitvoeren van een lektest op het toestel door het vullen van een overschrijving boot met aceton en dichten de binnenkant van de inrichting.
- Open de vulklep van de inrichting en voeg kooldioxide tot de inrichting halfvol.
- Sluit de vulklep en luister aandachtig voor sissen bij de deuren en kleppen waar de O-ringen of afdichtingen kunnen verslechteren.
- Vervang O-ringen of afdichtingen wanneer een lek wordt gevonden.
- Na het voltooien van de lektest, open de aftapkraan aan de aceton en kooldioxide vrijkomen in de afvoer van een zuurkast. Verwijder vervolgens de overdracht boot uit het apparaat.
- Nadat verzekerd is dat de inrichting lekvrij, giet de natte gels van de scintillatieflesjes, samen met de meeste aceton, in drie lange stukken overdracht boot (specimen manden of gaas bekledingen zijn niet nodig). Tactvol duwen en verplaats de gels in de boot met een tang om ervoor te zorgen dat alle gels ik volledig ondergedompeldn aceton. Voeg meer aceton indien voor het afdichten van de boot in de inrichting nodig.
- Open de vulklep van de inrichting kooldioxide toe, open de aftapkraan aceton zodra de aceton mengen met het kooldioxide waargenomen zinken naar de bodem van de inrichting door de inrichting raam vrij vijf minuten. Dit sijpelen aceton naar beneden zal plaatsvinden voordat de inrichting volledig is gevuld met kooldioxide, zodat de vulklep open voor zover nodig tijdens het aftappen moet blijven, zodat de inrichting zal vullen, zelfs als de afvoer geopend.
- Sluit de afvoerkraan. Houd de vulklep gekraakt een beetje open.
- Vijf minuten later, opent de afvoerklep gedurende vijf minuten en pas het vulklep voldoende geopend zodat de inrichting volledig gedurende de hele tijd blijft aftappen. Sluit de afvoerkraan, houdt de vulling open klep gekraakt, herhaal dit aftappen stap nog een keer vijfminuten later.
- Na deze eerste drie stappen drainage, opent de afvoer gedurende 5 min per keer ongeveer elke 40 minuten over de overspanning van tenminste zes uur volledige vervanging van aceton door vloeibaar kooldioxide in de gels te waarborgen. Stel het vulklep open genoeg tijdens elke aftappen zodat het vloeistofniveau in de inrichting nooit beneden de bovenkant van de boot bij het aftappen.
- Zodra het aftappen stappen zijn voltooid, sluit de vulklep, en laat de vloeibare kooldioxide, zodat het niveau zichtbaar blijft net boven de tanden op de boot door te kijken door de inrichting raam.
- Stel de temperatuur van het toestel dient circulator tot 40 ° C om ervoor te zorgen dat de vloeibare kooldioxide stijgt boven de kritische temperatuur en druk (Tc = 31 ° C; Pc = 7,4 MPa).
- Na ongeveer 15 minuten, observeert de overgang van vloeistof naar superkritisch fluïdum door de inrichting venster waarin de vloeistof meniscons boven de tanden van de boot verdwijnt. Laat minstens 15 min equilibratie tijd, dan opent u de ontluchtingsklep een klein bedrag om te beginnen met de superkritische vloeistof vrij te geven.
- Gedurende ongeveer 45 minuten, blijven stapsgewijs openen ontluchtingsklep wijder zodat een stabiel, maar zeer lage ruis vrijgeven fluïdum te horen en de drukmeter wordt waargenomen langzaam afnemen tot nul.
- Nadat de druk van de inrichting is naar nul, opent het apparaat, verwijder de boot en een tang om de zojuist gedroogde aerogels plaatsen in schone glazen scintillatieflesjes.
6. karakteriseren Cyt. C -silica Aerogels met UV-zichtbare en Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie
- Bereid een kartonnen platform om de aerogel monolieten in de bundel pad van de UV-Visible spectrofotometer of CD spectrometer te houden.
- Snijd een 2,5 cm x 2,5 cm stuk lichtgewicht karton (zoals karton uit een doos van labotorium weefsel), vouw deze dubbel, gesneden halverwege op de vouw, vouw de twee kleppen, gemaakt door het snijden, rug.
- Snijd een 5 cm x 5 cm stuk lichtgewicht karton, met een 1,5 cm x 1,5 cm in het vierkant gat in het midden. Gebruik door zwart isolatieband om de grootte van het ruim verminderen tot 0,5 cm x 0,5 cm.
- Tape de flappen van de gevouwen en gesneden karton tegen de 5 cm x 5 cm stuk karton zodat een kleine gebogen oppervlak wordt gecreëerd voor een aerogel monoliet direct op te zitten voor het 0,5 cm x 0,5 cm gat (zie figuur 2) . Plakt de achterkant stuk karton aan de UV-zichtbare spectrofotometer, zodat het gat is in lijn met de bundel pad.
- Meet de dikte van de gels, die zal worden gebruikt voor weglengte, met een micrometer.
- Plaats een gel op het karton platform en meet een spectrum 300-800 nm met lucht in de referentie compartiment van de UV-zichtbare spectrofotometer.
- Breng een polynoom, A = een n, met de golflengte (λ) regio waar de absorptie (A) is voornamelijk te wijten aan de achtergrond verstrooiing, ~ 700-800 nm. De coëfficiënt is typisch geschikt om een getal tussen 1 x 10 ~ 8 en 1 x 10 6 en de n coëfficiënt is typisch geschikt om een getal tussen ~ 2 en 3.
- Bereken de spreiding bij andere golflengten, waarbij de coëfficiënten a en n, verkregen uit de pasvorm.
- Trek deze berekende scatter achtergrond absorptie uit het ruwe spectrum om een scatter gecorrigeerd spectrum te verkrijgen.
- Breng de scatter afgetrokken spectrum met een Gauss-curve in het gebied van 370-490 nm met behulp van geschikte software (GRAM / AI 8,0) aan de piekhoogte, piek centrum en piekbreedte van de Soret piek van de aërogel bepalen.
- Breng de Wet bier-Lambert met behulp van de gemeten dikte van de gel voor weglengte (l), de extinctiecoëfficiënt 31 (ε) van 106.100 M -1 cm -1 c in de aërogel (A = εlc) berekenen.
- Vergelijk de berekende cyt. C concentratie de concentratie theoretisch in de gel (15 uM) om de levensvatbaarheid van cyt. C vaststellen binnen de aërogel. Typische procent levensvatbaarheid dicht bij 100%, maar het moet worden opgemerkt dat deze levensvatbaarheid zijn schattingen omdat de berekening gebaseerd op de extinctiecoëfficiënt van cyt. C in oplossing 31 dat verondersteld iets anders dan de extinctiecoëfficiënt van cyt zijn. c in de aerogels die niet bekend is.
- Run stikstof in de cd-instrument ten minste 5 minuten voordat u de lamp op.
- Tape de kartonnen houder van de CD spectrometer, zodat het gat is in lijn met de bundel pad.
- Meet een continue golflengte lege spectrum met niets in de kartonnen houder 350-500 nm bij 100 nm / min, met een gemiddelde van drie scans.
- Plaats een gel (dikte eerder gemeten in stap 6,2) op het karton platform en meet een spectrum 350-500 nm bij 100 nm / min, met een gemiddelde van drie scans.
- Herhaal de UV-zichtbare en CD metingen voor alle aerogel monolieten van belang.
7. Detect Aanwezigheid van stikstofoxide (NO) Gas met Cyt. C -silica Aerogels
LET OP: Het werken met NO is gevaarlijk en alle NO gas moet in een zuurkast worden behandeld of uitgeput in een zuurkast. Aanhoudende blootstelling aan NO toxisch voor weefsels zeer giftig stikstofdioxide en / of stikstoftetraoxyde zal vormen wanneer NO in contact komt met lucht. Warmte en corrosieve dampen worden ook geproduceerd als NO in contact komt met water.
- Plaats een 8 L stikstofoxide cilinder (10% stikstofoxide, 90% stikstof) in een goed geventileerde zuurkast en de druk aan te passen tot 4 psi.
- Verbinding slang aan zowel de stikstofoxide cilinder en een stikstofcilinder (druk ingesteld op 6 psi) en verbinden de uiteinden van de slang aan een T-klep (zie figuur 3a).
- Kies een aerogel monoliet voor het experiment en meet de dikte (of weglengte) met een micrometer.
- Plaats de aerogel (~ 3 mm dik) in een wegwerp kuvet met plastic dop en zet de cuvet in de spectrofotometer. Snijd de aerogel eventueel iets te passen in de cuvette.
- Plaats twee injectienaalden in de plastic dop van de cuvet, een op de uitgang van de T-klep en één verbonden met een buis te dienen als uitlaatgas in de zuurkast (zie figuur 3b). Gebruik Parafilm de naalden af te dichten de buis en de kap aan de cuvet.
- Plaats een lege disposable cuvet in de referentie cel.
- Pas de aerogel cuvette standpunt dat de aerogel ligt in de stralengang vóór het begin van het experiment.
- Neem een eerste spectrum 800-300 nm.
- Monitor het verschil tussen de absorptie bij 414 nm en de absorptie bij 408 nm liggen terwijl de T-klep te schakelen tussen stikstof en stikstofmonoxide / stikstof mengsel bij ingestelde tijdintervallen ervoor te zorgen dat op geen enkel moment is de stroomsnelheid van stikstof of stikstofoxide / stikstofmengsel zo hoog dat de aerogel beweegt rond in de cuvette.
- Neem een laatste spectrum 800-300 nm, zodra de blootstelling cycli worden afgewerkt.
- Herhalen met 03:57 monolieten gemiddeld sensor respons te verkrijgen.
Representative Results
De beschreven werkwijze geeft aërogels die levensvatbare cyt. C. Zoals aangegeven aan het einde van de inleiding, kan cyt. C worden ingekapseld uit waterige bufferoplossingen die variëren 4,4-70 mM fosfaat. Voorbeelden van cyt. C -silica (cyt. C SiO2) aerogel vervaardigd uit oplossingen met verschillende bufferconcentraties worden weergegeven in figuur 4. Alle gels relatief doorzichtig, met de gels uit 70 mM buffer de ondoorzichtige.
Een vergelijking van de spectroscopie van cyt. C onder verschillende omstandigheden wordt getoond in figuur 5. Een typisch spectrum (figuur 5c) toont de grote Soret piek rond 408 nm voor cyt. C SiO2 aerogels en is vergelijkbaar met het spectrum van cyt . c in oplossing (figuur 5a). Daarnaast is een spectrum van cyt.c ingekapseld in aerogels met metalen nanodeeltjes wordt ook getoond (figuur 5b) en de cyt. c SiO2 aerogel spectrum komt overeen met het spectrum ook. Wanneer de cyt. Is c SiO2 aerogel blootgesteld aan stikstofmonoxide wordt een typische verschuiving van de Soret piek waargenomen (Figuur 5d).
De UV-vis spectra gels uit cyt. C oplossingen in buffer variërende concentraties worden weergegeven in figuur 6. Al deze gels vertonen karakteristieke UV-zichtbare spectroscopie voorzien aangeeft dat cyt. C niet in een gedenatureerde toestand in de gels. De verminderde doorschijnendheid van de gels uit 70 mM buffer resulteert in een lagere signaal-ruisverhouding van deze spectra.
De CD spectra van cyt. C SiO2 aerogel is vergelijkbaar met de spectra van cyt c. c in gebufferde oplossing (figuur 7).
Figuur 8 toont een typische stikstofoxide controle reactie voor cyt. C SiO2 aerogels en bijbehorende aerogels die ook metalen nanodeeltjes bevat naast cyt. C. Het verschil tussen de absorptie bij 414 nm en bij 408 nm toe te nemen en dan afnemen wanneer de gels respectievelijk blootgesteld aan stikstofmonoxide en stikstof achtereenvolgens.
Als superkritisch kooldioxide niet voldoende langzaam tempo, de levensvatbaarheid van de cyt vrijkomt. C binnen de gevormde aerogels worden aangetast. Dit blijkt uit vergelijking van resulterende UV-zichtbare spectra na het vormen gels door het vrijgeven van het kooldioxide bij verschillenderates (Figuur 9).
Figuur 1: Kritisch punt drooginrichting Het kritische punt drooginrichting blijkt uit de (A) voor en (B) terug met de overdracht boot deur en inrichting weergegeven naast de achterkant van het apparaat..
Figuur 2: karton platform De gemonteerde kartonnen platform voor het vasthouden van een aërogel in het pad van een bundel instrument..
Figuur 3: Stikstofmonoxide sensing set-up De stikstofoxide sensing set-up wordt getoond met inbegrip van (A) de zuurkast meegeleverde 10% stikstofoxide., 90% stikstof cylinder, slangen, en T-ventiel, en (B) de cuvette met geplaatste naalden.
Figuur 4:.. Voorbeeld cyt c SiO2 aerogels aerogel inkapselende 15 uM cyt c in 4,4 mM, 40 mM en 70 mM kaliumfosfaatbuffer wordt in vergelijking met een dime van links naar rechts.. Deze aerogel zijn ongeveer 0,2-0,5-cm hoog. Overgenomen met toestemming 9.
Figuur 5:. Cyt c SiO2 aërogel spectroscopie Zichtbare spectra van 15 uM cytochroom c in (a) 50 mM fosfaatbuffer sol.ution; (B) Au (5 nm) ~ cyt c SiO2 aërogel.; (C) cyt c SiO2 aerogel (blootgesteld aan lucht).; (D) cyt. C SiO2 aerogel (blootstelling aan stikstofoxide gedurende 3,5 min). Deze representatieve spectra van elk type gel wordt gecompenseerd voor de duidelijkheid, en de stippellijn geeft de positie van de Soret piek van cyt. C in buffer. Terwijl elk spectrum van 15 uM cyt. C, de gel dikte (of hoogte) zijn alleen 0,2-0,5-cm vergeleken met de 1 cm cuvet oplossing resulteert in een hogere absorptie oplossing. Overgenomen met toestemming 9.
Figuur 6: Aerogel spectroscopie als ingekapseld buffer concentratie wordt gevarieerd Averaged UV-zichtbare spectrale absorptie van aerogels gedeeld door lengte gel pad voor gels inkapselen 15 _.6; M cyt c in 70 mm (zwart) (gemiddeld 4 spectra) 40 mm (rood, gestippeld) (gemiddeld 8 spectra) en 4,4 mm (groen, stippellijn) (gemiddeld 9 spectra) kaliumfosfaatbuffer. . Overgenomen met toestemming 9.
Figuur 7:... Aerogel circulair dichroïsme spectroscopie Circulaire dichroïsme spectra van cyt c in natriumfosfaat gebufferde oplossing (vast), twee representatieve spectra van cyt c SiO2 aërogels (onderbroken) en twee representatieve spectra van Au (5 nm) ~ cyt. c SIO 2 aerogel (stippellijn). Overgenomen met toestemming 9.
Figuur 8: Stikstofmonoxide detectie met cyt c SiO2. . sub> aerogel Monitoring van de shift (AA = A 414 nm - A 408 nm). in de Soret intensiteit van cyt c (vast rood) en Au ~ cyt c (gestippelde blauw) ingekapseld in SiO 2 samengestelde aerogel nanostructuur als gasstroom. wordt omgeschakeld tussen stikstof (waar maximaal Soret piek bij ~ 408 nm) en stikstofoxide (waar maximaal Soret piek bij ~ 414 nm). Elke curve is gemiddeld 3-4 studies met twee van de cyt c SiO2 proeven gevolgde AA A = 414 nm -. A 407 nm omdat de eerste maximum Soret piek was 407 nm voor deze onderzoeken. Overgenomen met toestemming 9.
Figuur 9:. Effect van superkritisch release tijd vloeistof Averaged UV-zichtbare spectrale absorptie gedeeld door lengte gel pad voor cyt c SiO2 aerogels ENCA.psulating 10 uM cyt. c in 50 mM fosfaatbuffer waarbij de supercritically gedroogde aerogelen zijn door ofwel los superkritisch kooldioxide op 45 min (vast, zwarte (gemiddeld 9 spectra)) of 7 min (onderbroken, rood (gemiddeld 4 spectra)). Overgenomen met toestemming 9.
Discussion
Zoals beschreven, heeft deze procedure consequent geproduceerd levensvatbare cyt. C ingekapseld aerogels. De concentratie van cyt. C binnen de aerogels kan variëren van 5 tot 15 uM en de bufferconcentratie van de oorspronkelijke cyt. C oplossing ingekapseld in de aerogels kunnen worden gevarieerd 4,4-70 mM fosfaat zonder ernstige nadelige effecten op de levensvatbaarheid eiwit. Echter, de piek centrum en de piek breedte van de karakteristieke cyt. C Soret piek in aerogel het dichtst bij wat ze zijn voor cyt. C in oplossing als cyt. C in aerogel is ingekapseld uit oplossingen van 40 mM buffer 9.
De synthese van de cyt. C SiO2 aerogelen wordt beïnvloed door de leeftijd van enkele van de start reagentia. Methanol, tetramethoxysilaan, en ammonium hydroxide oplossing zijn hygroscopisch en moet ieder naar twee maanden worden vervangen. De toegenomen water die opbouwt indeze reagentia tijd beïnvloedt de gel structuurkenmerken en de sol-naar-gel overgang tijd.
Bij het uitvoeren van superkritisch drogen, kan het kritische punt drooginrichting transfer boot maximaal achttien 0,5 cm dik, 1 cm diameter gels. Zoals in de sectie protocol moet een specifieke vullen en aftappen procedure gevolgd om kooldioxide te zetten in de sol-gels. Het is belangrijk op te merken dat aan het begin van het aftappen protocol, de drainerende mengsel van kooldioxide en aceton stroomt met zodanig hoge snelheid dat de afvoerslang bevriest stijf vocht condenseren ijs aan de buitenkant. Het mengsel aftappen out bevat een aantal water, omdat de aceton is niet watervrij en dit water kan soms bevriezen in een mate die de afvoerslang eigenlijk klompen. Er moet letten dergelijke klompen en een onderbreking van stroom te luisteren. De afvoerklep dient te worden gesloten voor een paar minuten, zodat de klomp zal smelten als een klomp wordt gedetecteerd. Inhet ergste geval, als de afvoer klep niet is gesloten, een klomp kan veroorzaken zo veel druk op te bouwen dat de afvoerslang met kracht knalt uit het apparaat. Na de eerste verversingsperiodes, zal de meerderheid van de aceton gespoelde uit de inrichting, en het optreden van nat ijs brokken zal drastisch afnemen. De ontlading zal geleidelijk lijken droog ijs als de drooglegging protocol gaat verder met het resterende bewijs van aceton aanwezigheid (zoals geur) steeds niet op te sporen door het einde van de drooglegging proces.
Na de kooldioxide in het apparaat is overgegaan van vloeistof superkritisch fluïdum en de ontluchting is begonnen, moet het afgeven van vloeistof met een lage snelheid over ten minste 45 min zoals aangegeven in de procedure 9. Een hogere afgiftesnelheid kan de levensvatbaarheid van cyt in de aerogelen verlagen. C (zie figuur 9) en de aerogels zelf kunnen zelfs splitsen als the vloeistof haast zich om te ontsnappen aan de gels. In het algemeen, zelfs als de aerogels intact na het openen van de deur inrichting blijven, is het belangrijk om zorgvuldig en voorzichtig behandelen alsof zij bros en kan gemakkelijk breken.
De besturing silica gels die naast de cyt uitgegoten. C SiO2 gels worden gebruikt na superkritisch drogen om te bepalen of de kooldioxide overdracht de gels geslaagd. Soms cyt. C SiO2 gels lijkt troebel en het is belangrijk om te bepalen of dit het gevolg is incomplete oplosmiddeloverdracht of het kan te maken hebben met de concentratie van de cyt. C of buffer ingekapseld in de gels. Als de silicagels zonder cyt. C lijken een homogeen, doorschijnend verschijning door het hebben, kan dit worden beschouwd als bewijs dat het oplosmiddel overdracht heeft plaatsgevonden, ook niet als de cyt. C SiO2 gels wat troebelheid hen. Troebelheid in de silicagelszonder cyt. c na drogen geeft aan dat sommige aceton in de gels bleef tijdens de ontluchting.
Zoals aangegeven in de sectie protocol, moeten belangrijke voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met stikstofmonoxide (NO). NO detecteren met de aerogels, is het noodzakelijk om de cuvette afdichting goed en het gas dat via aerogels in een zuurkast uitlaat. Alternatief kan de gehele spectrofotometer worden verplaatst naar een zuurkast met de NO gascilinder als extra voorzorgsmaatregel beperken van de blootstelling aan NO gas. Bij contact met lucht NO zal aanstonds de zeer giftige stikstofdioxide, stikstoftetroxide of beide. NO kan ook reageren met water om warmte en bijtende dampen produceren. Daarom kan langdurige blootstelling aan NO leiden tot direct toxiciteit weefsel.
Bij gebruik van de cyt. C SiO2 aërogels de aanwezigheid van stikstofmonoxide, dan voeren de Soret band aanvankelijk ten ~ 408 nm en verschuiventot ~ 414 nm in aanwezigheid van stikstofoxide. Na het inschakelen terug naar stikstof, moet de Soret band terug te keren naar zijn gecentreerd op ~ 408 nm. Het kan ook mogelijk zijn om de cyt gebruiken. C SiO2 aërogels de aanwezigheid van andere liganden te detecteren zoals koolmonoxide 27.
Verschillende beschreven werkwijzen omvatten een extra stap van het combineren gouden of zilveren nanodeeltjes met cyt. C in oplossing vóór het mengen van de sol en supercritically drogen tot 4-8 aerogels vormen. Vergelijken van de UV-zichtbare spectroscopie van cyt. C ingekapseld in aërogels met metalen nanodeeltjes die van cyt. C ingekapseld in aërogels zonder metaalnanodeeltjes blijkt dat deze twee soorten inkapselingstechnieken produceren cyt. C gelijksoortige levensvatbaarheid binnen de aerogels (figuur 5) . De cyt. C ingekapseld met metalen nanodeeltjes iets stabieler dan cyt. C kapselend zonder metalen nanodeeltjes in de aerogels 9. De CD spectra van beide soorten cyt. C aerogel is ook vergelijkbaar, hoewel beide verschillen van het spectrum van cyt. C in buffer aangeeft sommige ontvouwen van cyt. C binnen de aerogels (Figuur 7). Eerdere verslagen over cyt. C ingekapseld in aërogels suggereren dat de circulair dichroïsme spectroscopie waarschijnlijk beoordeelt de buitenste laag van eiwitten, ontvouwde bij contact met silicagel, respectievelijk tot metaal nanodeeltje-kernhoudende meerlaags cyt. C structuren of los georganiseerde structuren vormen als er geen metalen nanodeeltjes aanwezig zijn in aerogels 4,9. De meerderheid van de cyt. C in beide typen zelforganiserende structuur binnen de aerogelen gevouwen blijft zoals gemeten met UV-spectroscopie wel. Het voordeel van de hierin beschreven zonder nanodeeltjes protocol is dat dure aankoop of tijdrovende synthese van metaalnanodeeltjes is niet noodzakelijk. Eiwitten vaak niet met succes ingekapseld in aerogels, en dus deze procedure is belangrijk omdat het kan leiden tot de ontwikkeling van een meer algemene methode voor het inkapselen van andere eiwitten in aërogels met potentiële betekenis voor toekomstige bioanalytische apparaten.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Steun voor dit werk en / of publicatie werd verstrekt door de Science Institute van Fairfield University's College van Kunsten en Wetenschappen, Fairfield Universiteit Faculty Research Grant, een Cottrell College Science Award van de Research Corporation for Science Advancement, Fairfield University's College of Arts & Sciences en Fairfield University Scheikunde en Biochemie afdeling. Wij dankbaar erkennen Jean Marie Wallace voor veel nuttig inzicht en advies met betrekking tot deze algemene onderzoeksgebied. Daarnaast breiden we een heel speciale dank aan alle vroegere, huidige en toekomstige undergraduate onderzoekers van de Harper-Leatherman Research Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
| Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
| pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
| Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
| Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
| Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 ml |
| Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
| Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0%-30.0% |
| General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor |
| generic plastic wrap | various | ||
| Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 ml syringe | |
| Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
| Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
| Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
| Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
| Micrometer | Central Tool Company | ||
| GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
| Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
| 10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
| Tygon tubing | various | ||
| T-switch valve | various | ||
| syringe needles | various |
References
- Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
- Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
- Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
- Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
- Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
- Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
- US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
- Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
- Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
- Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
- Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
- Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
- Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
- Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
- Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
- Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
- Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
- Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
- Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
- Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
- Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
- Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
- Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
- Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
- Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
- Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
- Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
- Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
- Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
- Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
- Margoliash, E., Frohwirt, N.
