Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التغليف السيتوكروم Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

يصف هذا الإجراء كيفية تغليف السيتوكروم ج (CYT. ج) في السيليكا (شافي 2) سول المواد الهلامية، وعملية هذه المواد الهلامية لتشكيل bioaerogels، واستخدام هذه bioaerogels الاعتراف بسرعة أكسيد النيتريك (NO) من خلال تفاعل طور الغاز. هذا النوع من البروتوكول قد يساعد في التنمية المستقبلية من أجهزة الاستشعار أو أجهزة bioanalytical أخرى.

Abstract

وقد تحسنت التطبيقات مثل أجهزة الاستشعار، والبطاريات، وخلايا الوقود من خلال استخدام aerogels المسامية العالية عندما يتم تغليف مركبات وظيفية ضمن aerogels. ومع ذلك، توجد بعض التقارير عن التغليف البروتينات داخل الهلام سول التي يتم تجهيزها لتشكيل aerogels. (NO) ويرد الإجراء لتغليف السيتوكروم ج (CYT. ج) في السيليكا (شافي 2) سول المواد الهلامية التي تتم معالجتها supercritically لتشكيل bioaerogels مع النشاط الغاز مرحلة لأكسيد النتريك. يضاف CYT. ج إلى سول السيليكا مختلطة تحت تركيز البروتين للرقابة والعازلة الشروط قوة. ثم تبلور الخليط سول ويتم استبدال السائل ملء المسام الجل من خلال سلسلة من المبادلات المذيبات مع ثاني أكسيد الكربون السائل. يتم جلب غاز ثاني أكسيد الكربون إلى نقطة حرجة وتنفيس قبالة لتشكيل aerogels الجافة مع CYT. ج مغلفة داخل. وتتميز هذه bioaerogels مع التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئيةد دائري الطيفي ازدواج اللون، ويمكن استخدامها للكشف عن وجود أكسيد النيتريك الغاز المرحلة. نجاح هذا الإجراء يعتمد على تنظيم CYT. تركيز ج وتركيز العازلة ولا يتطلب مكونات أخرى مثل المعادن النانوية. قد يكون من الممكن لتغليف البروتينات الأخرى التي تستخدم نهجا مماثلا مما يجعل هذا الإجراء مهم لتطوير جهاز bioanalytical المحتملة في المستقبل.

Introduction

السيتوكروم ج (CYT. ج) هو مفتاح البروتين الإلكترون نقل تشارك في التفاعلات التنفس الخلوية في الجسم. ولقد ثبت أن تشارك في موت الخلايا المبرمج، وهو شكل رقابة من موت الخلايا، ويمكن الكشف عن مثل هذه الجزيئات السامة صغيرة أكسيد النتريك وأول أكسيد الكربون 1-3. أكسيد النيتريك (NO) يلعب دورا في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية التي تحدث في الجهاز العصبي، القلب والأوعية الدموية، والجهاز المناعي. في حين CYT. ج عادة ما يتطلب بيئة مائية مخزنة على قيم الرقم الهيدروجيني محايدة لتبقى سليمة هيكليا ونشطة، وقد أظهرت الأبحاث أن CYT. ج يمكن الاحتفاظ هيكلها وظيفة في المواد الصلبة المعروفة باسم aerogels في ظل ظروف معينة 4-9.

Aerogels هي مواد مسامية عالية وغالبا ما شكلت عن طريق تجميع أكاسيد المعادن سول هلام (بينما aerogels أكسيد المعادن شائعة جدا، وقد تم تصنيعه الكربون وغيرها من أنواع aerogels. ومن الأمثلة على البرنامج النووي العراقي آير ogels) 10 وتجفيف هذه الهلام سول في مثل هذه الطريقة التي يتم بثها المصفوفة الصلبة التي يسهل اختراقها دون تغيير 11-14. كل مسام في aerogels الصلبة يؤدي في المساحة المتاحة مما aerogels الكثير مفيدة للغاية لأي طلبات حيث ردود الفعل السطحية مهمة. عندما يتم تجميعها الكيميائية أو وظيفة البيوكيميائية داخل nanoarchitecture ايروجيل، فقد تبين أن المسامية البدنية وتعزيز المساحة السطحية للaerogels تساعد على تحسين أجهزة الاستشعار، وكذلك الأقطاب الكهربائية للبطارية، وخلايا الوقود، وsupercapacitor تطبيقات 11،15-23 . من أجل تجفيف aerogels بطريقة يترك المصفوفة الصلبة التي يسهل اختراقها دون تغيير، فمن نموذجي لإزالة المذيب الذي يبقى في المسام بعد التوليف سول-جل عن طريق الاستخلاص بالمذيبات فوق الحرجة. يتم الحد من أي انهيار المسام التي قد تكون ناجمة عن قوى التوتر السطحي كما يتبخر المذيب من هلام لأنه في تجفيف فوق الحرجة، واجهة السائل بخار أبدا الأشكال.

"jove_content"> هناك العديد من التقارير من البروتينات الهيم مثل CYT. ج يجري مغلفة في الهلام سول التي تم الاحتفاظ بها رطبة أو التي تم تجفيفها ambiently 24-30. تقارير لتغليف الجزيئات الحيوية في الهلام سول أن ثم يتم تجفيفها supercritically لتشكيل aerogels هي نادرة بسبب معالجة الضرورية التي يمكن أن تكون ضارة للهيكل العديد من البروتينات. في حالة CYT. ج، ظروف معينة تجعل من الممكن الإبقاء على قدرة CYT. ج لكشف والرد على أكسيد النيتريك الطور الغازي ضمن aerogels. مرة واحدة استقرت في ايروجيل، بنية المسام ذات جودة عالية من ايروجيل يسهل التفاعل بين CYT. ج و4،8،9 أكسيد النيتريك. CYT. ج يمكن أن تكون مغلفة داخل aerogels من خلال ربط لأول مرة في طبقات متعددة في جميع أنحاء الذهب أو الفضة النانوية في حل 4-8. هذه الفوقية متعددة الطبقات تعمل على حماية بروتين داخل المصفوفة ايروجيل. في approac الأخيرح التي قمنا بتطويرها، عندما سيطر على تركيز البروتين والعازلة قوة جنبا إلى جنب مع الظروف الاصطناعية الأخرى، CYT. تحتفظ ج النزاهة داخل aerogels حتى من دون جسيمات متناهية الصغر المعادن جمعية الأولية 9.

يبدأ التركيب وتبدأ العديد من توليفات ايروجيل عن طريق خلط السلائف السيليكا سول-جل لفترة معينة من الزمن. فمن بعد مجموعة خلط الوقت الذي CYT. يضاف ج كحل مخزنة في الخليط. ثم يحدث دبق لتشكيل هيكل متين السيليكا التي يسهل اختراقها والتي تمتلئ المسام بالماء، والميثانول، وتبقى المواد المتفاعلة والمنتجات الثانوية. هذا السائل الذي يملأ المسام يمكن أن تشطف الخروج مع المذيبات المختلفة من خلال سلسلة من المبادلات المذيبات، وكان آخر التبادلات مع ثاني أكسيد الكربون السائل تجري ضمن جهاز نقطة تجفيف حاسما حافظ على درجة حرارة منخفضة. جلب المواد الهلامية أعلى من درجة الحرارة الحرجة (31.1 درجة مئوية) من ثاني أكسيد الكربون يسهل تشكيل مثلالسائل upercritical داخل جهاز الضغط التي يمكن تنفيس لتشكيل الجافة، aerogels المسامية العالية. درجة حرارة منخفضة نسبيا اللازمة لثاني أكسيد الكربون لتكوين السوائل فوق الحرجة هو مفيد مقارنة مع غيرها من المذيبات لأنها تحافظ على بروتين أقل من درجة الحرارة التي يمكن أن تفسد.

لدينا المعادن نهج خالية من جسيمات متناهية الصغر لتغليف CYT. ج في aerogels هو مفيد لأنه هو إجراء بسيط يمكن أن تؤدي إلى وضع بروتوكول أكثر قابلية للتطبيق بشكل عام لتغليف البروتينات الأخرى كذلك. قد لا تتفاعل العديد من البروتينات مع المعادن النانوية في بنفس الطريقة التي CYT. ج يفعل والتوليف جسيمات متناهية الصغر المعدن أو شراء يضيف الوقت ونفقات إضافية لهذا الإجراء. تقارير قليلة على التغليف البروتينات في aerogels تجعل تطوير هذا الإجراء خطوة هامة إلى الأمام في إيجاد إجراءات أكثر عمومية لتغليف بروتينات أخرى في aerogels التي قد تساعد طn اللاسلكية bioanalytical المحتملة في المستقبل.

قسم البروتوكول من هذه المخطوطة يوضح كيفية تجميع السيليكا سول المواد الهلامية، وتغلف CYT. ج في هذه الهلام سول، تجف هذه المركبة سول المواد الهلامية لتشكيل aerogels وتوصيف هذه bioaerogels باستخدام الأشعة فوق البنفسجية مرئية والتعميم الطيفي ازدواج اللون وكشف عن وجود من الطور الغازي أكسيد النيتريك مع هذه bioaerogels. CYT. وقد تم تغليف ج بنجاح في aerogels عندما يذوب أولا في 4،4 حتي 70 مم المحاليل المائية من العازلة الفوسفات. ومع ذلك، فقد تم العثور على هيكل بروتين الأمثل في aerogels أن ينتج عندما التغليف 40 ملي فوسفات حلول مخزنة من CYT. ج المنتجة للتحميل CYT ايروجيل. تركيزات ج في حدود 5 إلى 15 ميكرومتر 9. ولذلك، فإن بروتوكول الواردة أدناه هي لتجميع aerogels باستخدام حلول 40 ملي الفوسفات من CYT. ج مما أدى إلى CYT تحميل. تركيز ج في aerogels من 15 ميكرومتر <./ P>

Protocol

النظارات الواقية أو نظارات واقية، ومعطف المختبر، وقفازات المختبر يجب أن ترتديه في جميع الأوقات أثناء العملية. أبدا تشغيل جهاز نقطة تجفيف حرجا بدون النظارات الواقية أو نظارات. ينبغي معالجة جميع الحلول التي تحتوي على tetramethoxysilane، والميثانول والايثانول والأسيتون، والأمونيا داخل غطاء الدخان.

1. جعل العازلة وCYT. حلول ج

  1. لجعل ~ 750 مل من درجة الحموضة 7 و 40 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم، أولا إعداد 500 مل من 0،04 M البوتاسيوم الفوسفات أحادي القاعدة وزنها عن طريق 2،72 غرام من أحادي فوسفات البوتاسيوم وإذابة في الماء باستخدام 500 مل دورق حجمي.
  2. إعداد 500 مل من 0،04 M البوتاسيوم الفوسفات ثنائي القاعدة وزنها عن طريق 3،48 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم وإذابة في الماء باستخدام 500 مل دورق حجمي.
  3. صب محلول ملحي ثنائي القاعدة في كوب كبير مع بقضيب وتبدأ اثارة الحل على طبق من ضجة.
  4. ببطء إضافة أجزاء من الملح أحادي القاعدة الصورةolution إلى المحلول الملحي ثنائي القاعدة في حين رصد درجة الحموضة مع القطب درجة الحموضة ومتر حتى الرقم الهيدروجيني هو 7.00. وسوف تستخدم ما يقرب من 250-300 مل من محلول ملح أحادي القاعدة.
  5. تزن بها ما يقرب من 0.023 غرام من CYT. ج ووضعه في قارورة زجاجية التلألؤ. إضافة 2000 ميكرولتر من العازلة فوسفات البوتاسيوم استعداد باستخدام micropipette ثم دوامة بلطف الحل لمزيج حتى كل من الصلبة، CYT الحمراء. قد حلت ج في حل ولا يبقى الجسيمات.
  6. يستغرق 20 ميكرولتر من CYT. الحل ج إعداد وإضافة إلى 1 سم طول مسار كفيت البلاستيك. إضافة 3 مل من العازلة استعداد.
  7. أخذ الأشعة فوق البنفسجية تجاه الطيف 300-700 نانومتر باستخدام عازلة في الخلية المرجعية. استخدام CYT. ج الامتصاصية (A) في 409 نانومتر، ومعامل انقراض 31 (ε) من 106100 م -1 سم -1، وطول الطريق كوفيت (ل)، وقانون بير لامبرت لتحديد تركيز (ج) من الحل (A = εlc).
  8. العودة حساب تركيز المحلول استعداد الأصلي. ومل 2 أعدت CYT. ج الحل هو عادة ما بين 0،7-0،9 مم في التركيز.
  9. تمييع إعداد CYT. الحل ج الأصلي إلى 800 ميكرولتر من 0.105 ملم من قبل pipetting 117 ميكرولتر من 0.72 ملم إعداد CYT. ج الحل في قارورة التلألؤ. قم بإضافة رصيد 800 ميكرولتر (683 ميكرولتر في هذه الحالة) من العازلة استعداد. دوامة لخلط. وتختلف أحجام الدقيق اعتمادا على تركيز الدقيق للCYT إعداد الأصلي. الحل ج حيث بلغ حجم CYT. ج ليتم احتساب الماصة كما (800 ميكرولتر * 0.105 ملم) / (CYT الأصلية. تركيز ج مم).
  10. تخزين الأصلية CYT مستعدة والمخففة. حلول ج في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة حتى جاهزة للاستخدام لمدة تصل إلى أسبوعين.

2. توليف السيليكا (شافي 2) سول

  1. تسمية المتاح البولي بروبلين 50 مل دورق "كنالعكر A '. ضع الكأس على عموم على توازن التحليلي واستخدام الزجاج ماصة باستير ليضيف للمؤشر 1.88 ز tetramethoxysilane في الكأس. صفر التوازن وثم ماصة 2.88 غرام من الميثانول في "بيكر A '.
  2. غطاء "بيكر A 'مع بارافيلم.
  3. تسمية المتاح البولي بروبلين 50 مل دورق "بيكر B '. إضافة شريط مغناطيسي ومكان على عموم من الميزان التحليلي. استخدام ماصة الزجاج لإضافة 0.75 ز المياه و3.00 ز الميثانول.
  4. غطاء "بيكر B 'مع بارافيلم.
  5. تبدأ اثارة محتويات "بيكر ب" على طبق من ضجة داخل غطاء الدخان، ثم استخدم حقنة لادخال 5 ميكرولتر من 28،0-30،0٪ محلول هيدروكسيد الأمونيوم من خلال بارافيلم تغطية إلى الخليط مع التحريك.
  6. حالما الخطوة 2.5 كاملة، إضافة محتويات "بيكر A 'إلى' بيكر B '. يحرك الخليط لمدة 20 دقيقة في حين غطت في بارافيلم.

3. إعداد جل قوالب

ملاحظة: هناكحان الوقت لإعداد قوالب الجل بينما سول خليط السيليكا تثير في الخطوة 2.6.

  1. الحصول على 8-9 قوارير البولي بروبلين التلألؤ (16 ملم × 57 ملم، وحجم حجم 6.5 مل، مع قيعان شرائح إيقاف) وقبعات المقابلة. وضع الاغطية البلاستيكية على نهاية غطاء القارورة لخلق سطح مستو للهلام لتشكيل لووضع الغطاء فوقه التأكد من أن الاغطية البلاستيكية يظل سليما داخل الغطاء.
  2. تصطف قوارير مع غطاء نهاية أسفل على أعلى مقاعد البدلاء، وفتح قيعان مواجهة.

4. إعداد CYT. ج -silica سول المواد الهلامية

  1. عند الانتهاء من سول خلط (الخطوة 2.6)، إضافة 3 مل من الخليط سول لالمتاح كوب 50 مل البولي بروبلين نظيفة.
  2. استخدام ماصة باستير الزجاج لإسقاط ببطء 500 ميكرولتر من 0.105 ملي المخفف CYT. الحل ج (صنع في خطوة 1.9) إلى سول خليط 3 مل على مدار ~ 1 دقيقة. تأكد من دوامة بلطف الخليط في حين اضاف CYT. ج لتجنب تشكيل كبيركتل حمراء. وإذا افترضنا أن أحجام التداول المضافة، عن طريق تمييع 500 ميكرولتر من الحل ج 0.105 ملي CYT. إلى 3500 ميكرولتر، وتركيز ج الآن في سول هو CYT.، من الناحية النظرية، 15 ميكرومتر.
  3. الماصة 0.5 مل من الناتج CYT. سول ج السيليكا في كل قالب استعداد. الماصة أيضا 0.5 مل المتبقية "عادي" سول السيليكا إلى واحد أو اثنين من قوالب لاستخدام عينات السيطرة خلال عملية التجفيف فوق الحرجة.
  4. تغطية فتحات مكشوفة من القوالب مع بارافيلم ووضع في الثلاجة (~ 2-8 درجة مئوية) بين عشية وضحاها أو لا يقل عن 12 ساعة لإنتاج المواد الهلامية سول.
  5. خذ القوالب من الثلاجة. إزالة بارافيلم من أعلى قالب واحد يحتوي على CYT ج سول-جل؛ أيضا إزالة الغطاء والاغطية البلاستيكية من القاع.
  6. بعد إضافة بعض الايثانول من زجاجة غسل في القالب، استخدم نهاية القرص دائرية من المكبس حقنة لدفع بعناية الجل من العفن وإلى 20 مل الزجاج التلألؤ قارورة تابع نظيفةaining حوالي 5 مل من الايثانول.
  7. كرر هذا الإجراء إزالة هلام (الخطوات 4.5 و 4.6) حتى كل من CYT. تضاف المواد الهلامية ج إلى القارورة وجميع المواد الهلامية السيليكا تضاف إلى قارورة منفصلة. إذا أحرز تركيز أكثر من CYT. هلام ج، تأكد من تخزين مثل المواد الهلامية معا داخل قارورة منفصلة. ثم ملء قارورة إلى الأعلى مع الإيثانول، وكأب وتخزينها بين 2-8 درجة مئوية.
  8. كل أربع ساعات على مدار اليوم، وإزالة المواد الهلامية من الثلاجة، صب الايثانول من المواد الهلامية واستبدالها مع الإيثانول النقي.
  9. خلال ثلاثة أيام إضافية، غمر المواد الهلامية سول الرطب في الأسيتون، الصب وإضافة الأسيتون الطازجة ثلاث مرات في اليوم.

5. Supercritically الجاف CYT. ج -silica سول المواد الهلامية

  1. تبريد جهاز نقطة تجفيف حاسم (انظر الشكل 1) إلى 10 درجة مئوية خلال تحديد درجة الحرارة من دائري المرفقة إلى 8 درجات مئوية.
  2. وبمجرد أن الجهاز لديه صeached 10 درجة مئوية، وإجراء اختبار تسرب على الجهاز عن طريق ملء قارب نقل مع الأسيتون وختم ذلك داخل الجهاز.
    1. فتح صمام ملء الجهاز وإضافة ثاني أكسيد الكربون حتى الجهاز هو نصف كامل.
    2. إغلاق صمام التعبئة والاستماع بعناية لالهسهسة في الأبواب والصمامات حيث الحلقات أو الأختام ربما يتدهور.
    3. استبدال أي الحلقات أو الأختام إذا تم العثور على تسرب.
  3. بعد الانتهاء من الاختبار تسرب، افتح صمام استنزاف للافراج عن الأسيتون وثاني أكسيد الكربون في نزيف غطاء الدخان. ثم إزالة قارب نقل من الجهاز.
  4. بعد التأكد من أن الجهاز هو مجانا للتسرب، صب بعناية المواد الهلامية الرطب من قارورة التلألؤ، جنبا إلى جنب مع أكثر من الأسيتون، إلى أقسام على مدى ثلاثة القارب نقل في (سلال عينة أو أغطية الشاش ليست ضرورية). بدقة دفع وتحريك المواد الهلامية داخل القارب مع ملقط لضمان أن كل المواد الهلامية وغرقت أنا تمامان الأسيتون. إضافة المزيد من الأسيتون إذا لزم الأمر قبل أن ينتزع القارب داخل الجهاز.
  5. فتح صمام ملء الجهاز لإضافة ثاني أكسيد الكربون، ثم فتح صمام استنزاف للافراج عن الأسيتون لمدة خمس دقائق في أقرب وقت لوحظ الأسيتون الاختلاط مع ثاني أكسيد الكربون إلى أن غرق في الجزء السفلي من الجهاز من خلال نافذة الجهاز. سيحدث هذا تتسرب من الأسيتون إلى أسفل قبل أن يتم ملء الجهاز بالكامل مع ثاني أكسيد الكربون، وبالتالي فإن ملء صمام يجب أن تبقى مفتوحة بالقدر اللازم خلال تجفيف بحيث الجهاز سوف تستمر لملء حتى حين استنزاف مفتوحة.
  6. أغلق صمام التصفية. الحفاظ على ملء صمام تصدع مفتوحة قليلا.
  7. وبعد خمس دقائق، وفتح صمام استنزاف لمدة خمس دقائق مرة أخرى وضبط صمام التعبئة لأن تفتح بما فيه الكفاية بحيث لا يبقى الجهاز الكامل خلال فترة تصريف كله. إغلاق صمام استنزاف، والحفاظ على ملء صمام تصدع مفتوحة، ثم كرر هذه الخطوة استنزاف احد مزيد من الوقت خمسبعد دقائق.
  8. وبعد هذه الخطوات الثلاث الصرف الأولى، فتح استنزاف لمدة 5 دقائق في المرة الواحدة تقريبا كل 40 دقيقة على مدى ست ساعات على الأقل لضمان استبدال كامل من الأسيتون من ثاني أكسيد الكربون السائل ضمن المواد الهلامية. ضبط دائما صمام التعبئة لتكون مفتوحة بما فيه الكفاية خلال كل تجفيف بحيث أن مستوى السائل في الجهاز أبدا تنخفض نسبة أعلى من القارب خلال استنزاف.
  9. الخطوات مرة واحدة استنزاف كاملة، وإغلاق صمام التعبئة، واستنزاف ثاني أكسيد الكربون السائل بحيث يبقى مستوى مرئية فقط فوق شوكات على القارب من خلال النظر من خلال النافذة الجهاز.
  10. ضبط درجة الحرارة لجهاز دائري المرفقة إلى 40 درجة مئوية للتأكد من أن السائل ارتفاع ثاني أكسيد الكربون فوق في درجة الحرارة الحرجة والضغط (T ج = 31 درجة مئوية؛ P ج = 7.4 ميجا باسكال).
  11. بعد ما يقرب من 15 دقيقة، ومراقبة الانتقال من السائل إلى السائل فوق الحرج من خلال نافذة جهاز مثل menisc السائللنا فوق شوكات القارب يختفي. سماح لا يقل عن 15 دقيقة من الوقت موازنة، ثم فتح صمام تنفيس كمية صغيرة للبدء في الافراج عن السوائل فوق الحرجة.
  12. على مدار ما يقرب من 45 دقيقة، ومواصلة فتح تدريجيا صمام تنفيس أوسع وأوسع بحيث يمكن سماع همسة ثابتة، ولكنها منخفضة جدا من الافراج عن السوائل ويلاحظ مقياس الضغط لخفض ببطء إلى الصفر.
  13. بعد أن ذهب ضغط من الجهاز إلى الصفر، وفتح الباب الجهاز، وإزالة القارب، واستخدام ملقط لوضع aerogels المجفف حديثا في قوارير الزجاج التلألؤ نظيفة.

6. تميز CYT. ج -silica Aerogels مع الأشعة فوق البنفسجية مرئية والتعميم ازدواج اللون (CD) الطيفي

  1. إعداد منصة الورق المقوى لعقد كتل ايروجيل في مسار الشعاع من معمل أو CD مطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئية.
    1. قطع قطعة 2.5 سم × 2.5 سم من الورق المقوى خفيف الوزن (مثل الورق المقوى من مربع من لبوالأنسجة بمختبر)، أضعاف في النصف، وقطع منتصف الطريق حتى على الغطاء، ثم أضعاف اثنان اللوحات، التي أنشئت عن طريق قطع والظهر.
    2. قطع 5 سم × 5 سم قطعة من الورق المقوى خفيف الوزن، مع 1.5 سم × 1.5 سم ثقب مربع في الوسط. ثم استخدم شريط كهربائي أسود لتقليل حجم الانتظار إلى 0.5 سم × 0.5 سم.
    3. الشريط اللوحات من الورق المقوى مطوية وخفض ضد 5 سم × 5 سم قطعة من الورق المقوى بحيث يتم إنشاء سطح عازمة صغير لمتراصة ايروجيل على الجلوس على مباشرة أمام ثقب 0.5 سم × 0.5 سم (انظر الشكل 2) . ثم الشريط قطعة الظهر من الورق المقوى لطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية حتى ثقب يتماشى مع مسار الشعاع.
  2. قياس سمك المواد الهلامية، والتي سيتم استخدامها لفترات المسار، مع ميكرومتر.
  3. وضع الجل واحد على منصة الورق المقوى وقياس الطيف 300-800 نانومتر مع الهواء في مقصورة المرجعية لطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية.
  4. تناسب متعدد الحدود، A = أ ن، إلى المنطقة الطول الموجي (λ) حيث هو الامتصاصية (A) ويرجع ذلك أساسا إلى تشتت الخلفية، ~ 700-800 نانومتر. ومعامل يصلح عادة إلى عدد يتراوح بين ~ 1 × 10 8 و 1 × 10 6 ومعامل ن يصلح عادة إلى عدد يتراوح بين 2 و 3 ~.
  5. حساب مبعثر في موجات أخرى، وذلك باستخدام معاملات، وون، تم الحصول عليها من يصلح.
  6. طرح هذا يحسب الامتصاصية مبعثر خلفية من الطيف الخام للحصول على مبعثر تصحيح الطيف.
  7. تناسب مبعثر طرح طيف مع منحنى جاوس في المنطقة من 370-490 نانومتر باستخدام البرمجيات المناسبة (جرام / AI 8.0) لتحديد ذروة الارتفاع، وسط ذروة، وذروة عرض ذروة سوريه من ايروجيل.
  8. تطبيق قانون بير لامبرت باستخدام سمك يقاس من هلام لطول المسار (ل)، ومعامل انقراض 31 (ε) من 106100 م -1 سم -1 ج في ايروجيل (A = εlc).
  9. مقارنة CYT المحسوبة. تركيز ج لتركيز نظريا في هلام (15 ميكرومتر) للتأكد من صلاحية CYT. ج داخل ايروجيل. viabilities في المئة النموذجية هي قريبة من 100٪، ولكن تجدر الإشارة إلى أن هذه viabilities تقديرات فحسب لأنه يعتمد الحساب على معامل انقراض CYT. ج في حل 31 التي يفترض أن تكون مختلفة قليلا من معامل انقراض CYT. ج في aerogels غير معروفة.
  10. النيتروجين تشغيل في الصك CD 5 دقائق على الأقل قبل تحويل مصباح جرا.
  11. الشريط حامل الورق المقوى لمطياف مضغوط حتى ثقب يتماشى مع مسار الشعاع.
  12. قياس طول موجة الطيف فارغة المستمر مع أي شيء في حامل الورق المقوى 350-500 نانومتر في 100 نانومتر / دقيقة، مع ما معدله ثلاثة بالاشعة.
  13. وضع الجل واحد (سمك قياس سابقا في الخطوة 6.2) على منصة الورق المقوى وقياس الطيف 350-500 نانومتر في 100 نانومتر / دقيقة، مع ما معدله ثلاثة بالاشعة.
  14. تكرار القياسات مرئية للأشعة فوق البنفسجية وCD لجميع كتل ايروجيل من الفائدة.

7. الكشف عن وجود اكسيد النيتريك (NO) الغاز مع CYT. ج -silica Aerogels

تنبيه: العمل مع أي أمر خطير وينبغي التعامل مع كل NO الغاز في غطاء الدخان أو استنفدت في غطاء الدخان. أصيب التعرض لNO غير سامة للأنسجة كما سامة للغاية ثاني أكسيد النيتروجين و / أو رباعي أكسيد النيتروجين ستشكل عندما يأتي لا في ملامسة الهواء. ويتم إنتاج الحرارة وتآكل أبخرة أيضا عندما يتعلق الأمر NO في اتصال مع الماء.

  1. وضع 8 L أكسيد النيتريك اسطوانة (10٪ أكسيد النيتريك، 90٪ نيتروجين) في غطاء الدخان جيد التهوية وضبط الضغط إلى 4 رطل.
  2. ربط أنابيب إلى كل من اسطوانة أكسيد النيتريك واسطوانة النيتروجين (الضغط لتعيين 6 ملاحظةط) وربط نهايات الأنابيب إلى T-صمام (انظر الشكل 3A).
  3. اختر متراصة ايروجيل للتجربة وقياس سماكة (أو طول المسار) مع ميكرومتر.
  4. وضع ايروجيل (~ 3 مم) في كوفيت القابل للتصرف مع غطاء من البلاستيك ووضع كفيت في معمل. قطع ايروجيل قليلا إذا لزم الأمر لتناسب في كفيت.
  5. إدراج اثنين من الإبر حقنة في غطاء من البلاستيك من كفيت، واحد متصل إخراج T-صمام، واحد متصل إلى أنبوب لتكون بمثابة العادم في غطاء الدخان (انظر الشكل 3B). استخدام بارافيلم لختم الإبر إلى الأنبوب والغطاء لكفيت.
  6. وضع كوفيت القابل للتصرف فارغة في مرجع الخلية.
  7. ضبط الموقف كفيت ايروجيل للتأكد من أن ايروجيل يكمن في مسار الشعاع قبل بدء التجربة.
  8. خذ الطيف الأولي 800-300 نانومتر.
  9. رصد الفرق بين الامتصاصية في 414 نانومتر، والامتصاصية في 408 نانومتر في حين تحول T-صمام للتبديل بين النيتروجين وأكسيد النيتريك / مزيج النيتروجين في فترات زمنية مجموعة التأكد من أن في أي وقت من الأوقات هو معدل تدفق النيتروجين أو أكسيد النيتريك / مزيج النيتروجين عالية جدا، بحيث وايروجيل يتحرك حولها في كفيت.
  10. اتخاذ طائفة النهائي 800-300 نانومتر، حالما يتم الانتهاء من دورات التعرض.
  11. كرر الإجراء مع 3-4 كتل للحصول على متوسط ​​استجابة الاستشعار عن بعد.

Representative Results

نتائج الإجراء الموضح في aerogels تحتوي على CYT قابلة للحياة. ج. كما هو محدد في نهاية المقدمة، CYT. ج يمكن أن تكون مغلفة من المحاليل المائية التي تتراوح 4،4 حتي 70 مم الفوسفات. أمثلة من CYT. ج -silica (CYT. ج -SiO 2) aerogels مصنوعة من المحاليل التي تحتوي على تركيزات عازلة المختلفة هو مبين في الشكل (4). جميع المواد الهلامية هي شفافة نسبيا، مع المواد الهلامية مصنوعة من 70 ملي العازلة الأكثر غموضا.

وأظهرت مقارنة بين التحليل الطيفي من CYT. ج تحت ظروف مختلفة في الشكل (5). وهناك طائفة نموذجي (الشكل 5C) يظهر ذروة سوريه كبيرة حول 408 نانومتر لCYT. ج -SiO 2 aerogels وهي مشابهة جدا لطيف CYT (ج) في حل (الشكل 5A). وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة من CYT.ويرد ج مغلفة ضمن aerogels مع المعادن النانوية أيضا (الشكل 5B) وCYT. ج -SiO 2 ايروجيل الطيف هو مماثل لهذا الطيف كذلك. عندما CYT. يتعرض ج -SiO 2 ايروجيل إلى أكسيد النيتريك، لوحظ تحول نموذجي من ذروة سوريه (الشكل 5D).

وتظهر أطياف الأشعة فوق البنفسجية تجاه لالهلام المصنوع من CYT. حلول ج في متفاوتة تركيزات عازلة في الشكل (6). كل هذه المواد الهلامية عرض مميز الطيفية للأشعة فوق البنفسجية مرئية يتميز مشيرا إلى أن CYT. ج ليست في حالة التشويه والتحريف في المواد الهلامية. ومع ذلك، فإن الشفافية انخفض من المواد الهلامية مصنوعة من 70 النتائج عازلة ملم في أقل نسبة الإشارة إلى الضوضاء لهذه الأطياف.

أطياف CD من CYT. ج -SiO 2 aerogels مماثلة لأطياف CYT. ج ج في حل مخزنة (الشكل 7).

ويبين الشكل 8 استجابة مراقبة أكسيد النيتريك نموذجية لCYT. ج -SiO 2 aerogels وaerogels المطابقة التي تحتوي أيضا على الجسيمات النانوية المعدنية بالإضافة إلى CYT. ج. وينظر إلى الفرق بين الامتصاصية في 414 نانومتر، وذلك في 408 نانومتر إلى زيادة ونقصان ثم عندما تتعرض المواد الهلامية إلى أكسيد النيتريك ثم النيتروجين على التوالي في سلسلة متوالية.

وإذا لم يتم الإفراج عن ثاني أكسيد الكربون فوق الحرجة بمعدل يكفي بطيئة، وبقاء CYT. ج داخل aerogels شكلت تتعرض للخطر. ويتجلى هذا من خلال مقارنة الناتج أطياف الأشعة فوق البنفسجية مرئية بعد تشكيل المواد الهلامية عن طريق الإفراج عن ثاني أكسيد الكربون في مختلفمعدلات (الشكل 9).

الشكل 1
الشكل 1: الناقد جهاز نقطة تجفيف الجهاز نقطة تجفيف الحرج هو مبين من (A) الجبهة و (ب) مرة أخرى مع القارب نقل وأجهزة الباب يظهر بجانب الجزء الخلفي من الجهاز.

الشكل 2
الشكل 2: منصة الكرتون والورق المقوى منصة تجميعها لعقد ايروجيل في مسار شعاع للأداة.

الشكل (3)
الشكل (3): النيتريك الاستشعار أكسيد انشاء يظهر النيتريك الاستشعار أكسيد انشاء بما في ذلك (A) غطاء الدخان المغلقة 10٪ أكسيد النيتريك.و 90٪ اسطوانة النيتروجين، وأنابيب، وT-صمام، و (ب) كفيت مع الإبر المدرجة.

الشكل (4)
الرقم 4: CYT عينة ج -SiO 2 aerogels Aerogels التغليف 15 ميكرومتر CYT ج في 4.4 مم، 40 مم، و 70 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم وترد بالمقارنة مع عشرة سنتات من اليسار إلى اليمين. هذه aerogels ما يقرب من ارتفاع 0.2-0.5 سم. أعيد طبعها بإذن 9.

الرقم 5
الرقم 5: CYT ج -SiO 2 ايروجيل الطيفي الأطياف المرئية من 15 ميكرومتر السيتوكروم ج في الفقرة (أ) 50 ملي الفوسفات سول العازلة.ution. (ب) الاتحاد الافريقي (5 نانومتر) ~ CYT ج -SiO 2 ايروجيل؛ (ج) CYT ج -SiO 2 ايروجيل (تعرضها للهواء)؛ (د) CYT. ج -SiO 2 ايروجيل (يتعرض لأكسيد النتريك لمدة 3.5 دقيقة). يتم إجراء مقاصة بين هذه الأطياف يمثل كل نوع من الجل لوضوح، وخط متقطع يدل على موقف الذروة سوريه من CYT. ج في المخزن. في حين أن كل الطيف من 15 ميكرومتر CYT. ج، سمك هلام (أو مرتفعات) هي فقط 0،2-0،5 سم بالمقارنة مع cuvet حل 1 سم، مما أدى إلى حل العالي والامتصاصية. أعيد طبعها بإذن 9.

الشكل (6)
وتتنوع الطيفي هلام هوائي كما تركيز عازلة مغلفة بلغ متوسط ​​الأشعة فوق البنفسجية مرئية الامتصاصية الطيفي للaerogels مقسوما هلام طول مسار المواد الهلامية التغليف 15 _: الرقم 6.6؛ M CYT ج في 70 ملي (أسود) (متوسط ​​4 الأطياف)، 40 ملي (الأحمر ومنقط) (متوسط ​​8 الأطياف)، و 4.4 ملم (الأخضر ومتقطع) (متوسط ​​9 أطياف) عازلة فوسفات البوتاسيوم. . أعيد طبعها بإذن 9.

الرقم 7
الرقم 7:... هلام هوائي ازدواج اللون دائرية الطيفي التعميم أطياف ازدواج اللون من CYT ج في فوسفات الصوديوم مخزنة حل (الصلبة)، واثنين من أطياف تمثيلية من CYT ج -SiO 2 aerogels (متقطع)، واثنين من أطياف تمثيلية من الاتحاد الافريقي (5 نانومتر) ~ CYT. ج SiO- 2 aerogels (منقط). أعيد طبعها بإذن 9.

الرقم 8
الرقم 8: كشف أكسيد النيتريك مع CYT ج -SiO 2. . الفرعية> aerogels رصد التحول (ΔA = A 414 نانومتر - و408 نانومتر). في شدة سوريه من CYT ج (أحمر الصلبة) والاتحاد الافريقي ~ CYT ج (متقطع الأزرق) مغلفة في شافي 2 مركب nanoarchitectures ايروجيل كما تدفق الغاز. ومثبت بين النيتروجين (حيث سوريه ذروة الحد الأقصى هو في ~ 408 نانومتر) وأكسيد النيتريك (حيث سوريه ذروة الحد الأقصى هو في ~ 414 نانومتر). كل منحنى في المتوسط ​​3-4 المحاكمات، مع اثنين من CYT ج -SiO 2 المحاكمات رصدها في ΔA = A 414 نانومتر - ومنذ 407 نانومتر كان الأولي سوريه ذروة كحد أقصى في 407 نانومتر لهذه المحاكمات. أعيد طبعها بإذن 9.

الرقم 9
الرقم 9: تأثير فوق الحرجة الافراج عن الوقت السوائل وبلغ متوسط ​​الأشعة فوق البنفسجية مرئية الامتصاصية الطيفي مقسوما على طول مسار جل للCYT ج -SiO 2 aerogels enca.psulating 10 ميكرومتر CYT. ج في 50 ملي العازلة الفوسفات التي تم إجراء aerogels المجففة supercritically إما عن طريق إطلاق ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج أكثر من 45 دقيقة (صلب أسود اللون (متوسط ​​9 أطياف)) أو 7 دقائق (متقطع والأحمر (متوسط ​​4 أطياف)). أعيد طبعها بإذن 9.

Discussion

كما وصفها، هذا الإجراء قد تنتج باستمرار CYT قابلة للحياة. ج مغلفة ضمن aerogels. تركيز CYT. ج داخل aerogels يمكن أن تختلف 5-15 ميكرومتر وتركيز عازلة للCYT. الحل ج الأولي مغلفة ضمن يمكن أن تختلف 4،4 حتي 70 مم الفوسفات دون آثار ضارة شديدة على بقاء البروتين aerogels. ومع ذلك، فإن مركز ذروة وذروة عرض CYT مميزة. ج سوريه الذروة في aerogels هي الأقرب إلى ما هي عليه لCYT. ج في حل عندما CYT. يتم تغليف ج في aerogels من الحلول من 40 ملي العازلة 9.

يتأثر تجميع للCYT. ج -SiO 2 aerogels في سن بعض الكواشف البدء. والميثانول، وtetramethoxysilane، ومحلول هيدروكسيد الأمونيوم كلها بلوري ويجب أن يتم استبدال كل واحد إلى شهرين. زيادة المياه التي تتراكم فيهذه الكواشف على مر الزمن يؤثر على الخصائص الهيكلية جل والفترة الانتقالية سول إلى هلام.

عند تنفيذ تجفيف فوق الحرجة، يمكن أن قارب نقل جهاز الحرجه تجفيف نقطة لاستيعاب ما يصل إلى ثمانية عشر 0.5 سم سميكة (1)، والمواد الهلامية سم القطر. كما هو موضح في قسم البروتوكول، ينبغي اتباع ملء محددة وإجراء استنزاف لنقل ثاني أكسيد الكربون في سول المواد الهلامية. ومن المهم أن نلاحظ أنه في بداية بروتوكول تجفيف، وخليط استنزاف من ثاني أكسيد الكربون والأسيتون يتدفق في مثل هذا المعدل المرتفع أن أنبوب استنزاف يتجمد قاسية مع رطوبة التكثيف إلى جليد في الخارج. خليط استنزاف خارج يحتوي على بعض المياه منذ الأسيتون ليس اللامائية وهذا الماء قد تجمد في بعض الأحيان إلى حد أن أنبوب استنزاف يسد الواقع. فمن الضروري لمراقبة مثل هذه السدادات والاستماع لتوقف التدفق. يجب إغلاق صمام استنزاف لدقائق قليلة حتى تسد سوف تذوب إذا تم الكشف عن تسد. فيأسوأ سيناريو، إذا لم يتم إغلاق صمام استنزاف، يمكن أن تسد يسبب الكثير من الضغط لبناء هذا الأنبوب استنزاف للملوثات العضوية الثابتة بقوة خارج الجهاز. بعد أول فترات هجرة قليلة، سيكون قد تم تشطف الغالبية العظمى من الأسيتون من الجهاز، ووحدوث قطع الجليد الرطب تقلل بشكل كبير. سوف تصريف تشبه تدريجيا الثلج الجاف مع استمرار بروتوكول استنزاف مع أي دليل المتبقية من وجود الأسيتون (مثل رائحة) تصبح غير قابلة للكشف من قبل نهاية عملية تجفيف.

بعد ثاني أكسيد الكربون في الجهاز قد انتقلت من السائل إلى السائل فوق الحرج وبدأت عملية التنفيس، فمن الضروري لاطلاق سراح السائل بمعدل بطيء أكثر من 45 دقيقة على الأقل كما هو مبين في الإجراء 9. معدل أعلى من الإفراج يمكن أن تقلل من جدوى CYT. ج (كما هو موضح في الشكل 9) داخل aerogels وaerogels نفسها قد كسر في الواقع عن بعضها البعض مثل الالبريد السائل يندفع للهروب من المواد الهلامية. بشكل عام، حتى عندما تبقى aerogels سليمة بعد فتح باب الأجهزة، من المهم التعامل معها بعناية وبلطف لأنها هشة ويمكن كسر بسهولة.

المواد الهلامية السيطرة السيليكا التي تدفقت إلى جانب CYT. ج -SiO تستخدم 2 الهلام بعد التجفيف فوق الحرج لتحديد ما إذا كان نقل ثاني أكسيد الكربون في المواد الهلامية ناجحة. في بعض الأحيان CYT. ج -SiO قد تظهر 2 المواد الهلامية غائم وأنه من المهم لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى نقل المذيبات غير مكتملة أو إذا كان قد تضطر إلى القيام مع تركيز CYT. ج أو المخزن المؤقت مغلفة ضمن المواد الهلامية. إذا كانت المواد الهلامية السيليكا دون CYT. ج تظهر أن يكون متجانسا، والمظهر شفافة في جميع أنحاء، وهذا يمكن أن تؤخذ على أنها دليل على أن نقل المذيبات حدث تماما حتى لو كان CYT. ج -SiO 2 المواد الهلامية لها بعض الغيوم لهم. الغيوم ضمن المواد الهلامية السيليكادون CYT. ج بعد التجفيف يشير إلى أن بعض الأسيتون بقي داخل المواد الهلامية خلال التنفيس.

كما هو مبين في القسم البروتوكول، تحتاج احتياطات السلامة الهامة التي يجب اتخاذها عند التعامل مع أكسيد النيتريك (NO). للكشف NO باستخدام aerogels، فمن الضروري أن يختم كفيت بشكل جيد للغاية ولاستنفاد تدفق الغاز عبر aerogels إلى غطاء الدخان. بدلا من ذلك، معمل كله يمكن نقل إلى غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع NO اسطوانة الغاز من باب الوقاية للحد من التعرض لNO الغاز. في اتصال مع NO الهواء سوف تنتج على الفور سامة للغاية ثاني أكسيد النيتروجين، ورباعي أكسيد النيتروجين أو كليهما. لا يمكن أن تتفاعل مع الماء لإنتاج الحرارة وتآكل الأبخرة. لذلك، والتعرض المستمر للا يمكن أن يؤدي إلى سمية الأنسجة مباشرة.

عند استخدام CYT. ج -SiO 2 aerogels للكشف عن وجود أكسيد النيتريك، والفرقة سوريه تكون البداية في ~ 408 نانومتر، وسيتحولإلى ~ 414 نانومتر في وجود أكسيد النيتريك. بعد التبديل إلى النيتروجين، ينبغي أن الفرقة سوريه عكس يعود إلى كونها تركز على ~ 408 نانومتر. قد يكون من الممكن أيضا استخدام CYT. ج -SiO 2 aerogels للكشف عن وجود بروابط أخرى مثل أول أكسيد الكربون 27.

وتشمل الإجراءات المنشورة مختلف خطوة إضافية تتمثل في الجمع بين الذهب أو الفضة النانوية مع CYT. ج في حل قبل الاختلاط مع سول وتجفيفها لاستخدامها aerogels 4-8 supercritically. مقارنة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية من CYT. ج مغلفة في aerogels مع المعادن النانوية إلى أن من CYT. ج مغلفة في aerogels دون النانوية المعدنية يدل على أن هذين النوعين من تقنيات التغليف تنتج CYT. ج الجدوى مماثلة داخل aerogels (الشكل 5) . ومع ذلك، فإن CYT. ج مغلفة مع المعادن النانوية هي قليلا أكثر استقرارا من CYT. ج تغليفد دون المعادن النانوية داخل aerogels 9. أطياف CD من كلا النوعين من CYT. aerogels ج هي أيضا مشابهة، على الرغم من أن كلا تختلف من الطيف من CYT. ج في المخزن تشير بعض تتكشف CYT. ج داخل aerogels (الشكل 7). وتشير التقارير السابقة عن CYT. ج مغلفة في aerogels أن ازدواج اللون الطيفي التعميم هو الأكثر احتمالا تقييم الطبقة الخارجية من البروتين، وتكشفت على اتصال مع هلام السيليكا، سواء داخل المعادن جسيمات متناهية الصغر الأنوية CYT متعدد الطبقات. الهياكل ج أو هياكل المنظمة فضفاضة التي تشكل عندما لا النانوية المعدنية الموجودة في aerogels 4،9. غالبية CYT. ج ضمن أي نوع من هيكل التنظيم الذاتي داخل aerogels لا تزال مطوية مقاسا التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية بالرغم من ذلك. الاستفادة من بروتوكول صفها النانوية بلا هنا هي أن شراء مكلفة أو التوليف تستغرق وقتا طويلا من المعدنالنانوية ليست ضرورية. لم غالبا ما تغلف البروتينات بنجاح داخل aerogels، وحتى هذا الإجراء مهم لأنه قد يؤدي إلى تطوير طريقة أكثر عمومية لتغليف بروتينات أخرى في aerogels مع الأهمية المحتملة لأجهزة bioanalytical في المستقبل.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقدم الدعم لهذا العمل و / أو نشرها من قبل معهد العلوم من جامعة فيرفيلد للفنون والعلوم، كلية منحة بحثية جامعة فيرفيلد، وهي جائزة العلوم كوتريل كلية من مؤسسة أبحاث العلوم تقدم كلية جامعة فيرفيلد في الآداب والعلوم و جامعة فيرفيلد في قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية. نحن نعترف بامتنان جان ماري والاس عن فكرة مفيدة كثيرا والمشورة في ما يخص هذا المجال البحوث العامة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نعرب خاص جدا شكرا لكم جميعا الماضي والحاضر، والباحثين الجامعيين من مختبر بحوث هاربر يثرمان في المستقبل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 109، السيتوكروم
التغليف السيتوكروم<em&gt; ج</em&gt; في السيليكا هلام هوائي Nanoarchitectures دون المعادن النانوية مع الحفاظ على الغاز مرحلة النشاط الحيوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E.… More

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter