يصف هذا الإجراء كيفية تغليف السيتوكروم ج (CYT. ج) في السيليكا (شافي 2) سول المواد الهلامية، وعملية هذه المواد الهلامية لتشكيل bioaerogels، واستخدام هذه bioaerogels الاعتراف بسرعة أكسيد النيتريك (NO) من خلال تفاعل طور الغاز. هذا النوع من البروتوكول قد يساعد في التنمية المستقبلية من أجهزة الاستشعار أو أجهزة bioanalytical أخرى.
وقد تحسنت التطبيقات مثل أجهزة الاستشعار، والبطاريات، وخلايا الوقود من خلال استخدام aerogels المسامية العالية عندما يتم تغليف مركبات وظيفية ضمن aerogels. ومع ذلك، توجد بعض التقارير عن التغليف البروتينات داخل الهلام سول التي يتم تجهيزها لتشكيل aerogels. (NO) ويرد الإجراء لتغليف السيتوكروم ج (CYT. ج) في السيليكا (شافي 2) سول المواد الهلامية التي تتم معالجتها supercritically لتشكيل bioaerogels مع النشاط الغاز مرحلة لأكسيد النتريك. يضاف CYT. ج إلى سول السيليكا مختلطة تحت تركيز البروتين للرقابة والعازلة الشروط قوة. ثم تبلور الخليط سول ويتم استبدال السائل ملء المسام الجل من خلال سلسلة من المبادلات المذيبات مع ثاني أكسيد الكربون السائل. يتم جلب غاز ثاني أكسيد الكربون إلى نقطة حرجة وتنفيس قبالة لتشكيل aerogels الجافة مع CYT. ج مغلفة داخل. وتتميز هذه bioaerogels مع التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئيةد دائري الطيفي ازدواج اللون، ويمكن استخدامها للكشف عن وجود أكسيد النيتريك الغاز المرحلة. نجاح هذا الإجراء يعتمد على تنظيم CYT. تركيز ج وتركيز العازلة ولا يتطلب مكونات أخرى مثل المعادن النانوية. قد يكون من الممكن لتغليف البروتينات الأخرى التي تستخدم نهجا مماثلا مما يجعل هذا الإجراء مهم لتطوير جهاز bioanalytical المحتملة في المستقبل.
السيتوكروم ج (CYT. ج) هو مفتاح البروتين الإلكترون نقل تشارك في التفاعلات التنفس الخلوية في الجسم. ولقد ثبت أن تشارك في موت الخلايا المبرمج، وهو شكل رقابة من موت الخلايا، ويمكن الكشف عن مثل هذه الجزيئات السامة صغيرة أكسيد النتريك وأول أكسيد الكربون 1-3. أكسيد النيتريك (NO) يلعب دورا في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية التي تحدث في الجهاز العصبي، القلب والأوعية الدموية، والجهاز المناعي. في حين CYT. ج عادة ما يتطلب بيئة مائية مخزنة على قيم الرقم الهيدروجيني محايدة لتبقى سليمة هيكليا ونشطة، وقد أظهرت الأبحاث أن CYT. ج يمكن الاحتفاظ هيكلها وظيفة في المواد الصلبة المعروفة باسم aerogels في ظل ظروف معينة 4-9.
Aerogels هي مواد مسامية عالية وغالبا ما شكلت عن طريق تجميع أكاسيد المعادن سول هلام (بينما aerogels أكسيد المعادن شائعة جدا، وقد تم تصنيعه الكربون وغيرها من أنواع aerogels. ومن الأمثلة على البرنامج النووي العراقي آير ogels) 10 وتجفيف هذه الهلام سول في مثل هذه الطريقة التي يتم بثها المصفوفة الصلبة التي يسهل اختراقها دون تغيير 11-14. كل مسام في aerogels الصلبة يؤدي في المساحة المتاحة مما aerogels الكثير مفيدة للغاية لأي طلبات حيث ردود الفعل السطحية مهمة. عندما يتم تجميعها الكيميائية أو وظيفة البيوكيميائية داخل nanoarchitecture ايروجيل، فقد تبين أن المسامية البدنية وتعزيز المساحة السطحية للaerogels تساعد على تحسين أجهزة الاستشعار، وكذلك الأقطاب الكهربائية للبطارية، وخلايا الوقود، وsupercapacitor تطبيقات 11،15-23 . من أجل تجفيف aerogels بطريقة يترك المصفوفة الصلبة التي يسهل اختراقها دون تغيير، فمن نموذجي لإزالة المذيب الذي يبقى في المسام بعد التوليف سول-جل عن طريق الاستخلاص بالمذيبات فوق الحرجة. يتم الحد من أي انهيار المسام التي قد تكون ناجمة عن قوى التوتر السطحي كما يتبخر المذيب من هلام لأنه في تجفيف فوق الحرجة، واجهة السائل بخار أبدا الأشكال.
<p class="jove_content"> هناك العديد من التقارير من البروتينات الهيم مثل CYT. ج يجري مغلفة في الهلام سول التي تم الاحتفاظ بها رطبة أو التي تم تجفيفها ambiently 24-30. تقارير لتغليف الجزيئات الحيوية في الهلام سول أن ثم يتم تجفيفها supercritically لتشكيل aerogels هي نادرة بسبب معالجة الضرورية التي يمكن أن تكون ضارة للهيكل العديد من البروتينات. في حالة CYT. ج، ظروف معينة تجعل من الممكن الإبقاء على قدرة CYT. ج لكشف والرد على أكسيد النيتريك الطور الغازي ضمن aerogels. مرة واحدة استقرت في ايروجيل، بنية المسام ذات جودة عالية من ايروجيل يسهل التفاعل بين CYT. ج و4،8،9 أكسيد النيتريك. CYT. ج يمكن أن تكون مغلفة داخل aerogels من خلال ربط لأول مرة في طبقات متعددة في جميع أنحاء الذهب أو الفضة النانوية في حل 4-8. هذه الفوقية متعددة الطبقات تعمل على حماية بروتين داخل المصفوفة ايروجيل. في approac الأخيرح التي قمنا بتطويرها، عندما سيطر على تركيز البروتين والعازلة قوة جنبا إلى جنب مع الظروف الاصطناعية الأخرى، CYT. تحتفظ ج النزاهة داخل aerogels حتى من دون جسيمات متناهية الصغر المعادن جمعية الأولية 9.يبدأ التركيب وتبدأ العديد من توليفات ايروجيل عن طريق خلط السلائف السيليكا سول-جل لفترة معينة من الزمن. فمن بعد مجموعة خلط الوقت الذي CYT. يضاف ج كحل مخزنة في الخليط. ثم يحدث دبق لتشكيل هيكل متين السيليكا التي يسهل اختراقها والتي تمتلئ المسام بالماء، والميثانول، وتبقى المواد المتفاعلة والمنتجات الثانوية. هذا السائل الذي يملأ المسام يمكن أن تشطف الخروج مع المذيبات المختلفة من خلال سلسلة من المبادلات المذيبات، وكان آخر التبادلات مع ثاني أكسيد الكربون السائل تجري ضمن جهاز نقطة تجفيف حاسما حافظ على درجة حرارة منخفضة. جلب المواد الهلامية أعلى من درجة الحرارة الحرجة (31.1 درجة مئوية) من ثاني أكسيد الكربون يسهل تشكيل مثلالسائل upercritical داخل جهاز الضغط التي يمكن تنفيس لتشكيل الجافة، aerogels المسامية العالية. درجة حرارة منخفضة نسبيا اللازمة لثاني أكسيد الكربون لتكوين السوائل فوق الحرجة هو مفيد مقارنة مع غيرها من المذيبات لأنها تحافظ على بروتين أقل من درجة الحرارة التي يمكن أن تفسد.
لدينا المعادن نهج خالية من جسيمات متناهية الصغر لتغليف CYT. ج في aerogels هو مفيد لأنه هو إجراء بسيط يمكن أن تؤدي إلى وضع بروتوكول أكثر قابلية للتطبيق بشكل عام لتغليف البروتينات الأخرى كذلك. قد لا تتفاعل العديد من البروتينات مع المعادن النانوية في بنفس الطريقة التي CYT. ج يفعل والتوليف جسيمات متناهية الصغر المعدن أو شراء يضيف الوقت ونفقات إضافية لهذا الإجراء. تقارير قليلة على التغليف البروتينات في aerogels تجعل تطوير هذا الإجراء خطوة هامة إلى الأمام في إيجاد إجراءات أكثر عمومية لتغليف بروتينات أخرى في aerogels التي قد تساعد طn اللاسلكية bioanalytical المحتملة في المستقبل.
قسم البروتوكول من هذه المخطوطة يوضح كيفية تجميع السيليكا سول المواد الهلامية، وتغلف CYT. ج في هذه الهلام سول، تجف هذه المركبة سول المواد الهلامية لتشكيل aerogels وتوصيف هذه bioaerogels باستخدام الأشعة فوق البنفسجية مرئية والتعميم الطيفي ازدواج اللون وكشف عن وجود من الطور الغازي أكسيد النيتريك مع هذه bioaerogels. CYT. وقد تم تغليف ج بنجاح في aerogels عندما يذوب أولا في 4،4 حتي 70 مم المحاليل المائية من العازلة الفوسفات. ومع ذلك، فقد تم العثور على هيكل بروتين الأمثل في aerogels أن ينتج عندما التغليف 40 ملي فوسفات حلول مخزنة من CYT. ج المنتجة للتحميل CYT ايروجيل. تركيزات ج في حدود 5 إلى 15 ميكرومتر 9. ولذلك، فإن بروتوكول الواردة أدناه هي لتجميع aerogels باستخدام حلول 40 ملي الفوسفات من CYT. ج مما أدى إلى CYT تحميل. تركيز ج في aerogels من 15 ميكرومتر <./ P>
كما وصفها، هذا الإجراء قد تنتج باستمرار CYT قابلة للحياة. ج مغلفة ضمن aerogels. تركيز CYT. ج داخل aerogels يمكن أن تختلف 5-15 ميكرومتر وتركيز عازلة للCYT. الحل ج الأولي مغلفة ضمن يمكن أن تختلف 4،4 حتي 70 مم الفوسفات دون آثار ضارة شديدة على بقاء البروتين aerogels. ومع ذلك، فإن مركز ذروة وذروة عرض CYT مميزة. ج سوريه الذروة في aerogels هي الأقرب إلى ما هي عليه لCYT. ج في حل عندما CYT. يتم تغليف ج في aerogels من الحلول من 40 ملي العازلة 9.
يتأثر تجميع للCYT. ج -SiO 2 aerogels في سن بعض الكواشف البدء. والميثانول، وtetramethoxysilane، ومحلول هيدروكسيد الأمونيوم كلها بلوري ويجب أن يتم استبدال كل واحد إلى شهرين. زيادة المياه التي تتراكم فيهذه الكواشف على مر الزمن يؤثر على الخصائص الهيكلية جل والفترة الانتقالية سول إلى هلام.
عند تنفيذ تجفيف فوق الحرجة، يمكن أن قارب نقل جهاز الحرجه تجفيف نقطة لاستيعاب ما يصل إلى ثمانية عشر 0.5 سم سميكة (1)، والمواد الهلامية سم القطر. كما هو موضح في قسم البروتوكول، ينبغي اتباع ملء محددة وإجراء استنزاف لنقل ثاني أكسيد الكربون في سول المواد الهلامية. ومن المهم أن نلاحظ أنه في بداية بروتوكول تجفيف، وخليط استنزاف من ثاني أكسيد الكربون والأسيتون يتدفق في مثل هذا المعدل المرتفع أن أنبوب استنزاف يتجمد قاسية مع رطوبة التكثيف إلى جليد في الخارج. خليط استنزاف خارج يحتوي على بعض المياه منذ الأسيتون ليس اللامائية وهذا الماء قد تجمد في بعض الأحيان إلى حد أن أنبوب استنزاف يسد الواقع. فمن الضروري لمراقبة مثل هذه السدادات والاستماع لتوقف التدفق. يجب إغلاق صمام استنزاف لدقائق قليلة حتى تسد سوف تذوب إذا تم الكشف عن تسد. فيأسوأ سيناريو، إذا لم يتم إغلاق صمام استنزاف، يمكن أن تسد يسبب الكثير من الضغط لبناء هذا الأنبوب استنزاف للملوثات العضوية الثابتة بقوة خارج الجهاز. بعد أول فترات هجرة قليلة، سيكون قد تم تشطف الغالبية العظمى من الأسيتون من الجهاز، ووحدوث قطع الجليد الرطب تقلل بشكل كبير. سوف تصريف تشبه تدريجيا الثلج الجاف مع استمرار بروتوكول استنزاف مع أي دليل المتبقية من وجود الأسيتون (مثل رائحة) تصبح غير قابلة للكشف من قبل نهاية عملية تجفيف.
بعد ثاني أكسيد الكربون في الجهاز قد انتقلت من السائل إلى السائل فوق الحرج وبدأت عملية التنفيس، فمن الضروري لاطلاق سراح السائل بمعدل بطيء أكثر من 45 دقيقة على الأقل كما هو مبين في الإجراء 9. معدل أعلى من الإفراج يمكن أن تقلل من جدوى CYT. ج (كما هو موضح في الشكل 9) داخل aerogels وaerogels نفسها قد كسر في الواقع عن بعضها البعض مثل الالبريد السائل يندفع للهروب من المواد الهلامية. بشكل عام، حتى عندما تبقى aerogels سليمة بعد فتح باب الأجهزة، من المهم التعامل معها بعناية وبلطف لأنها هشة ويمكن كسر بسهولة.
المواد الهلامية السيطرة السيليكا التي تدفقت إلى جانب CYT. ج -SiO تستخدم 2 الهلام بعد التجفيف فوق الحرج لتحديد ما إذا كان نقل ثاني أكسيد الكربون في المواد الهلامية ناجحة. في بعض الأحيان CYT. ج -SiO قد تظهر 2 المواد الهلامية غائم وأنه من المهم لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى نقل المذيبات غير مكتملة أو إذا كان قد تضطر إلى القيام مع تركيز CYT. ج أو المخزن المؤقت مغلفة ضمن المواد الهلامية. إذا كانت المواد الهلامية السيليكا دون CYT. ج تظهر أن يكون متجانسا، والمظهر شفافة في جميع أنحاء، وهذا يمكن أن تؤخذ على أنها دليل على أن نقل المذيبات حدث تماما حتى لو كان CYT. ج -SiO 2 المواد الهلامية لها بعض الغيوم لهم. الغيوم ضمن المواد الهلامية السيليكادون CYT. ج بعد التجفيف يشير إلى أن بعض الأسيتون بقي داخل المواد الهلامية خلال التنفيس.
كما هو مبين في القسم البروتوكول، تحتاج احتياطات السلامة الهامة التي يجب اتخاذها عند التعامل مع أكسيد النيتريك (NO). للكشف NO باستخدام aerogels، فمن الضروري أن يختم كفيت بشكل جيد للغاية ولاستنفاد تدفق الغاز عبر aerogels إلى غطاء الدخان. بدلا من ذلك، معمل كله يمكن نقل إلى غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع NO اسطوانة الغاز من باب الوقاية للحد من التعرض لNO الغاز. في اتصال مع NO الهواء سوف تنتج على الفور سامة للغاية ثاني أكسيد النيتروجين، ورباعي أكسيد النيتروجين أو كليهما. لا يمكن أن تتفاعل مع الماء لإنتاج الحرارة وتآكل الأبخرة. لذلك، والتعرض المستمر للا يمكن أن يؤدي إلى سمية الأنسجة مباشرة.
عند استخدام CYT. ج -SiO 2 aerogels للكشف عن وجود أكسيد النيتريك، والفرقة سوريه تكون البداية في ~ 408 نانومتر، وسيتحولإلى ~ 414 نانومتر في وجود أكسيد النيتريك. بعد التبديل إلى النيتروجين، ينبغي أن الفرقة سوريه عكس يعود إلى كونها تركز على ~ 408 نانومتر. قد يكون من الممكن أيضا استخدام CYT. ج -SiO 2 aerogels للكشف عن وجود بروابط أخرى مثل أول أكسيد الكربون 27.
وتشمل الإجراءات المنشورة مختلف خطوة إضافية تتمثل في الجمع بين الذهب أو الفضة النانوية مع CYT. ج في حل قبل الاختلاط مع سول وتجفيفها لاستخدامها aerogels 4-8 supercritically. مقارنة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية من CYT. ج مغلفة في aerogels مع المعادن النانوية إلى أن من CYT. ج مغلفة في aerogels دون النانوية المعدنية يدل على أن هذين النوعين من تقنيات التغليف تنتج CYT. ج الجدوى مماثلة داخل aerogels (الشكل 5) . ومع ذلك، فإن CYT. ج مغلفة مع المعادن النانوية هي قليلا أكثر استقرارا من CYT. ج تغليفد دون المعادن النانوية داخل aerogels 9. أطياف CD من كلا النوعين من CYT. aerogels ج هي أيضا مشابهة، على الرغم من أن كلا تختلف من الطيف من CYT. ج في المخزن تشير بعض تتكشف CYT. ج داخل aerogels (الشكل 7). وتشير التقارير السابقة عن CYT. ج مغلفة في aerogels أن ازدواج اللون الطيفي التعميم هو الأكثر احتمالا تقييم الطبقة الخارجية من البروتين، وتكشفت على اتصال مع هلام السيليكا، سواء داخل المعادن جسيمات متناهية الصغر الأنوية CYT متعدد الطبقات. الهياكل ج أو هياكل المنظمة فضفاضة التي تشكل عندما لا النانوية المعدنية الموجودة في aerogels 4،9. غالبية CYT. ج ضمن أي نوع من هيكل التنظيم الذاتي داخل aerogels لا تزال مطوية مقاسا التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية مرئية بالرغم من ذلك. الاستفادة من بروتوكول صفها النانوية بلا هنا هي أن شراء مكلفة أو التوليف تستغرق وقتا طويلا من المعدنالنانوية ليست ضرورية. لم غالبا ما تغلف البروتينات بنجاح داخل aerogels، وحتى هذا الإجراء مهم لأنه قد يؤدي إلى تطوير طريقة أكثر عمومية لتغليف بروتينات أخرى في aerogels مع الأهمية المحتملة لأجهزة bioanalytical في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
وقدم الدعم لهذا العمل و / أو نشرها من قبل معهد العلوم من جامعة فيرفيلد للفنون والعلوم، كلية منحة بحثية جامعة فيرفيلد، وهي جائزة العلوم كوتريل كلية من مؤسسة أبحاث العلوم تقدم كلية جامعة فيرفيلد في الآداب والعلوم و جامعة فيرفيلد في قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية. نحن نعترف بامتنان جان ماري والاس عن فكرة مفيدة كثيرا والمشورة في ما يخص هذا المجال البحوث العامة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نعرب خاص جدا شكرا لكم جميعا الماضي والحاضر، والباحثين الجامعيين من مختبر بحوث هاربر يثرمان في المستقبل.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |