Denne prosedyren beskriver hvordan du kapsle cytokrom c (cyt. C) i silika (SiO 2) sol-geler, prosess disse gels å danne bioaerogels, og bruke disse bioaerogels å raskt gjenkjenne nitrogenoksid (NO) gjennom en gassfase reaksjon. Denne type protokoll kan hjelpemiddel i den fremtidige utviklingen av biosensorer eller andre Bioanalytical enheter.
Applikasjoner som sensorer, batterier og brenselceller har blitt forbedret ved bruk av meget porøse aerogel når funksjonelle forbindelser er innkapslet i aerogeler. Men noen rapporter om innkapsle proteiner i sol-gels som er behandlet for å danne aerogels eksistere. En fremgangsmåte for innkapsling av cytokrom c (cyt. C) på silika (SiO 2), Sol-geler som er superkritisk bearbeidet for å danne bioaerogels med gassfase-aktivitet for nitrogenoksid (NO) er presentert. Cyt c. Ble tilsatt til en blandet silikasol under kontrollerte proteinkonsentrasjon og bufferstyrkeforhold. Solen Blandingen blir deretter gelert og væsken fyller gelen porene er erstattet gjennom en serie av løsningsmiddelutveksling med flytende karbondioksid. Karbondioksidet blir brakt til sitt kritiske punkt og luftet ut for å danne tørre aerogel med cyt. C innkapslet inne. Disse bioaerogels er preget med UV-synlig spektroskopi end sirkulærdikroisme spektroskopi, og kan brukes for å påvise nærværet av gass-fase nitrogenoksid. Suksessen med denne fremgangsmåten er avhengig av regulering av cyt. C konsentrasjonen og bufferkonsentrasjon, og krever ikke andre komponenter slik som metall nanopartikler. Det kan være mulig å innkapsle andre proteiner ved bruk av en lignende fremgangsmåte som gjør denne prosedyren viktig for potensiell fremtidig utvikling bioanalytical enhet.
Cytokrom c (cyt. C) er en viktig elektron-transfer protein som er involvert i kroppens celleåndingen reaksjoner. Det har vist seg å være involvert i apoptose, en kontrollert form for celledød, og den kan detektere så små toksiske molekyler som nitrogenoksid og karbonmonoksid 1-3. Nitrogenoksyd (NO) spiller en rolle i en rekke fysiologiske prosesser som finner sted i den nervøse, kardiovaskulære, og immunsystemet. Mens cyt. C vanligvis krever et vandig miljø bufret til pH-nøytralt verdier for å forbli strukturelt intakt og aktiv, har forskning vist at cyt. C kan beholde sin struktur og funksjon i solide materialer kjent som aerogels under visse betingelser 4-9.
Aerogeler er meget porøse materialer, som ofte dannes ved å syntetisere sol-gel metalloxyder (mens metalloksid aerogeler er meget vanlig, har karbon og andre typer av aerogeler blitt syntetisert. Et eksempel er InP aerogels) 10 og tørking av disse sol-gelene på en slik måte at den porøse faste matriks forblir uendret 11-14. Alle porene i faststoff aerogeler resultere i mye tilgjengelige overflateareal som gjør aerogeler svært nyttige for alle anvendelser hvor overflatereaksjoner er viktige. Når kjemisk eller biokjemisk funksjonaliteten er montert inne i aerogelen nanoarchitecture, har det vist seg at den fysiske porøsitet og forbedret overflatearealet til aerogeler bidra til å forbedre sensorer, samt elektroder for batterier, brenselceller og supercapacitor applikasjoner 11,15-23 . For å kunne tørke aerogeler på en måte som etterlater den porøse faste matriks uforandret, er det vanlig å fjerne løsningsmidlet som er igjen i porene etter at sol-gel syntese gjennom superkritisk oppløsningsmiddel-ekstraksjon. Enhver pore kollaps som kan forårsakes ved overflatespenningskreftene som et oppløsningsmiddel fordamper fra gelen blir minimalisert fordi i overkritisk tørking, en væske-damp-grensesnitt aldri former.
<p class="jove_content"> Det er mange rapporter om heme proteiner som cyt. c blir innkapslet i sol-gels som har blitt holdt våt eller som har blitt tørket ambiently 24-30. Rapporter om innkapslende biomolekyler i sol-geler som deretter tørkes for å danne superkritisk aerogeler er sjeldnere på grunn av den nødvendige behandling som kan være skadelig for strukturen av mange proteiner. I tilfelle av cyt. C, visse betingelser gjør det mulig å beholde evnen til cyt c. Å detektere og reagere på gassfase-nitrogenoksid innenfor aerogeler. Når stabilisert i aerogel, høy kvalitet porestruktur aerogel letter reaksjonen mellom cyt. C og nitrogenoksid 4,8,9. Cyt. C kan innkapsles i aerogels ved først å knytte det i flere lag rundt gull eller sølv nanopartikler i løsning 4-8. Disse flerlags oppbygninger tjener til å beskytte proteinet i aerogel matrisen. I den siste approach som vi har utviklet seg, når proteinkonsentrasjonen og bufferstyrke styres sammen med andre syntetiske betingelser, cyt. c beholder integritet i løpet av de aerogeler selv uten metall nanopartikkel innledende krets 9.Syntesen begynner som mange aerogel synteser begynne ved å blande silika sol-gel forløpere for en bestemt periode. Det er etter en viss tid å blande det cyt. C blir tilsatt som en bufret oppløsning inn i blandingen. Gelering skjer deretter for å danne en porøs silisiumdioksyd fast struktur hvor porene er fylt med vann, metanol, gjenværende reaktanter og biprodukter. Denne væsken som fyller porene kan skylles ut sammen med forskjellige oppløsningsmidler gjennom en serie av løsemiddel utveksling, de siste utveksling med flytende karbondioksyd finner sted innenfor et kritisk punkt tørkeapparat holdes ved lav temperatur. Å bringe gelene over den kritiske temperatur (31,1 ° C) av karbondioksyd letter dannelsen av såupercritical fluid inne i trykkapparat som kan luftes for å danne tørre, høyporøse aerogeler. Den relativt lave temperatur som kreves for karbondioksid for å danne et superkritisk fluid er fordelaktig sammenlignet med andre løsningsmidler for den holder proteinet under en temperatur ved hvilken den kunne denaturere.
Våre metall nanopartikkel-fri tilnærming for å innkapsle cyt. Ci aerogeler er fordelaktig fordi det er en enkel fremgangsmåte som kan føre til utvikling av en mer generelt anvendelig protokoll for innkapsling av andre proteiner i tillegg. Mange proteiner kan ikke reagerer med metallnanopartikler på samme måte som cyt. C gjør, og metall nanopartikkel syntese eller kjøp gir ekstra tid og kostnader til fremgangsmåten. De få rapporter om innkapsle proteiner i aerogels gjøre utviklingen av denne prosedyren et betydelig skritt fremover for å finne en mer generell prosedyre for innkapsling av andre proteiner i aerogels som kan hjelpe in potensielle fremtidige Bioanalytical enheter.
Protokollen delen av dette manuskriptet skisserer hvordan å syntetisere -silisiumdioksydsol-gels, kapsle cyt. C inn i disse sol-gels, tørke disse sammensatte sol-gels å danne aerogels, karakteriserer disse bioaerogels bruker UV-synlig og sirkulærdikroismeanalyse spektroskopi og påvise tilstedeværelse av gassfase-nitrogenoksid med disse bioaerogels. Cyt. C har blitt innkapslet i aerogel når først oppløst i 4,4 til 70 mM, vandige oppløsninger av fosfatbuffer. Imidlertid har optimalisert proteinstrukturen i aerogeler blitt funnet å resultere når innkapsling av 40 mM fosfatbufferoppløsninger av cyt c. Fremstilling av belastede aerogel cyt. C konsentrasjoner i området fra 5 til 15 uM 9. Derfor protokollen gitt nedenfor, er å syntetisere aerogeler ved anvendelse av 40 mM fosfatbufferoppløsninger av cyt c. Som resulterer i en lastet cyt c. Konsentrasjonen i de aerogeler av 15 uM. </ P>
Som beskrevet, er denne fremgangsmåten konsekvent produsert levedyktig cyt. C innkapslet i aerogeler. Konsentrasjonen av cyt. C i løpet av de aerogeler kan varieres fra 5 til 15 uM og bufferkonsentrasjonen av den første cyt. C løsningen innkapslet innenfor aerogeler kan varieres 4,4 til 70 mM fosfat uten alvorlige skadelige virkninger på protein levedyktighet. Imidlertid topp senter og toppbredden av den karakteristiske cyt c. Soret topp i aerogeler kommer nærmest hva de er for cyt c. I oppløsning når cyt. C er innkapslet i aerogeler fra oppløsninger av 40 mM buffer 9.
Syntesen av cyt. C -SiO 2 aerogels påvirkes av alder på noen av de som starter reagenser. Metanol, tetrametoksysilan, og ammoniumhydroksidløsning er alle hygroskopisk og bør skiftes ut hver en-til-to måneder. Den økte vann som bygger seg opp idisse reagensene over tid påvirker gel strukturelle egenskaper og den sol-til-gel overgangstiden.
Når du utfører superkritisk tørking, kan det kritiske punktet tørkeapparat overførings båt holde opp til atten 0,5 cm tykke, 1 cm diameter gels. Som beskrevet i protokollen delen, bør en bestemt fylling og tømming prosedyre følges for å overføre karbondioksid i sol-geler. Det er viktig å merke seg at ved begynnelsen av den drenering protokollen, drenering blanding av karbondioksyd og aceton strømmer ved en slik høy hastighet at tapperøret fryser stiv med fuktighet kondenserer til is på utsiden. Blandingen drenering ut inneholder litt vann siden aceton er ikke vannfri og dette vannet kan tidvis fryse i et omfang som dreneringsrøret faktisk tresko. Det er nødvendig å se etter slike tresko og for å lytte etter en stans av flyt. Avløpsventilen skal være stengt for et par min så tette vil smelte hvis en tresko er oppdaget. Iworst case, hvis avløpsventilen ikke er stengt, kan en tresko føre til så mye press for å bygge opp at avløpsrøret hardt spretter av apparatet. Etter de første dreneringsperioder, vil mesteparten av acetonet er blitt skyllet ut av apparatet, og forekomst av våt is biter vil avta dramatisk. Utladningen vil gradvis ligne tørris som tømme- protokollen fortsetter med eventuelle gjenværende tegn på nærvær aceton (eksempel duft) bli detekterbar ved slutten av dreneringen prosessen.
Etter at karbondioksyd i anordningen har gått fra væske til superkritisk fluid og lufteprosessen har begynt, er det nødvendig å frigjøre fluidet ved en langsom hastighet i løpet av minst 45 min som angitt i prosedyren 9. En høyere frigjøringshastighet kan redusere levedyktighet av cyt. C (som vist i figur 9) innenfor aerogeler og aerogeler selv kan faktisk bryte fra hverandre som the væske skynder seg å flykte fra gels. Generelt, selv når aerogeler forblir intakt etter åpning av anordningen døren, er det viktig å behandle dem forsiktig og forsiktig som de er sprø og kan lett brekke.
Kontroll silikageler som er strømmet langs cyt. C -SiO 2-geler anvendes etter overkritiske tørkingen for å bestemme om karbondioksyd overføringen inn i de geler var vellykket. Noen ganger cyt. C -SiO 2 gels kan vises overskyet og det er viktig å finne ut om dette er på grunn av ufullstendig løsemiddel overføring eller om det kan ha å gjøre med konsentrasjonen av cyt. C eller buffer innkapslet innenfor gels. Dersom silikageler uten cyt. C synes å ha en homogen, gjennomskinnelig utseende hele, kan dette tas som bevis på at oppløsningsmidlet overføring inntraff fullstendig selv om cyt c. -SiO 2-geler ha en viss uklarhet til dem. Uklarhet innenfor silikageleruten cyt. c etter tørking indikerer at noen aceton forble innenfor gels under lufting.
Som angitt i protokollen delen, viktige sikkerhetsregler må tas når du arbeider med nitrogenoksid (NO). For å detektere NO hjelp av aerogeler, er det nødvendig å forsegle kyvetten meget godt og for å slippe ut gassen som strømmer gjennom aerogeler inn i en avtrekkshette. Alternativt kan hele spektrofotometer bli flyttet inn i et avtrekksskap sammen med NO gassflasken som en ekstra forholdsregel å begrense eksponering for NO gass. Ved kontakt med luft NO vil umiddelbart frembringe den meget giftige nitrogendioksyd, dinitrogentetraoksid eller begge deler. INGEN kan også reagere med vann for å produsere varme og etsende gasser. Derfor kan vedvarende eksponering til NO resultere i direkte vevstoksisitet.
Ved bruk av cyt. C -SiO 2 aerogeler for å påvise tilstedeværelse av nitrogenoksid, vil Soret båndet i utgangspunktet være på ~ 408 nm og vil skiftetil ~ 414 nm i nærvær av nitrogenoksyd. Etter at du bytter tilbake til nitrogen, bør Soret bandet reversere tilbake til å være sentrert på ~ 408 nm. Det kan også være mulig å benytte den cyt. C -SiO 2 aerogeler for å detektere nærværet av andre ligander slik som karbonmonoksid 27.
Forskjellige publiserte prosedyrer inkluderer en ekstra trinn å kombinere gull eller sølvnanopartikler med cyt. C i løsning før blanding med solen og superkritisk tørking for dannelse av aerogeler 4-8. Sammenligning av UV-synlig spektroskopi av cyt. C innkapslet i aerogeler med metall nanopartikler til det i cyt. C innkapslet i aerogeler uten metallnanopartikler viser at disse to typer av innkapslingsteknikker produsere cyt. C av samme levedyktighet i løpet av de aerogeler (figur 5) . Imidlertid cyt. C innkapslet med metallnanopartikler er noe mer stabil enn cyt. C innkapsled uten metall nanopartikler innenfor aerogels 9. CD-spektrene for begge typer av cyt. C aerogeler er også lik, selv om begge er forskjellig fra spekteret for cyt c. I buffer som indikerer noen utfolding av cyt. C innenfor aerogeler (figur 7). Tidligere rapporter om cyt. C innkapslet i aerogeler tyder på at sirkulærdikroisme spektroskopi er sannsynligvis å vurdere det ytterste laget av protein, utfoldet ved kontakt med silikagel, i enten metall nanopartikkel-kjernedannelse flerlags cyt. C konstruksjoner eller løst organiserte strukturer som danner når ingen metallnanopartikler er tilstede i aerogels 4,9. Størstedelen av cyt c. Innenfor en av typene av selvorganisert struktur inne i aerogeler forblir foldet som målt ved hjelp av UV-synlig spektroskopi skjønt. Fordelen med den protokoll som er beskrevet heri sans nanopartikler er så dyre kjøp eller tidkrevende syntese av metallnanopartikler er ikke nødvendig. Proteiner er ikke ofte blitt innkapslet i aerogeler, og slik at denne fremgangsmåten er viktig ved at den kan føre til utvikling av en mer generell metode for innkapsling av andre proteiner i aerogeler med potensiell betydning for fremtidige Bioanalytical enheter.
The authors have nothing to disclose.
Støtte for dette arbeidet og / eller offentliggjøring ble gitt av Science Institute of Fairfield University College of Arts and Sciences, Fairfield universitetets fakultet Forskning Grant, en Cottrell College Science Award fra Research Corporation for Science Advancement, Fairfield University College of Arts & Sciences og Fairfield University Chemistry & biokjemi avdeling. Vi erkjenner takknemlig Jean Marie Wallace for mye nyttig innsikt og råd i forhold til denne generelle forskningsområdet. I tillegg utvider vi en helt spesiell takk til alle tidligere, nåværende og fremtidige undervisning forskere av Harper-Leatherman Research Lab.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |