Summary
Este trabalho descreve um protocolo in vitro de diferenciação para produzir pigmentadas, melanócitos maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma crista neural e melanoblasto estágio intermediário usando um protocolo sem alimentador de 25 dias.
Introduction
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) fornecer uma plataforma para imitar diferenciação normal em uma forma escalável para modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias de substituição celular 1-6. De particular interesse, hPSCs abrir caminhos para o estudo difícil isolar ou tipos de células raras / transitórios, onde amostras de pacientes são escassos. Células-tronco pluripotentes Além disso, induzidas (iPSCs) permitir aos investigadores estudar o desenvolvimento e modelagem de doença de uma maneira específica paciente para desvendar os mecanismos exclusivos 1,2,7-11. O protocolo previamente publicado para a diferenciação dos melanócitos a partir hPSCs requer até 6 semanas de diferenciações e envolve a cultura de células com meio condicionado de células L-12 Wnt3a. O protocolo apresentado pela primeira vez por Mica et al. E descrito aqui produz células pigmentadas em três semanas e remove a ambiguidade e inconsistências associados com meio condicionado.
ar melanócitose derivados da crista neural, uma população de células migratórias únicas para os vertebrados. A crista neural é definido durante a gastrulação e representa uma população de células na borda da placa neural, na fronteira entre a ectoderme neural e não neurais. Durante neurulação, o tecido nervoso se desenvolve a partir de uma placa neural para formar dobras neurais, que convergem na linha média dorsal, resultando no tubo neural 13,14.
As células da crista neural emergir da placa de tecto do tubo neural, em frente da notocorda, e submetido a uma epitelial para mesenquimal antes de migrar para longe para dar origem a uma população diversa de células diferenciadas. O destino das células da crista são definidas em parte por a localização anatómica da placa para telhado, ao longo do eixo do corpo do embrião. derivados de células da crista neural incluem linhagens característicos de ambos mesoderme (células do músculo liso, os osteoblastos, os adipócitos, condrócitos e células da ectoderme) (melanócitos, C Schwannells, neurônios) 14. células estaminais da crista neural regulam positivamente o factor de transcrição SOX10 e pode ser isolado por meio de células activada por fluorescência, com anticorpos para p75 e HNK1.
As células da crista neural fadado a tornar-se melanócitos passar por uma fase melanoblasto e upregulate KIT e MITF (fator de transcrição associada à microftalmia) 6,21 MITF é um regulador mestre do desenvolvimento de melanócitos e é um fator de transcrição responsável por controlar grande parte do desenvolvimento de melanócitos 22- 24. melanoblastos humanos migram para a camada basal da epiderme, onde residem quer no bojo cabelo ou rodeado pelos queratinócitos na epiderme (unidades de formação de pigmentação) para servir como precursores para os melanócitos maduros, pigmentadas. A diferenciação e maturação de melanoblastos em melanócitos pigmentados ocorre concomitante com a colonização do bulbo capilar e expressão da via de produção de melanina (TYRP1, Tyr, e OCA2PMEL) 25,26.
Isolamento de melanócitos humanos e melanoblastos de pacientes é cara, difícil e limitando a quantidade. Este protocolo permite aos pesquisadores para diferenciar hPSCs (induzido ou embrionária) em melanócitos ou precursores de melanócitos em um método bem definido, rápida, reprodutível, escalável e de baixo custo, sem separação de células. O protocolo foi usado anteriormente para identificar defeitos de doenças específicas ao diferenciar iPSCs de pacientes com distúrbios de pigmentação.
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Protocol
NOTA: O protocolo de melanócitos descrito aqui foi demonstrada pela primeira vez por Mica et al.
1. Preparação de meio de cultura, revestido Pratos e manutenção de hPSCs
- médio Preparação
Nota: Armazenar todas meio a 4 ° C no escuro, durante até 2 semanas. Filtrar todo o meio para esterilização.- Prepare DMEM / FBS a 10%. Misturar 885 mL de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml de Pen / Strep e 5 ml de L-Glutamina. Filtro para esterilização.
- Prepare hESC-médio. Misturar 800 mL de DMEM / F12, KSR 200 mL, 5 mL de L-Glutamina, 10 ml de solução de MEM mínimo essencial aminoácidos, 1 ml de p-mercaptoetanol, e 5 mL de Pen / Strep. Após filtração adicionam-se 10 ng / ml de FGF-2.
- Prepare forma KSR-diferenciação: Misturar 820 mL de DMEM KO, KSR 150 ml, 10 ml de L-Glutamina, 10 ml de Pen / Strep, 10 ml de solução de MEM mínimo essencial aminoácidos e 1 ml β-mercaptoetanol. Filtro para esterilização.
- Prepare meio N2-diferenciação. Dissolve-se 12 g de DMEM / F12 de pó in 980 ml de dH 2 O. Adicionar 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonato de sódio e 100 mg de transferrina humana Apo. Misturar 2 ml de dH2O com 25 mg de insulina humana e 40 ul de NaOH 1 N; uma vez dissolvido, adicione a mistura para o meio. Adicionam-se 100 ul de di-hidrocloreto de putrescina, 60 ul de selenito, 100 ul de progesterona. Levar o volume final a 1 litro com dH2O antes da filtragem.
- Prepare médio de melanócitos completa. Combinar 50% de meio Neurobasal, 30% de DMEM de baixa glucose, e 20% MCDB201. Para este complemento: 0,8% ITS +, 250 nM de L-glutamina, 100 ^ M do ácido ascórbico (L-AA), 50 ng / ml de toxina da cólera, 50 ng / mL de SCF, 0,05 uM de dexametasona, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . Filtrar em condições estéreis, em seguida, adicionar os restantes reagentes: 2% de suplemento B27, 25 ng / ml de BMP4, CHIR99021 3 uM, 500 uM de cAMP.
- Revestimento de placas de cultura
- Realizar o revestimento utilizando proteína gelatinosa, como Matrigel. Após a abertura, alíquota e congelar Matrigel em 1 ml partes para evitar congelamento repetitivo degelo cycles. Descongelar e re-suspender-se uma alíquota congelada de 1 ml com 19 ml de DMEM / F12. Placa de 5 ml para uma placa de 10 cm. Incubar os pratos durante 1 h à TA. Aspirar a proteína gelatinosa imediatamente antes do plaqueamento das células e lavagem com meio DMEM / F12.
- Realizar revestimento utilizando Poly-L ornithin bromidrato / rato laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). Revestimento prato com PBS contendo 15 ug / ml de poli-L ornithin bromidrato. Incubar O / N a 37 ° C numa incubadora humidif içada. Aspirar a solução e lava-se as placas três vezes com PBS antes do revestimento com PBS contendo 1 ug / ml de laminina de rato-I e 2 ug / ml de fibronectina. Incubar os pratos de O / N a 37 ° C numa incubadora humidif içada.
- Antes do plaqueamento de células, aspirar a solução e deixar secar completamente as placas sem a tampa na capa de cultura de tecido. Permitir que as placas a secar durante cerca de 10-15 min.
Nota: Os pratos são secos e prontos para revestimento célula quando as estruturas cristalinas aparecem na superfície, por olho. o platES pode ser mantido com PBS contendo LAM / FN no incubador durante duas semanas, desde que o líquido se evapore. As placas podem ser mantidas secas à temperatura ambiente durante algumas horas.
- Antes do plaqueamento de células, aspirar a solução e deixar secar completamente as placas sem a tampa na capa de cultura de tecido. Permitir que as placas a secar durante cerca de 10-15 min.
- Manutenção de hPSCs
Nota: hPSCs são mantidas em 0,1% de gelatina e mouse mitoticamente inativada fibroblastos embrionários (MEFs) em hESC-médio. As células devem ser divididas a cada 6-8 dias.- Bata de um prato de 10 centímetros, com 0,1% de gelatina em PBS à temperatura ambiente durante 5 min.
- Descongelar MEFs congeladas rapidamente num banho de água a 37 ° C.
- Aspirar a gelatina e a chapa células. MEFs em placas a uma densidade de ~ 50.000 células / cm2 em DMEM / 10% de FBS. Incubar a 37 ° MEFs CO / N antes da adição hPSCs.
- Aspirar o% FBS DMEM / 10 da placa MEF preparado, lavar placa com PBS e adicionar 10 ml hESC-médio com hPSCs. A passagem hPSCs na proporção de 1: 5/10 dependendo da densidade antes da passagem em.
Nota: Se as hPSCs estão sendo descongeladas ou passadas como células individuais, supmentação com 10 mM dicloridrato de Y-27632 (Rocki) até a primeira passagem. - Alimentar as células diariamente com hESC-meio fresco 10 ml.
- Antes de iniciar uma diferenciação remover quaisquer colónias pluripotentes que aparecem para conter células diferenciadas, bordas irregulares, ou centros transparentes 28. Mecanicamente desalojar e aspirar as colônias irregulares com uma pipeta sob uma capela de fluxo laminar com um microscópio de dissecação.
2. chapeamento de hPSCs para Diferenciação
Nota: As condições de diferenciação são descritos para placas de 10 cm.
- Preparar 10 cm pratos de Matrigel antes de iniciar a diferenciação, tal como descrito no passo 1.3.1.
- Quando chapeamento hPSCs para uma diferenciação começar com uma chapa de hPSCs a uma densidade pronto para a passagem (~ 80% confluentes) aspirar o CTEh-forma, lava-se com PBS e adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para as células.
- Agitar vigorosamente o horizontall pratoy por 2 min enquanto visualiza sob o microscópio até que as MEFs levante como células individuais. As colônias HPSC deve permanecer solidários como colônias.
- Aspirar o tripsina após os MEFs ter levantado mas antes das colônias hPSCs desanexar.
- Adiciona-se 10 ml de células estaminais embrionárias humanas, meio contendo 10 uM Y-27632 dicloridrato à placa e separar as células por pipetagem para cima e para baixo sobre as colónias.
- Aspirar a solução de Matrigel do prato de 10 centímetros, preparado no passo 2.1 e lava-se com meio DMEM / F12 para remover aglomerados. A chapa hPSCs a uma proporção de 1: 2 para a placa de Matrigel. Adicionar hESC-meio contendo 10 mM Y-27632 dicloridrato de até 10ml. Incubar a 37 ° CO / N.
Nota: O chapeamento deve resultar em cerca de 100.000 células / cm2.
3. Indução da diferenciação neural
Nota: A diferenciação deve ser iniciado (dia 0), quando as hPSCs estão 80% confluentes. As células podem ser alimentados diariamente com células estaminais embrionárias humanas de médiocontendo 10 uM Y-27632 dicloridrato até começando a diferenciação.
- No dia 0 e no dia 1, alimentar as células com 10 ml de meio KSR-diferenciação contendo 100 nM e 10 uM LDN193189 SB431542.
- No dia 2, alimentar as células com 10 ml de meio KSR-diferenciação contendo 100 nM LDN193189, SB431542 10 mM e 3 uM CHIR99021.
- No dia 3, alimentar as células com 10 ml de meio KSR-diferenciação contendo 10 uM e 3 | iM SB431542 CHIR99021.
- Nos dias 4 e 5 alimentar as células com 15 ml de meio KSR-diferenciação de 75% e meio N2-diferenciação 25% contendo 3 uM CHIR99021.
Nota: Não se assuste para ver uma grande quantidade de morte celular em termos de células flutuantes. Isso é normal e esperado. - Nos dias 6 e 7 alimentar as células com 15 ml de meio KSR-diferenciação de 50% e meio N2-diferenciação de 50%, tanto contendo 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
- No dia 89 e alimentar as células com 20 ml de meio KSR-diferenciação de 25% e meio N2-diferenciação de 75%, tanto contendo 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
- Nos dias 9 e 10 preparam pratos PO / Lam / FN, conforme indicado no ponto 1.2.2 para o re-plaqueamento das células no dia 11.
- No dia 10 as células de alimentação com 20 ml de meio N2-diferenciação contendo 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
4. repique em gotas para especificação NC
- No dia 11 aspirado Lam / FN dos PO / LAM / placas FN preparados e secar completamente.
- Remova o meio a partir das células Dia 11, lava-se com PBS e adicione a solução de separação celular tal como 4 ml Accutase por placa de 10 cm. Incubar durante 25 min a 37 ° C.
- Adicionar 5 ml de meio completo melanócito para o prato e ressuspender as células por pipetagem manualmente cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL, até todas as células terem levantado do prato. Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml.
- girar acélulas para baixo durante 5 min a 200 x g e ressuspender as células a 2 x 10 6 culas por ml em meio completo de melanócitos. Contar as células utilizando a exclusão de azul de tripano num hemocitómetro ou técnica equivalente.
- gotas de 10 ul placa próximos entre si (sem lhes tocar) sobre as secas PO / Lam / FN placas de 10 cm. Se a placa foi suficientemente seca, as gotículas deveria ter bem bordas definidas e não correr.
Nota: Isto cria um ambiente de local de alta densidade para as células, o que é importante quando replating as células, enquanto se mantém dentro do quarto prato de expansão. - Permitir que as gotas em repouso à temperatura ambiente durante 10-20 minutos, para permitir que as células a aderir, em seguida, lentamente (para não perturbar as células ligadas) adicionar 10 mL de meio completo de melanócitos. Mover prato para a incubadora.
5. Expansão de Melanócitos Progenitores
- Continuar alimentando com meio de melanócitos completa a cada 2 a 3 dias.
Nota: A pigmentação deve começar a ser visível within cachos de células no final da primeira semana e tornar-se muito evidente na segunda semana. Ver a placa sobre um fundo branco, como uma folha de papel para discernir esses aglomerados pequenos e escuros adiantados. As células irão tornar-se progressivamente mais pigmentada ao longo do tempo, até que toda a placa é uniformemente pigmentada (Ver Figura 2B). - células de passagem uma vez por semana a uma razão de aproximadamente 1: 6 (revestimento de gotículas como já não é necessário nesta fase). Use Accutase dissociar as células e lavar duas vezes com meio Neurobasal comum antes de re-plaqueamento em meio completa de melanócitos. Manter as células no PO LAM placas / / FN.
Nota: Nós descobrimos que o meio completa de melanócitos é mais adequada para manter e expandir células estaminais embrionárias humanas e melanócitos iPSC derivados. No entanto, as células podem ser brevemente cultivadas em meio M254 disponíveis comercialmente, mas os meios de comunicação simplificada aumenta o risco de células que morrem e de elevação ao lado da placa.
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Representative Results
Este protocolo fornece um método para derivar melanócitos maduros, totalmente pigmentadas de hPSCs em um livre-alimentador, eficiente, e reprodutível modo in vitro. Em contraste com o fang et ai. Protocolo previamente estabelecido para os melanócitos HPSC-derivados, o protocolo descrito não requer meio condicionado e reduz a exigência de tempo. O protocolo fang et al. Utilizaram meio condicionado de uma linha celular murino de produção de Wnt3a e levou até 6 semanas para visualizar pigmentação 6,12. Para viés as células-tronco da crista neural em direção a um destino de melanócitos (melanoblastos), removemos os inibidores de BMP e TGF-p (LDN e SB, respectivamente) após um impulso inicial e, posteriormente, introduzir BMP4 exógeno e EDN3 sinalização no sexto dia, mantendo a ativação Wnt (CHIR) 6. Os melanoblastos resultantes podem ser caracterizados pela expressão do KIT e MITF, bem como a manutenção de SOX10 exprESSÃO 6. Expressão de SOX10 podem ser visualizados em áreas na placa de cultura que formam cumes de dia 11 de cultura (Figura 1B - C).
Após a indução de melanoblasto, as células são passadas para placas de LAM PO / / FN e alimentadas com meio completo de melanócitos. Este é um meio extremamente rica que tem a vantagem adicional de ser selectivo para a população de melanócitos, eliminando a necessidade de qualquer célula fluorescente-Activated Triagem 6. Durante a maturação dos melanócitos, a célula regula positivamente os genes de síntese de melanina e TYR TYRP1 mantendo muitos dos genes melanoblasto, incluindo TYRP2. Células estaminais derivadas dia25 melanócitos mancha adequadamente para as proteínas de produção de melanina e TYRP1 TYRP2 (Figura 2). Este protocolo é robusto e tem sido usado com a linha de células estaminais embrionárias humanas H9 e em várias linhas da IPSC. Mais recentemente, este protocolo foi utilizado para reproduzir fielmente o ul características trastructural de doenças de pigmentação usando específicos do paciente linhas de IPSC 6.
Figura 1. As etapas críticas no protocolo de diferenciação de melanócitos derivados de células estaminais embrionárias humanas. (A) O esquema de protocolo de diferenciação. KSR: médio KSR-diferenciação, N2: meio N2-diferenciação, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: Bone proteína morfogenética 4, EDN3: endotelina-3, Rocki: Y-27632 dicloridrato B - C. Mostra GFP fluorescência de imagem (C) de diferenciação brightfield (B) e no dia 11 antes do repique utilizando um pSOX10 transgênico: Linha GFP hESC. As cristas escuras visíveis nas imagens de campo claro são enriquecidas para células SOX10 + que darão origem a melanoblastos e, eventualmente, melanócitos. carregar 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" / _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. melanócitos e estágios intermediários. (A) O Dia pigmentada 25 células (à direita) podem ser facilmente visualizadas e distinguidas de Dia células 11 (esquerda) quando peletizada. (B) por dia 20 do protocolo a cultura irá conter ambos, os melanócitos vencimento não pigmentadas e totalmente maduras, melanócitos pigmentados. (C - D) Os melanócitos podem ser visualizados sob campo luminoso e tanto o amadurecimento e melanócitos totalmente pigmentadas mancha para o marcador TYRP2 melanoblasto / melanócitos. (E - F) Apenas a mancha melanócitos pigmentados para a fase tardia melanócito marcador TYRP1.obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para a diferenciação de melanócitos bem sucedida de hPSCs as seguintes sugestões deve ser tomado em consideração. Em primeiro lugar, é essencial para trabalhar sob condições de cultura estéreis em todos os momentos. Além disso, é importante para iniciar com pluripotentes, hPSCs totalmente indiferenciadas; se a população começando contém células diferenciadas o rendimento será invariavelmente cair como os contaminantes não pode ser dirigida para melanócitos e pode mesmo perturbar ainda mais as células adequadamente diferenciadoras.
Para assegurar que as células permanecem pluripotentes ter o cuidado de respeitar as regras bem estabelecidas para a manutenção de células-tronco; alimentar e passagem regularmente e noivo as culturas para remover as células diferenciadas antes passaging. Quando passaging para proteína gelatinoso para a diferenciação é importante que o prato é adequadamente revestido para evitar que as células de levantar-se durante a diferenciação.
O melanoblasto diferemciação deve ser iniciado em torno densidade celular de 80%; muito altas densidades levará ao aumento da morte celular, enquanto demasiado baixas densidades afetará negativamente a diferenciação. Quando passaging, as células deverão ser lavadas duas vezes para remover qualquer solução de separação celular antes do plaqueamento. Para maximizar a sobrevivência no dia 11, é importante para passagem das células em alta densidade, gotas bem espaçados que são intocado durante 20 min, de modo a que as células aglomeram e aderir.
Este protocolo é eficaz na geração de um grande número de melanócitos, e será valiosa quando se estuda amostras humanas de doentes de quantidade limitada. Além disso, como a população de melanócitos derivados de PSC é selectiva e expansível a população de melanócitos pode ser multiplicado a um grande número de células, mesmo que os rendimentos baixos números de diferenciação ou percentagens de melanócitos. Iniciando o protocolo com iPSCs abre a possibilidade para o estudo de doenças do desenvolvimento e amostras de pacientes específicos. uma limitation deste protocolo é o fato de os melanócitos são derivados como uma monocultura sem todos os outros tipos de células presentes que formam o seu nicho normais in vivo. Além disso, o protocolo exige perícia em técnicas de cultura e diferenciação HPSC. No entanto, com os recentes desenvolvimentos no campo produzindo hPSCs IPSC tornou-se cada vez mais gerenciável e métodos para hPSCs cultura se tornaram rotina. Até à data, o protocolo foi utilizado no nosso laboratório para produzir melanócitos a partir da linha embrionárias humanas H9, bem como a partir de 14 linhas iPS geradas a partir de 5 dadores diferentes.
Mica et al. Usado este protocolo com sucesso para a derivação de melanócitos a partir de células estaminais embrionárias humanas humana e iPSCs 6. O papel demonstrado que iPSCs derivadas de pacientes com defeitos de pigmentação poderia ser diferenciada em melanócitos e o protocolo produzido fielmente melanossomas do tamanho e quantidade fenotípica associada com a doença.
o work ilustrada uma das muitas aplicações possíveis para o protocolo com o uso de melanócitos iPSC derivados para estudar mecanismos da doença e introduziu a possibilidade de aumentar a produção para a seleção da droga 6,29. Significativamente, o papel demonstrou a robustez e reprodutibilidade do protocolo para a produção de melanócitos a partir de um grande conjunto de linhas hiPSC geneticamente distintas.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa para pesquisadores de melanoma do M. Nicolay Fundação Joanna e pelos Institutos Nacionais de Saúde sob Ruth Service Award L. Kirschstein National Research F31. Este trabalho foi ainda apoiada por meio de doações de NYSTEM ea iniciativa de células estaminais Tri-institucional (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
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