Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

По сравнению с обычной электрической стимуляции, фотостимуляции обеспечивает большую временное и пространственное разрешение с минимальным вмешательством в физиологической системе образцов. Так как демонстрации использования лазеров для стимуляции нейронов в 1971 году 1, многие творческие пути были изобретены , чтобы экзогенно контролировать активность нейронов с помощью света. Оптический выпуск photocaged агонистов уже давно используется для изучения физиологической реакции нейронной сети для лигандов 2,3,4. Этот метод имеет ограниченную специфичность за счет диффузии проарретированных агонистов. Генетическая специфичность достигается за счет эктопически , выражающих светочувствительных Opsin каналов и насосов 5,6,7, и он был успешно применен для модуляции выбранных нейронных сетей в различных модельных организмах. Тем не менее, было бы трудно применить этот метод к оптически контролировать различные другие нейронные белки, так как прививка photoresponsiveness из Opsin белков с другими белками would требуют интенсивного инженерии, которые могут изменить естественные свойства белка в исследовании. Химически привязывать экзогенный светочувствительная лиганда с белком показал еще один способ контролировать функциональность канала белков 8,9,10. Лиганд представлен или выведены из сайта связывания белка через фотоизомеризации азобензола фрагмента. Привязывание химии ограничивает применение главным образом к внеклеточной стороне мембранных белков, за исключением внутриклеточную сторону и внутриклеточных белков.

Фоточувствительных УААН, после того, как включаются в белки, обеспечивают общую стратегию манипулирования белки со светом. В начале усилий, химически тРНК ацилируют с photocaged УААН были микроинъекции в ооциты Xenopus включать УААН в мембранных рецепторов и ионных каналов 11, которые продвинули понимание их структурно-функциональных отношений 12,13,14.Этот микроинъекции подход в основном ограничивается крупными ооцитов. Генетическое введение в UAA минует технически сложной ацилирования тРНК и микроинъекции с использованием ортогонального тРНК / синтетазы пару, которая включает в UAA через эндогенного трансляции белков в живых клетках 15,16,17,18. Uaa включение в нейрональных белков было продемонстрировано в первичных нейронов и нервных стволовых клеток 19,20. Совсем недавно, фоточувствительных Uaa генетически включены в нейрональных белка в головном мозге млекопитающих в естественных условиях в первый раз 21. Эти достижения позволяют изучать нейронные белки с УААН в их родной клеточной среде.

Внутренне выпрямления калиевого канала Kir2.1 сильный выпрямитель , который проходит K + токи более легко , чем в из клетки, и это имеет важное значение в регуляции физиологических процессов , в том числе возбудимости клеток, сосудистого тонуса, частоты сердечных сокращений, повторноеNAL поток соли и инсулин - релиз 22. Сверхэкспрессия Kir2.1 hyperpolarizes мембранного потенциала мишени нейрона, который становится менее возбудимой 23,24. Для того, чтобы оптически контролировать Kir2.1 в своих родных клеток, Кан и др. Генетически заложенная фото реагирующих Uaa в Kir2.1 экспрессируется в клетках млекопитающих, нейронов и эмбриональных мозга мыши 21. Краткий импульс света был способен преобразовывать UAA в природной аминокислоты цистеина, таким образом, активации целевого Kir2.1 белка. Когда было высказано это фото-индуцируемый белок канала внутрь выпрямления калия (Pirk) в гиппокампа крысы первичных нейронов, она подавлена ​​нейронов стрельбы в ответ на световой активации. Кроме того, было выражено канал Pirk в эмбриональном неокортекса мыши, и измеряли свет активированного Pirk тока в корковых нейронов. Успешное внедрение технологии UAA в естественных условиях в головном мозге млекопитающих открывает дверь в оптически контролировать нейронные белкив их родной среде, что позволит оптической рассечение нейрональных процессов и механизмов на молекулярном уровне.

В этом протоколе мы опишем процедуры генетической включения УААН в первичных нейронов в культуре , так и в эмбриональном мозге мышей в естественных условиях. Фоточувствительных Uaa Cmn и Kir2.1 используются для иллюстрации процесса. Методы оценки успешного UAA включения и оптический контроль нейрональной активности белка предусмотрены. Этот протокол обеспечивает четкое руководство генетически кодирующий УААН в нейронах и в естественных условиях, а также оптически регулирующие функции нейронов белка с помощью фоточувствительных UAA. Мы ожидаем , что этот протокол для содействия принятию технологии UAA в естественных условиях для нейробиологии и оптогенетика биологических исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры в данном исследовании были проведены с использованием Institutional Уход за животными и использование комитета (IACUC) утвердил протоколы для обработки животных на Солка института биологических исследований, La Jolla, CA.

1. Uaa Включение в Kir2.1 и экспрессия результирующей Pirk в первичной культуре нейронов

  1. ДНК Строительство
    1. Выберите целевой сайт Kir2.1 для UAA включения. Exploit предварительных знаний и информации о структуре и функции Kir2.1, так что выбранный сайт с фоточувствительных UAA Инкорпорейтед позволяет оптической модуляции Kir2.1 функции 21.
    2. Построить рекомбинантный ген Kir2.1 ДНК, кодирующей с выбранного участка мутантного к TAG янтарного стоп-кодона. С помощью стандартных методов клонирования 25 для клонирования ДНК Kir2.1-TAG в плазмиды экспрессии млекопитающего.
    3. гены / синтетазы Клон т-РНК, которые являются специфическими для UAA и введения UAA в ответ наТКГ стоп - кодон в другой экспрессии млекопитающих плазмидной 21.
      Примечание: Для получения оптимального UAA включения, различные промоторы и комбинации генов кассет (для тРНК, синтетазы и Kir2.1) могут быть испытаны в различных плазмид.
    4. Получение высокого качества с использованием плазмидных ДНК минипрепаративную или maxiprep коммерческих наборов в соответствии с протоколом производителя. Около 1,9 соотношения 260/280 является оптимальным для очищенной ДНК. При необходимости выполнения электрофореза в агарозном геле , чтобы проверить чистоту ДНК 25 нацелен. Суперспиральная плазмидные ДНК с высокой степенью чистоты являются лучшими для нейронного трансфекции.
  2. Культура гиппокампа крысы Первичная Нейроны
    1. Место покровные стекла (круги, 12 мм в диаметре) в 24-луночных планшетах, один покровное на каждую лунку и пальто каждую лунку 250 мкл 0,5 мг / мл поли-D-лизином (в 100 мМ боратного буфера: 1,24 г Борна кислоты и 1,90 г тетраборат натрия в 400 мл деионизованной дистиллированной H 2 O или DDH 2
    2. В день вскрытия, собирать неонатальные мозги от послеродовых крысят (1-4 день после рождения) после того, как обезболивающее их с изофлуран и обезглавливание. Обезболить щенкам в обезболиванием камере, содержащей изофлуран (2-4%). Подождите, пока они не теряют сознание и не реагируют на тактильные раздражители и защемление лап.
    3. С помощью стандартной методики 26, рассекают гиппокампа из мозга в теплой (~ 37 ° С) физиологический раствор (10 мМ HEPES и 20 мМ D-глюкозы добавили в сбалансированном солевом растворе Хэнкса), и собирают гиппокампа в коническую пробирку с 4,5 мл теплого солевого раствора ,
    4. Добавьте 500 мкл 2,5% трипсина в гиппокампе (0,25% конечная концентрация трипсина), и инкубируют в течение 10 мин на водяной бане при 37 ° С.
    5. Тщательно промойте ткань с солевым раствором (3 х 10 мл), и измельченного в порошок.
    6. Восстановление диссоциированного нейронов в 1 мл шСреды для выращивания рука, содержащие минимальную поддерживающую среду (MEM), дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 21,2 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 2% B-27, и 0,1% сыворотки расширители.
      Примечание: Добавить L-глютамин и B-27 в день диссекции, чтобы подготовить свежую культуральную среду.
    7. Подсчитайте нейроны с помощью гемоцитометра, и пластины их на покровных стеклах в 24-луночные планшеты в количестве 1,0-1,5 х 10 5 клетки / лунку плотности с 500 мкл среды роста после того, как фильтруют через нейлоновое сито 40 мкм.
    8. Выдержите нейронную культуры при 35 ° С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном термостате в течение 2-3 недель. Для достижения наилучшего результата, не тревожить культуру как можно больше во время инкубации.
  3. фосфат кальция (Ca-P) Трансфекция первичной культуры нейронов
    1. Сделать растворы и хранят при температуре 4 ° С: 0,5 М BES (N, N - бис- [2-гидрокси-этил] -2-аминоэтансульфоновая кислота) буфера (10x); 150 мМ Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 М NaCl (10x); стерильной DDH 2 O; Стерильный 1 N NaOH.
    2. В день трансфекции, сделать свежий 2,5 М раствора CaCl 2 в DDH 2 O и стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм фильтр. Сделать свежий 2x БЭС-буфером (ББ) буфера , содержащего 50 мМ BES, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, и 280 мМ NaCl при рН 7,00 (доведения рН с помощью NaOH) и стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм фильтр.
      Примечание: Вычислить количество раствора CaCl 2 и BBS буфере в зависимости от количества покровных для трансфекции. Также обратите внимание на 1.3.4.
    3. Замените носитель роста культуры с 500 мкл свежей подогретого питательной среды для трансфекции. (Трансфекция носители могут быть сделаны с MEM плюс 21,2 мМ D-глюкозы).
      Примечание: Не выбрасывайте старые СМИ.
    4. Рассчитать количество DDH 2 O и подготовить для добавления для того , чтобы сделать раствор для трансфекции (33 мкл на каждом покровном) , содержащую 1,65 мкл CaCl 2, 0,7 мкг ДНК, и 16,5 &# 181; л 2x BBS.
    5. Приготовьте раствор для трансфекции непосредственно перед добавлением его к культуре. Чтобы приготовить, сначала объединить CaCl 2 и DDH 2 O при медленном перемешивании трубку. Продолжить перемешивание и медленно добавляют ДНК в раствор. Наконец, добавьте 2x BBS буфера по каплям при перемешивании.
    6. Сразу же добавить 30 мкл раствора для трансфекции в каждом покровном нейронального культуры.
    7. Рок культуры блюдо несколько раз , чтобы перемешать раствор и инкубировать при 35 ° С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном инкубаторе в течение 45 мин-1 час. После того, как нейроны инкубируют с раствором для трансфекции, очень тонкие Ca-P преципитаты будет формировать слой покрытия нейронов.
    8. Заменить трансфекция носитель с 500 мкл предварительно нагреты промывочным буфером (135 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 4 мМ КСl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ глюкозы при рН 7,3, стерильный фильтруют через фильтр 0,22 мкм) и инкубируют при температуре 356; С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном инкубаторе в течение 15-20 мин. Ca-P осадки исчезнут после стадии промывки.
    9. Замените промывочный буфер с 500 мкл свежей питательной среды. Опять же, замените носитель роста с сохраненным исходного носителя.
    10. Добавьте UAA Стп (предварительно перемешанные в 50 мкл теплой питательной среды) к культуре достигнет 1 мМ конечной концентрации.
    11. Выдержите трансфи- культуры при 35 ° С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном термостате в течение 12-48 ч перед анализами.
  4. Цельноклеточные Запись с помощью активации светом
    1. Подготовьте дополнительные / внутриклеточные решения. Внутриклеточный раствор содержит 135 мМ глюконат калия, 10 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 2,56 мМ K 2 АТФ и 0,3 мМ Li 2 ГТФ при рН 7,4. Внеклеточный раствор записи содержит 150 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 0,5 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы, и 10 мМ HEPES при рН 7,4.
    2. Установите светоизлучающий диод (LED) с излучением 385 нм с помощью микроскопа на буровой, чтобы доставить свет координатору от 1 см в сторону под углом 45 °. Проверьте питание светодиода с легким измерителем мощности.
  5. Извлечь патч пипетки из стеклянных электродов с использованием коммерческого микропипетки съемник иметь 3-6 МОм сопротивление пипеток. Следуйте инструкциям производителя, чтобы настроить микропипетки съемник.
    1. Чтобы проверить сопротивление пипеток, сначала заполнить пипетку с внутриклеточным раствором и поместите его на держатель электрода. Dip пипетки в чашку для культивирования 35 мм, заполненную внеклеточной раствор, помещенный на предметное рlatform. Погружают заземляющий электрод в блюдо, чтобы завершить контур.
    2. Включите усилитель / дигитайзером и начать программное обеспечение для сбора данных. Монитор сопротивления пипетки с помощью контрольной мембраны протокола.
  6. Вынимают покровное культуры нейрон из инкубатора и прополоскать один раз во внеклеточном растворе. С помощью вакуумной смазки, удерживая покровное в середине чашки для культивирования 35 мм, наполненную свежим внеклеточной раствором.
  7. Поместите покровное / блюдо на электрофизиологии микроскопа платформы.
  8. Используя стандартные методы патч зажима, патч нейрон с mCitrine флуоресценции 27. Запись нейронную активность, используя текущий зажим метод (I-зажим). Во-первых, регулировать потенциал покоя до около -72 мВ, вводя небольшой ток. Затем впрыскивают шаг тока (10-200 Pa), чтобы вызвать непрерывную стрельбу (5-15 Гц) потенциалов действия.
  9. Вручную или с помощью программного обеспечения для сбора данных, флэш-импульс (грехгле импульса 100 мс -1 длительностью сек) светодиода к нейрону во время записи, и посмотреть , если потенциалы действия будут затронуты.
  10. Добавьте 0,5 мМ BaCl 2 в ванну и убедитесь, что потенциалы действия восстанавливаются.

2. Uaa Включение в Kir2.1 и экспрессия результирующей Pirk в мышиных эмбриональных мозга в естественных условиях

  1. ДНК Строительство
    1. Дизайн плазмидной ДНК так же, как на стадии 1.1. Для экспрессии в естественных условиях, используют сильный промотор , такой как ПНП (курица промотор бета-актина с CMV энхансер).
    2. Очищают ДНК с эндотоксинов maxiprep коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Выполнение экстракции фенолом-хлороформом с последующим осаждением этанолом 25 для получения чрезвычайно высокого качества ДНК (сокращенную до 2-5 мкг / мкл).
  2. Внутриутробно электропорации к мышиных эмбриональных неокортекса
    Примечание: Основная технидие для внутриутробно электропорации было описано ранее 28.
    1. Обезболить приурочен беременной мыши на эмбриональной день 14,5 (E14.5) с фенобарбиталом натрия (внутрибрюшинное введение, 50 мкг на грамм массы тела) или изофлуран (ингаляции, 2-4%). Мониторинг глубины анестезии путем проверки потери сознания и не реагирует на тактильные раздражители и защемление лап.
    2. Сделайте небольшой надрез в брюшной средней линии. Осторожно разоблачить рога матки с щипцами и кончиками пальцев.
    3. Вводят около 1 мкл раствора ДНК (2-5 мкг / мкл каждой плазмиды, в зависимости от конструкции) в боковой желудочек каждого однопометница со стеклянной пипетки, вставленной через стенку матки. В большинстве случаев, около 60-80% от общего количества эмбрионов инъецируют.
    4. Электропорации эмбрионов с электропоратора (33-35 V, 50 мсек, 950 мсек интервала, 4-8 импульсов).
    5. Возвращение рога матки в брюшную полость осторожно дляCEPS и кончики пальцев. Шовный мышечную стенку, а затем кожа с хирургическим швом, чтобы позволить эмбрионы продолжать развитие.
  3. Uaa Микроинъекция
    1. Сделайте небольшой надрез в брюшной средней линии снова на E16.5, и мягко разоблачить рога матки с щипцами и кончиками пальцев.
    2. Вводят около 2-5 мкл CMN-Ala (500 мМ) до электропорации или с обеих сторон бокового желудочка со стеклянной пипеткой, вставленной через стенку матки. Для увеличения Cmn биодоступности, используйте дипептид Cmn-Ala (Cmn-аланин) , чтобы доставить Стп в естественных условиях 21.
    3. Опять же, вернуть рога матки в брюшную полость осторожно пинцетом и кончиками пальцев. Шовный мышечную стенку, а затем кожа с хирургическим швом, чтобы позволить эмбрионы продолжать развитие.
  4. Получить Острый Brain Ломтики
    1. Сделать 1 л искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) , содержащий 119 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,3 мМ MgCl 2, 2,5 мМ CaCl 2 PO 4, 26,2 мМ NaHCO 3, и 11 мМ глюкозы при рН 7,3.
    2. Возьмите 200 мл ACSF и быстро замерзает при -80 ° С в течение 20-30 мин. Пузырь остальные ACSF с 5% CO 2: 95% O 2 газа при комнатной температуре.
    3. Подготовить и стерилизовать хирургические инструменты, чтобы собрать мозги из эмбрионов. Также приготовьте ведро льда.
    4. Сделать ~ 100 мл 4% -ного раствора агарозы с низкой температурой плавления в колбе при нагревании в микроволновой печи. Охладить раствор в течение приблизительно 5 минут, прежде чем он начинает затвердевать.
    5. Эвтаназии мыши 12-24 ч после инъекции Cmn-Ала СО 2 передозировки. Сделайте большие разрезы в брюшной области, и рассекать из электропорации / микроинъекции эмбрионов из матки с мелкими ножницами и пинцетом.
    6. Урожай головной мозг эмбрионов с мелкими ножницами и пинцетом.
    7. Поместите каждый мозг на блюдо культуры 10 см, размещенной на ведро льда. Разделить два полушария, используя острый нож, и место каждогополусфера на блюдо с среднесагиттальных плоскости касаясь дно тарелки. Быстро полить раствора агарозы над мозгом (около 500 мкл на полушарие).
    8. Используя острый нож, квадрат разрезать агарозы вокруг мозга, чтобы сделать мозг встраиваемый агарозном блок.
    9. Используя клей ткани, клей вниз Среднесагиттальная плоскую поверхность блока агарозы на горе для vibratome. Заполните vibratome камеру с предварительно охлажденным ACSF и нарезать 200 мкм сагиттальных мозга.
    10. Выдержите острые ломтики в ACSF , дополненной 3 мМ мио -inositol, 0,4 мМ аскорбиновой кислоты и 2 мМ пирувата натрия при 33 ° С в течение 42 мин при продувании с 5% CO 2: 95% O 2 газа.
    11. Через 42 мин, выключить нагреватель и продолжают инкубировать срезы при комнатной температуре с барботированием. Начало цельноклеточная ЗАПИСЬ заплату по меньшей мере, через 15 мин после выключения нагревателя.
  5. Цельноклеточные Запись с помощью активации светом
    1. Подготовка ИНТРАКellular раствор , содержащий 130 мМ глюконат калия, 4 мМ MgCl 2, 5 мМ HEPES, 1,1 мМ EGTA, 3,4 мМ Na 2 АТФ, 10 мМ креатин фосфата натрия и 0,1 мМ Na 3 ГТФ при рН 7,3 , скорректированной с KOH.
    2. Извлечь патч пипетки из стеклянных электродов с использованием коммерческого микропипетки съемник иметь 3-6 МОм сопротивление пипеток.
    3. Настройка ломтик электрофизиологии буровой установки для цельноклеточной патч зажима и переливать записи камеры с ACSF в 2 мл / мин скорости с перфузионного насоса. Отрегулируйте температуру в камере до 33 ° C.
      Примечание: Срез электрофизиологическое установка оснащена перфузионной камеры, с целью погружения в воду и регулятор температуры. Кроме того, фильтр GFP (возбуждение: 480/30 нм, эмиссия: 535/40 нм) и mCherry фильтр (возбуждение: 580/20 нм излучение: 675/130 нм) обязательны для заполнения.
      1. Установка светодиодной подсветкой с излучением 385 нм с помощью микроскопа на буровой, чтобы доставить свет координатору от 1 см в сторону под углом 45 °угол. Проверьте питание светодиода с легким измерителем мощности.
    4. Тщательно подобрать кусочек мозга со стеклянной пипетки и место в перфузионной камере. Удерживая кусочек с арфой.
    5. Патч нейрон с mCherry / GFP флуоресценции от неокортекса области 27. Pirk активность Запись с помощью зажима напряжения (метод V-зажим). Во-первых, держать мембранного потенциала при -60 мВ. Затем запись токов при фиксированных отрицательных мембранных потенциалов (-100 мВ) или пандусы напряжения (-100 мВ до +40 мВ). В частности, мониторинг Kir2.1 конкретные внутренние токи при -100 мВ.
    6. Вручную или с помощью программного обеспечения для сбора данных, флэш - импульс (один импульс 100 мс -1 длительностью сек) света СИД к нейрону во время записи, и посмотреть , если Pirk белки активируются. После того, как Pirk активируется, внутренние токи при -100 мВ, значительно возрастет.
    7. Добавьте 0,5 мМ BaCl 2 в ванну и проверить , является ли Pirk инактивируется снова.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы генетически включать UAA в белок в нейронах, первый важный шаг для разработки соответствующих генных конструкций для доставки и эффективно экспрессировать гены в нейронах. Существуют три генетические компоненты для UAA включения: (1) ген-мишень с тэгом янтарный стоп-кодон, введенной в выбранном месте для UAA включения (2) ортогональная тРНК признать мутировавший TAG стоп-кодон, и (3) ортогональный аминоацил -tRNA синтетазы для зарядки UAA на ортогональное тРНК. Каждый компонент должен быть обусловлен соответствующим промотором. Эти три генные кассеты могут быть включены в одну плазмиду или разделены на несколько плазмид. Чтобы выразить Pirk в нейронах, фотореактивная Uaa Cmn встроен в Kir2.1 с использованием ортогональных тРНК Leu Куа / CmnRS (Cmn-тРНК синтетазы) пара эволюционировали , чтобы быть специфическими для Cmn 21,29. Остатки Cys169 из Kir2.1 гена мутируют к TAG янтарный стоп-кодон (Kir2.1-TAG), и флуоресцентный белок mCitrine слит с С-концом Kir2.1 визуализировать экспрессию Pirk в нейрональной культуре (рисунок 1).

Получение хорошего качества нейронную культуры является необходимым условием для успешных экспериментов Pirk. Постнатальный день 1-4 Sprague Dawley крысят, как правило, используются для приготовления нейрональной культуры, но эмбрионов крыс также часто используются. Когда высевали на покровные в 24-луночные планшеты при плотности 1,0-1,5 х 10 5 клеток / лунку, следует видеть хорошо отделенных здоровые нейроны с не слишком много микроглии или другого мусора (фиг.2А). Здоровые нейроны имеют обширные процессы и клеточные тела (сомы) пухлые (рис 2B). Отчетливо видна структура suborganelle обычно является признаком нездорового культуры. Нейронные культуры можно поддерживать в течение 2-3 недель при температуре 35 ° C в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном термостате.

Сalcium фосфат (Ca-P) трансфекция является очень щадящий метод трансфекции подходит для чувствительной культуры нейронов. Тем не менее, это требует особой точности и осторожности, чтобы добиться высокой эффективности трансфекции в нейронах. Маточные растворы должны храниться при температуре 4 ° С, и перемешивают, чтобы сделать 2х буфера BBS в день трансфекции. Точная регулировка рН является ключом к воспроизводимо получить успешные результаты. 2,5 М раствор CaCl 2 также должны быть сделаны на свежий день трансфекции. Все буферы должны быть отфильтрованы. Кроме того, свежие ДНК-плазмиды с высокой чистотой и качеством улучшить результаты. Для достижения наилучших результатов, можно получить свежие мини-ДНК из нацелен не заросших культуры Escherichia coli (~ 12 ч при 37 ° С в дрожащей инкубаторе). После того как все буферы будут готовы, принести решения в капот культуре ткани и подготовиться к трансфекции. С помощью вихря на низкой скорости, перемешивать раствор для трансфекции при перемешивании. Немедленно добавьте смешанный раствор в нейронную кубlture, и принести культуры блюдо обратно в инкубатор. Прекратить трансфекцию через 45 мин-1 час, и добавить оригинальный культуральную среду обратно в культуру непрерывного инкубации. Трансфицированные нейроны могут быть визуализированы с 6 ч после трансфекции прекращается (рисунок 3). При наличии CMN в культуральной среде, Pirk выражается и Pirk-экспрессирующих нейронов имеют зеленый флуоресцентный из - за белка mCitrine , слитого с С-концом Pirk (Рисунок 3D). Pirk-экспрессирующие нейроны имеют нормальную базальную физиологии и они способны выстреливать потенциалы действия в ответ на инжектированных токов (рисунок 4). Тем не менее, эта серия потенциалов действия немедленно подавлено с коротким световым импульсом блистала на клетки (рис 4а). Когда 0,5 мМ BaCl 2, а Kir2.1 специфический ингибитор, добавляют в ванну, нейрональный обжиг затем возобновлено, что указывает , что предыдущее подавление было связано с активацией Kir2.1 по лIGHT (4В). Нетрансфецированной нейроны управления не реагируют на свет или Ba 2+ (рис 4C, D).

Чтобы выразить Pirk в естественных условиях, должны быть получены высокочистые и концентрированные ДНК - плазмиды (2-5 мкг / мкл). Конкретные плазмиды , используемые в этих экспериментах, показаны на рисунке 5А. В дополнение к ортогональной тРНК Leu АПЗ / CmnRS пары и ген Kir2.1-TAG - мишени, гене , кодирующем зеленый флуоресцентный белок с мутацией TAG (GFP-TAG) также является одним из электропорации в качестве флуоресцентного репортера. Обнаружение флуоресценции GFP будет означать успешную доставку всех трех плазмид, так как подавление TAG в GFP потребует как тРНК Leu CUA и CmnRS; Cmn включение в GFP-TAG предложил бы включение Cmn в Kir2.1-TAGas хорошо, потому что оба гена присутствуют в той же самой клетке. Три генные конструкции все ИнджеИДКТК в боковой желудочек эмбрионов мыши на E14.5 (рис 5В, левая панель). После электропорации, возвращают зародыши в брюшной полости, чтобы позволить эмбрионы продолжать развитие. Через два дня вводят около 2-5 мкл CMN-Ala (500 мМ) до электропорации или с обеих сторон бокового желудочка, в аналогичным образом , как инъекции ДНК (Фиг.5В, средняя панель). Опять же, возвращение эмбрионов в брюшную полость для непрерывного развития. Эмбрионы могут быть собраны на E17.5 для визуализации или электрофизиологических анализов. Как и следовало ожидать, только с Cmn-Ala инъекции, зеленый флуоресцентный клетки наблюдаются в коре головного мозга мыши. Клетки с как красной и зеленой флуоресценции должны были Cmn включены в Kir2.1-TAG сделать Pirk каналы (6А) Рис. Запись цельноклеточная из эмбрионального неокортекса среза делается аналогично тому, как это делается на нейрональной культуре. Зеленый и красный флуоресцентные нейроны не имеют внутренний ток при пеисключаемых холдинг потенциал, но краткий импульс света быстро активирует внутренний ток (рис 6б). Ток полностью блокируется путем добавления Ba 2+, подтверждая , что она порождается Pirk.

Рисунок 1
Рисунок 1: Pirk плазмида экспрессии , набор для Нейрон культуры Схема , показывающая примерную конструкцию плазмиды для экспрессии Pirk в культуре нейронов.. Top плазмида кодирует ген Kir2.1 (серый) с одной мутацией аминокислоты в сайте C169 под цитомегаловируса (CMV) промотора. C169 мутирует к TAG янтарного стоп-кодона, где Uaa Cmn будет включен. Kir2.1 гена сопровождается геном mCitrine (зеленый). mCitrine слит с C-концом гена Kir2.1 для визуализации Pirk клетки, экспрессирующие. Дно плазмида кодирует CmnRS (розовый), ЦМН специфическую синтетазу, движимый мыши фосфоглицераткиназы-1 (mPGK) промотора. тРНК > Leu АПЗ (синий), ортогональное тРНК 21, также выражается в той же плазмиды под контролем промотора H1, но в обратном направлении.

фигура 2
Рисунок 2: гиппокампа крысы первичных нейронов культуры Примерные фотографии , показывающие здоровый гиппокампа крысы нейронные культуры.. (A) DIC образ нейрональной культуры на 10 дней в пробирке (ДИВ). Нейроны созревают, как они разветвляются дендриты и аксоны. Микроглии клетки (маленькие и круглые клетки без процессов) сосуществуют, но не подавят культуру. (В) Увеличенное изображение ДИК здоровых культивированных нейронов. Здоровый нейрон проявляет пухлой тела клетки (сомы) и выраженной дендритов / аксоны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Рисунок 3
Рис . 3: экспрессия Pirk в культуре первичных нейронов ДИК и флуоресценции изображений крыс нейронов гиппокампа , культивируемых в пробирке и трансфицированных генных конструкций , изображенных на рисунке 1 для экспрессии Pirk. Когда Cmn не добавляется в культуре после трансфекции (А и В), не зеленая флуоресценция не обнаруживается нейронов. В присутствии Cmn (1 мМ) в ростовой среде, трансфицированные нейроны способны выражать полнометражных Pirk-mCitrine белки, тем самым показывая зеленую флуоресценцию (C и D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

.jpg "/>
Рис . 4: Легкая активация Pirk подавляет стрельбы из крыс нейронов гиппокампа (А) Один световой импульс подавляет активность гиппокампа нейрон , выражающей Pirk. Характерные следы напряжения записываются непрерывно в ток-зажим. Потенциал действия обжиг, вызванный 20 Pa инжекции тока (I-этап). Освещенность (385 нм, 40 мВт / см 2, 1 сек, указываемой стрелкой) быстро и полностью подавляет нейронную стрельбу. Обжиг восстанавливается с внеклеточной 500 мМ BaCl 2, который селективно ингибирует Kir2.1 каналов. (B) Ультрафиолетовое (УФ) освещение (385 нм, 40 мВт / см 2, 6 сек, показано с желтой коробкой) не изменяет возбудимость контроля, нетрансфецированной нейронов. Действие потенциал стрельбы вызывается 50 пА инжекции тока (I-этап). (C и D) Ни УФ - освещения , ни BaCl 2 (500 мМ) влияет на возбудимость нейронов управления. Действие сильнодействующимриала вызывается 50 пА инжекции тока (I-этап).

Рисунок 5
Рисунок 5: Процедуры для экспрессии Pirk в коре головного мозга мышей в естественных условиях. Плазмиду экспрессии (А) Pirk комплект. Лучшие плазмида: плазмида для CmnRS регулируетс промотором CAG и mCherry через внутренний сайт входа рибосомы (IRES). mCherry флуоресценции будет проверить успешное выражение CmnRS. Средний плазмида: плазмиды для Kir2.1 гена в сочетании с тремя копиями тРНК Leu Куа, ортогональной тРНК для включения Cmn 21. Дно плазмида: плазмиды для GFP_Y182 TAG. Ген GFP проектируется с янтарным стоп - кодона на разрешительного сайте Tyr182 (GFP_Y182 TAG) для визуализации успешного включения ЦМН помечать сайты 21. (B) Мультфильм шокрыло экспериментальная процедура для экспрессии Pirk в естественных условиях. Генные конструкции для экспрессии Pirk вводятся в неокортекса мыши (E14.5) и электропорации внутриутробно (левая панель). Через два дня, Cmn-Ала впрыскивается в желудочке в электропорации или с обеих сторон полушарий большого мозга (средняя панель). Кусочек изображений и электрофизиологические анализ может быть выполнен на E17.5-E18.5 (правая панель).

Рисунок 6
Рисунок 6: Выражение Pirk в коре головного мозга мыши и легкой активации. (A) Флуоресцентные изображения мышиных эмбриональных корковых нейронов , показывающих включение Cmn в GFP и Kir2.1 белков в естественных условиях. Три генные конструкции на рисунке 5А электропорации внутриутробно. mCherry флуоресценции демонстрирует успешную экспрессию конкретного Synthe CmnГен TASE, CmnRS. GFP флуоресценции обнаружена только с Cmn-Ала инъекции (внизу), что указывает на включение Cmn в GFP TAG и , вероятно , Cmn включения в Kir2.1 TAG. Таким образом, зеленый и красный флуоресценции свидетельствует об успешном окончании экспрессии всех трех плазмид и Cmn инкорпорации. (B) IV участок токов , зарегистрированных от мышей нейронов неокортекса , показывающие светозависимое активацию Pirk. Через два дня после того, как генные конструкции на рисунке 5А были электропорации, Cmn-Ala вводили в утробе матери; 12-48 ч после Cmn-Ala инъекции, неокортикальные острые срезы были получены из эмбрионов. Pirk-экспрессирующих нейронов в срезах, обнаруженных как красной и зеленой флуоресценции, регистрируются перед (черный) и после (синий) воздействия света (385 нм, 8 мВт / см 2, 10 сек для насыщенного воздействия). BaCl 2 (500 мМ) добавляется для проверки Pirk специфические токи после фотоактивации (оранжевый).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для достижения эффективного фото-модуляции, важный начальный шаг должен решить, где включить фоточувствительных UAA в белка-мишени. Структурно-функциональная информация целевого белка очень полезно, чтобы служить ориентиром при выборе возможных участков. В то же время, цель Светорегулирование бы определить, какой сайт является наиболее подходящим. После выбора кандидатов сайтов, мы рекомендуем , чтобы проверить сайты в клеточных линиях млекопитающих , таких как эмбриональной почки человека (НЕК) клеток для облегчения культуры и манипуляций, прежде чем перейти к первичным нейронами и в естественных условиях. Для того, чтобы определить место для Kir2.1 фотоактивации, множественные сайты вдоль поры Kir2.1 первоначально были испытаны в НЕК клетках. C169 из Kir2.1 был найден оптимальным, поскольку Kir2.1 размер пор, где проживает C169 достаточно велик, чтобы вместить Cmn боковые цепи, но достаточно мал для Cmn боковые цепи, чтобы блокировать ионный канал. Когда Cmn был включен в C169 в Kir2.1 выражается в НЕК клеток, тон в результате мутантные Kir2.1 был неактивным , но стал активируется после короткого Пуле света, что подтверждает успешное развитие Pirk 21.

Эффективное выражение ортогональной тРНК и синтетазы имеет решающее значение для достижения высокой эффективности инкорпорации UAA в клетках и в естественных условиях. Ген ортогональным синтетазы эффективно выражается с помощью полимеразы II промотор и сигналы поли-A часто используются в клетках млекопитающих и нейронов. Для экспрессии ортогональной тРНК, особый тип-3 - полимеразы III промотор, такой как промотор H1 , используемого здесь, вместе с последовательностью 3'-фланкирующих необходимы , как было описано ранее 18,20. Для исследований в естественных условиях, мы обнаружили , что три копии кассеты экспрессии тРНК повышение эффективности инкорпорации Cmn по сравнению с одной копией (рис 5А). В другом исследовании в клетках млекопитающих, увеличение количества экспрессии кассеты тРНК также увеличена эффективность UAA инкорпорации 30. TherEfore, мы предлагаем оптимизировать количество кассет экспрессии тРНК для различных УААН, клеток и белков-мишеней, когда Uaa эффективность инкорпорация нуждается в улучшении. Биодоступность УААН в клетках и в естественных условиях является еще одним важным фактором для включения UAA. Предыдущие исследования показали , что этерификация УААН увеличивает их поглощение в клетках млекопитающих 31, и что подготовка УААН в виде дипептида увеличивает поглощение UAA в клетки в Caenorhabditis Элеганс 32. Мы обнаружили , что непосредственно кормления Стп к нейрональной культуральной среды является достаточным для Cmn включение в Kir2.1 выражается в культуре первичных нейронов, но недостаточно для включения в головном мозге мышей в естественных условиях 21. Таким образом, дипептид Cmn-Ала был синтезирован и вводили в мозг мыши. Олигопептид Транспортер PEPT2 высоко экспрессирована в грызунах мозге 33, которые могут облегчить транспортировку дипептида в нейроны. Усвоены DIPEptide будет гидролизуется клеточных пептидаз с получением UAA Стп для включения. Действительно, с этой оптимизации мы добились эффективного Cmn включения в нейрональных белков во множестве областей эмбрионального мозга мыши, в том числе неокортекса, таламуса и гипоталамуса 21.

Успешное выражение Pirk в нейронах сильно зависит от подготовки здоровых нейронов культуры. Каждый шаг в протоколе должны быть выполнены в точном и дотошным образом. После подготовки культуры, лучше всего поддерживать культуру в инкубаторе без помех. Открытие и закрытие двери инкубатора, а также перемещение культуры блюдо и из инкубатора, можно добавить до подрыва качества культуры. Нижний предел температуры инкубатора (35 ° С вместо 37 ° С) помогает уменьшить эксайтотоксичности. На аналогичную ноту, Ca-P трансфекция должно быть сделано с дополнительной осторожностью. Подготовка буфера 2x BBS является важным шагом. Это хорошая идея, чтобы Calibrate оптимальный рН для 2x BBS буфера между рН 6,90-7,15, так как новые конструкции ДНК или Preps может изменить условия трансфекции. Буфер рН может быть отрегулирован с точностью до 0,01 цифр, если это помогает достичь стабильных результатов. Перед трансфекцией носитель рост нейрональной культуры заменяется новым. Крайне важно, чтобы сохранить оригинальный носитель роста, и добавить обратно в культуре после трансфекции, чтобы восстановить исходное состояние. Поддержание нейрон культуры в свежую среду после трансфекции будет мешать нейроны от восстановления, так как в нем отсутствуют основные молекулы для пролиферации клеток, таких как факторы роста, освобожденных из нейронов.

Для легкой активации Pirk в культивируемых клетках и срезах тканей, надлежащего источника света и способ доставки необходимо определить. Cmn поглощает длинные и средние волны УФ-света (280-400 нм). Тем не менее, длительное воздействие УФ-излучения, особенно коротким ультрафиолетовым светом длиной волны, будет вредным для клеток. В Сэмуе время, далеко красный свет может нагреть образец возмущении клетки. Таким образом, светодиод с излучением одной длины волны лучше всего подходит для активации Pirk. Для Cmn фотолиза светодиода с излучением 385 нм (~ 40 мВт; Prizmatix) был выбран. Светодиод снаружи устанавливается рядом с микроскопом, и оптическое волокно используется для доставки свет именно к нейрону в фокусе. Для воспроизводимости сбора данных, оптическое волокно устанавливается на 1 см в сторону под углом 45 ° от нейрон в фокусе. Свет мощность на образце измеряли 40 мВт / см 2. Кроме того, рекомендуется периодически проверять LED производительность с помощью оптического измерителя мощности.

Показано , что внутриутробно электропорации является эффективным методом генетически включать УААН в естественных условиях. Внутриутробное электропорации плазмидных ДНК в мышиных эмбриональных неокортекса выполняется , как описано выше 34, с незначительными изменениями. Чтобы выразить Pirk белки в neonataл мозг мышей, две хирургические процедуры необходимы (рис 5B). Первый шаг заключается в инъекционные генные конструкции для экспрессии Pirk с последующим электропорации. Через два дня, второй инъекции мозга выполняется для доставки Cmn-Ала. Это потребовало бы практику квалифицированно выполнять хирургические операции, не подчеркивая животных слишком много. После каждой операции, животные должны быть ухаживают и проверены на регулярной основе в течение восстановления. Достаточное и своевременное наличие CMN в мозге имеет важное значение для правильного выражения Pirk. 2-5 мкл ЦМН-Ala (500 мМ), как правило, вводят в эмбриональное мозга. Иногда это помогает придать Cmn-Ala в желудочке на обоих электропорации и противоположном полушарии, так как Cmn-Ала с противоположной стороны будет диффундировать к электропорации стороне для длительного питания Cmn. Принимая во внимание общую полезность внутриутробно электропорации, этот метод может быть применен не только для нейронов неокортекса , но и к нейронамв других областях мозга, таких как стриатума, диэнцефалона и мозжечка, когда электропорации / место инъекции корректируется для каждого региона. Эмбриональные / неонатальной мозг намного мягче, чем взрослые мозги, так что было бы трудно получить острые кусочки для электрофизиологических экспериментов. Агарозном вложение помогает стабилизировать эмбриональную структуру мозга для vibratome резки. Несмотря на то, низкая температура плавления агарозы минимизирует температурный шок тканей мозга, необходимо соблюдать осторожность при заливке расплавленную агарозу над холодными мозгами. Влияние температурного шока на ткани из агарозы вложения был незаметен во время записи целых клеток.

Генетически кодирующий фоточувствительных УААН в культуре нейронов и в естественных условиях, на примере Pirk здесь, будет позволить себе оптогенетика технику для управления различными нервными деятельность белка со светом в их родной среде. В настоящее время протокол представляет собой процедуру, шаг за шагом для проведения экспериментов экспрессии Pirk и активации Iп нейронная культуры в пробирке и в мозге грызунов в естественных условиях, представляющих первое успешное развитие системы ААУ для использования в мозге млекопитающих. Он имеет потенциал, чтобы принести пользу исследования многих природных белков, а также их последствия при заболеваниях. Например, α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) рецепторов и N-метил-D-аспартата (NMDA) рецепторы имеют сходные структуры с трансмембранных Kir2.1 каналами. Поэтому было бы целесообразно применять методологию Pirk этих лигандов ионных каналов. Кроме того, метод Pirk также может быть использован для решения патофизиологии связанных Kir2.1 генетических заболеваний, таких как синдром Андерсена и синдром короткого интервала QT сердца 35,36. В дополнение к "блок-и-релиз" Cys через CMN, множественные аминокислоты , такие как тирозин, серин, лизин, глутамат, аспартат и глицина были в клетке с различными photoreleasable группами 37. Таким образом, подобные стратегии могут быть использованыd на фото регулировать эти аминокислоты в нейронах в пробирке и в естественных условиях. Кроме того, обратимо оптический контроль может быть достигнут с азобензола содержащих УААН, и такие UAAS теперь были генетически закодированы в E. палочка и клетки млекопитающих 38,39.

Таким образом, этот протокол представляет собой общий метод для контроля активности нейрональных белков в их родных настройках с помощью света. По сравнению с другими методами, включающими оптогенетика Opsin-семейные и другие светочувствительные белки или домены, этот метод использует генетически закодированы светочувствительных УААН и изменяет только один остаток. Таким образом, он должен иметь минимальное вмешательство в функции, торговли и локализации белка-мишени при исследовании. Высокий сайт-селективность также может быть достигнуто с этими генетически кодируемых световыми реагирующих УААН, чтобы обеспечить большую гибкость и специфичность для детального молекулярного исследования. Этот протокол также обеспечивает первое совместноеmprehensive, простой в следовать процедуре , как успешно включать УААН в белки в нейронах в пробирке и в естественных условиях. Оптический контроль общих белков с помощью генетически закодированного УААН в нейронах в пробирке и в естественных условиях имеет большой потенциал , чтобы принести пользу как основной и поступательной науки, и этот протокол будет способствовать его применению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Tags

Neuroscience выпуск 109 неестественно аминокислоты генетический код подавление янтарный ионный канал оптогенетика свет активации оптический контроль photocage нейрон нейронная активность мозг
Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. … More

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter