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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

En comparación con la estimulación eléctrica convencional, fotoestimulación ofrece una mayor resolución temporal y espacial con una interferencia mínima para el sistema fisiológico de las muestras. Desde la demostración del uso de rayos láser para estimular las neuronas en 1971 1, de muchas maneras creativas se han inventado para controlar la actividad neuronal de forma exógena con la luz. Liberación óptico de agonistas photocaged ha sido utilizado para estudiar la respuesta fisiológica de la red neuronal a ligandos 2,3,4. Esta técnica ha limitado especificidad debido a la difusión de los agonistas enjaulados. Especificidad genética se consigue mediante ectópica expresan canales opsina sensibles a la luz y bombas 5,6,7, y se ha aplicado con éxito para modular las redes neuronales seleccionadas en diversos organismos modelo. Sin embargo, sería difícil de aplicar este método para controlar ópticamente varias otras proteínas neuronales, ya que el injerto photoresponsiveness de las proteínas opsina a otras proteínas would requerir la ingeniería intenso que puede alterar las características naturales de la proteína en estudio. Químicamente la inmovilización de un ligando exógeno fotosensible a una proteína ha demostrado otra manera de controlar la funcionalidad de proteínas de los canales 8.9.10. El ligando se presenta o se retira del sitio de unión de la proteína a través de la fotoisomerización de la fracción de azobenceno. Tethering química limita la aplicación principalmente en el lado extracelular de proteínas de membrana, con exclusión de la parte intracelular y proteínas intracelulares.

Photoresponsive Uaas, después de haber sido incorporado en proteínas, proporcionan una estrategia general para manipular las proteínas con la luz. En los primeros esfuerzos, ARNt acilado químicamente con Uaas photocaged con microinyecciones en oocitos de Xenopus para incorporar los Uaas en los receptores de membrana y los canales de iones 11, que han contribuido a la comprensión de sus relaciones estructura-función 12,13,14.Este enfoque de microinyección se limita principalmente a grandes ovocitos. Incorporación genética de una Uaa no pasa por el desafío técnico tRNA acilación y microinyección mediante el uso de un par de ARNt / sintetasa ortogonal, que incorpora la SAU a través de la traducción de proteínas endógenas en células vivas 15,16,17,18. Uaa incorporación en proteínas neuronales se ha demostrado en las neuronas primarias y células madre neurales 19,20. Más recientemente, photoresponsive Uaa se ha incorporado genéticamente en una proteína neuronal en el cerebro de mamíferos in vivo, por primera vez 21. Estos avances hacen que sea posible estudiar proteínas neuronales con Uaas en su ambiente celular nativo.

Interiormente rectificación del canal de potasio Kir2.1 es un rectificador fuerte que pasa K + corrientes más fácilmente en que fuera de la célula, y es esencial en la regulación de procesos fisiológicos incluyendo la excitabilidad celular, el tono vascular, la frecuencia cardíaca, resal flujo final y la liberación de insulina 22. La sobreexpresión de Kir2.1 hiperpolariza el potencial de membrana de la neurona objetivo, que se hace menos excitable 23,24. Para controlar ópticamente Kir2.1 en sus células nativas, Kang et al. Incorpora genéticamente un Uaa foto-sensible en Kir2.1 expresa en células de mamíferos, las neuronas y los cerebros de embriones de ratón 21. Un breve pulso de luz era capaz de convertir la SAU en un aminoácido natural Cys, activando de este modo la proteína Kir2.1 objetivo. Cuando esto dentro rectificación de potasio (PIRK) proteína del canal de foto-inducible se expresa en neuronas de rata primarias del hipocampo, que suprime la activación neuronal en respuesta a la activación de la luz. Además, el canal PIRK se expresó en la corteza cerebral de embriones de ratón, y se midió la corriente PIRK activado por la luz en las neuronas corticales. La aplicación con éxito de la tecnología SAU en vivo en el cerebro de los mamíferos se abre la puerta para controlar ópticamente proteínas neuronalesen su ambiente nativo, lo que permitirá la disección óptica de procesos y mecanismos neuronales a nivel molecular.

En este protocolo se describen procedimientos para la incorporación de genética Uaas en neuronas primarias en la cultura y en el cerebro de embriones de ratón in vivo. El photoresponsive Uaa Cmn y Kir2.1 se utilizan para ilustrar el proceso. Métodos para evaluar el éxito incorporación UAA y control óptico de la actividad de la proteína neuronal se proporcionan. Este protocolo proporciona una guía clara para que codifica genéticamente Uaas en las neuronas y en vivo, y a la regulación de la función de proteínas ópticamente neuronal a través de un Uaa fotosensible. Esperamos que este protocolo para facilitar la adopción de la tecnología in vivo Uaa de la neurociencia y estudios biológicos optogenética.

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Protocol

Todos los procedimientos descritos en el presente estudio se realizaron utilizando Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) aprobaron protocolos para el manejo de animales en el Instituto Salk para Estudios Biológicos en La Jolla, CA.

1. Incorporación Uaa en Kir2.1 y Expresión de la resultante en el PIRK cultivos neuronales primarios

  1. La construcción de ADN
    1. Seleccionar un sitio diana de Kir2.1 para Uaa incorporación. Explotar el conocimiento previo y la información acerca de la estructura y la función de Kir2.1, de modo que el sitio elegido con el photoresponsive Uaa Incorporated permite de modulación óptica de la función Kir2.1 21.
    2. Construir un gen Kir2.1 ADN recombinante que codifica el sitio elegido mutado para el TAG codón de parada ámbar. Utilizar las técnicas de clonación estándar 25 para clonar el ADN Kir2.1-TAG en un plásmido de expresión de mamífero.
    3. Clone tRNA genes / sintetasa que son específicos para la UAA y incorporan la SAU en respuesta ael codón de parada TAG en otro plásmido de expresión de mamíferos 21.
      Nota: Para una óptima incorporación UAA, diferentes promotores y combinaciones de los casetes de genes (por tRNA sintetasa, y Kir2.1) pueden ser probados en diferentes plásmidos.
    4. Obtener los ADN de plásmido de alta calidad usando miniprep o maxiprep kits comerciales de acuerdo con el protocolo del fabricante. Alrededor de 1,9 de la relación 260/280 es óptimo para el ADN purificado. Cuando sea necesario, realizar una electroforesis en gel de agarosa para comprobar la pureza del ADN preparado 25. ADN de plásmido superenrollado con alta pureza son los mejores para la transfección neuronal.
  2. Cultura rata neuronas del hipocampo primaria
    1. cubreobjetos lugar de vidrio (círculos, de 12 mm de diámetro) en placas de 24 pocillos, uno cubreobjetos en cada pocillo, y la capa de cada pocillo con 250 l de 0,5 mg / ml de poli-D-lisina (en 100 mM de tampón de borato: 1,24 g bórico ácido y 1,90 g de tetraborato de sodio en 400 ml de desionizada H2O destilada o ddH 2
    2. En el día de la disección, recoger los cerebros de ratas neonatales de las crías después del parto (día postnatal 1-4) después de anestesiar con isoflurano y decapitar. Anestesiar a los cachorros en una cámara que contiene anestesia con isoflurano (2-4%). Espere hasta que pierden la consciencia y no responden a los estímulos táctiles y pellizcos de las patas.
    3. Utilizando la técnica estándar 26, diseccionar hipocampo del cerebro en caliente (~ 37 ° C) solución salina (HEPES 10 mM y 20 mM D-glucosa añadida en solución salina equilibrada de Hank), y recoger hipocampos en un tubo cónico con 4,5 ml de solución salina caliente .
    4. Añadir 500 l de 2,5% de tripsina a los hipocampos (0,25% de concentración final de tripsina), y se incuba durante 10 min en un baño de agua a 37 ° C.
    5. Enjuague el tejido con solución salina (3 x 10 ml) y se tritura.
    6. Recuperar las neuronas disociadas en 1 ml wmedios de cultivo que contienen brazo medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 21,2 mM de D-glucosa, 2 mM L-glutamina, 2% de B-27, y el extensor de suero 0,1%.
      Nota: Añadir L-glutamina y B-27 en el día de la disección para preparar un medio de crecimiento fresco.
    7. Cuenta las neuronas con un hemocitómetro, y la placa ellos en cubreobjetos en placas de 24 pocillos a 1,0 a 1,5 x 10 5 células / pocillo densidad con medio de crecimiento 500 l después de filtró a través de una malla de nylon 40 micras.
    8. Incubar el cultivo neuronal a 35 ° C en un 5% de CO 2: 95% de aire humidificado incubadora durante 2-3 semanas. Para un mejor resultado, no molestar a la cultura tanto como sea posible durante la incubación.
  3. El fosfato de calcio (Ca-P) La transfección de cultivos neuronales primarias
    1. Hacer las soluciones madre y se almacena a 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -bis [2-hidroxi-etil] -2-aminoetanosulfónico ácido) tampón (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); ddH estéril 2 O; NaOH estéril 1N.
    2. En el día de la transfección, hacer solución fresca 2,5 M CaCl 2 en ddH 2 O y el filtro estéril con 0,22 micras filtro. Hacer memoria intermedia amortiguadora de BES fresca 2x Saline (BBS) que contiene BES 50 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 280 mM a pH 7,00 (ajustar el pH con NaOH) y el filtro estéril con 0,22 micras filtro.
      Nota: Se calcula la cantidad de solución de CaCl 2 y tampón de BBS en función del número de cubreobjetos a transfectar. También mire 1.3.4.
    3. Vuelva a colocar el medio de crecimiento de cultivo con 500 medios de cultivo de transfección l fresca precalentada. (El medio de transfección se pueden hacer con MEM más 21,2 mM D-glucosa).
      Nota: No se deshaga de los viejos medios.
    4. Calcular la cantidad de ddH 2 O y se preparan para añadir con el fin de hacer que la solución de transfección (33 l por cada cubreobjetos) que contiene 1,65 l CaCl 2, 0,7 g de ADN, y 16.5 y# 181; l 2x BBS.
    5. Preparar la solución de transfección inmediatamente antes de añadir a la cultura. Para preparar, combinar la primera CaCl2 y ddH2O mientras se agita lentamente el tubo. Continuar agitando y se añade lentamente el ADN en la solución. Por último, añadir tampón 2x ​​BBS gota a gota mientras se agita.
    6. Inmediatamente añadir 30 l de la solución de transfección a cada cubreobjetos de cultivo neuronal.
    7. Roca la placa de cultivo de un par de veces para mezclar la solución y se incuba a 35 ° C en un 5% de CO 2: 95% de aire humidificado incubadora de 45 min-1 hr. Después de las neuronas se incuban con la solución de transfección, muy finos precipitados Ca-P formarían una capa que cubre las neuronas.
    8. Sustituir el medio de transfección con 500 l pre-calentado tampón de lavado (NaCl mM 135, HEPES 20 mM, KCl 4 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, glucosa 10 mM a pH 7,3, estéril filtrado con 0,22 micras filtro) y se incuba a 356; C en un 5% de CO 2: 95% incubadora humidificada de aire durante 15-20 min. precipitados de Ca-P desaparecerían después de la etapa de lavado.
    9. Reemplazar el tampón de lavado con 500 l medio de cultivo fresco. Una vez más, sustituir el medio de cultivo con el medio original guardado.
    10. Añadir la SAU CMN (pre-mezclado en 50 l de medios de crecimiento en caliente) al cultivo hasta llegar a concentración final 1 mM.
    11. Incubar el cultivo transfectadas a 35 ° C en un 5% de CO 2: 95% incubadora humidificada de aire para 12 a 48 h antes de los ensayos.
  4. La grabación de la célula entera con Luz de la activación
    1. Preparar soluciones supletorias / intracelulares. La solución intracelular contiene 135 mM de gluconato de potasio, NaCl 10 mM, 2 mM MgCl 2 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1, 2.56 mM K 2 ATP, y 0,3 mM Li 2 GTP a pH 7,4. La solución de registro extracelular contiene NaCl 150 mM, KCl 3 mM, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl 2, glucosa 5 mM, y HEPES 10 mM a pH 7,4.
    2. Instalar un diodo emisor de luz (LED) con emisión de 385 nm por el microscopio en la plataforma para entregar la luz al punto focal de 1 cm de distancia en un ángulo de 45 °. Compruebe la alimentación del LED con un medidor de potencia de luz.
  5. Tire de pipetas de parches de electrodos de vidrio utilizando un extractor de micropipeta comercial para tener 3-6 mO resistencia pipeta. Siga las instrucciones del fabricante para configurar el extractor de micropipeta.
    1. Para poner a prueba la resistencia de la pipeta, primero llenar la pipeta con la solución intracelular y colocarlo en el soporte del electrodo. Sumergir la pipeta en una placa de cultivo de 35 mm llena con la solución extracelular, colocado en el microscopio platform. Sumergir un electrodo de tierra en el plato para completar un circuito.
    2. Encienda el amplificador / digitalizador y comenzar un programa de adquisición de datos. Vigilar la resistencia de la pipeta con un protocolo de ensayo de membrana.
  6. Sacar un cubreobjetos de la cultura de la neurona de la incubadora y se lava una vez en la solución extracelular. El uso de grasa de vacío, mantenga pulsado el cubreobjetos en medio de una placa de cultivo de 35 mm llena con la solución extracelular fresco.
  7. Coloque el cubreobjetos / plato en la plataforma del microscopio electrofisiología.
  8. Utilizando las técnicas de parches de sujeción estándar, parchear una neurona con fluorescencia mCitrine 27. la actividad neuronal, grabe en la pinza de corriente Método (I-clamp). En primer lugar, ajustar el potencial de reposo de alrededor de -72 mV mediante la inyección de una pequeña corriente. A continuación, se inyecta una corriente de paso (10-200 pA) para inducir el funcionamiento continuo (5-15 Hz) de los potenciales de acción.
  9. Manualmente o utilizando el software de adquisición de datos, el flash de un pulso (un pecadoGLE pulso de 100 ms -1 segundos de duración) de la luz LED de la neurona durante la grabación, y ver si se ven afectados los potenciales de acción.
  10. Añadir 0,5 mM BaCl2 al baño y verificar si se recuperan los potenciales de acción.

2. Incorporación Uaa en Kir2.1 y Expresión de la resultante PIRK en el cerebro de embriones de ratón in vivo

  1. La construcción de ADN
    1. Diseñar el ADN de plásmido de manera similar como en el paso 1.1. Para la expresión in vivo, utilizar un promotor fuerte como CAG (promotor de la beta-actina de pollo con potenciador de CMV).
    2. Se purifica el ADN con un kit comercial maxiprep libre de endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realizar la extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol 25 para adquirir el ADN de calidad extremadamente alta (condensado de 2-5 mg / l).
  2. La electroporación en el útero a la embrionarias de ratón Neocórtex
    Nota: El techni básicaQue en el útero de la electroporación se ha descrito previamente 28.
    1. Anestesiar un ratón embarazada transitoria en el día embrionario 14,5 (E14.5) con pentobarbital sódico (inyección intraperitoneal, 50 g por gramo de peso corporal) o isoflurano (inhalación, 2-4%). Monitorear la profundidad anestésica mediante la comprobación de la pérdida de la conciencia y no hay respuesta a los estímulos táctiles y pellizcos de las patas.
    2. Hacer una pequeña incisión en la línea media abdominal. exponer suavemente los cuernos uterinos con fórceps y alcance.
    3. Inyectar aproximadamente 1 l solución de ADN (2-5 mg / l de cada plásmido, dependiendo del constructo) en el ventrículo lateral de cada camada con una pipeta de vidrio insertado a través de la pared uterina. En la mayoría de los casos, se inyecta alrededor del 60-80% de los embriones totales.
    4. Electroporate los embriones con un electroporador (33-35 V, 50 ms de duración, intervalo de 950 ms, 4-8 pulsos).
    5. Volver los cuernos uterinos de la cavidad abdominal para suavemente conceps y alcance. Suturar la pared muscular y la piel con sutura quirúrgica para permitir que los embriones para continuar el desarrollo.
  3. UAA microinyección
    1. Hacer una pequeña incisión en la línea media del abdomen de nuevo en E16.5, y exponer suavemente los cuernos uterinos con fórceps y alcance.
    2. Inyectar aproximadamente 2-5 l CMN-Ala (500 mM) a un lado a electroporación o ambos lados del ventrículo lateral con una pipeta de vidrio insertado a través de la pared uterina. Para aumentar la biodisponibilidad Cmn, utilice el dipéptido CMN-Ala (CMN-alanina) para entregar Cmn in vivo 21.
    3. Una vez más, devolver los cuernos uterinos de la cavidad abdominal con cuidado con fórceps y alcance. Suturar la pared muscular y la piel con sutura quirúrgica para permitir que los embriones para continuar el desarrollo.
  4. Obtener aguda del cerebro rebanadas
    1. Hacer 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contiene NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, 1,3 mM MgCl 2, CaCl 2,5 mM 2 PO 4, 26,2 mM NaHCO3, y 11 mM a pH 7,3.
    2. Tomar 200 ml ACSF y rápido de congelación a -80 ° C durante 20-30 minutos. Burbuja el resto de ACSF con 5% de CO 2: 95% de O 2 gas a temperatura ambiente.
    3. Preparar y esterilizar instrumentos quirúrgicos para cosechar los cerebros de los embriones. También hay que preparar un cubo de hielo.
    4. Hacer solución ~ 100 ml 4% de bajo punto de fusión de agarosa en un matraz por calentamiento en un horno de microondas. Enfriar solución durante aproximadamente 5 min antes de que comience a solidificarse.
    5. La eutanasia del ratón horas después de la inyección 12-24 CMN-Ala de CO 2 sobredosis. Hacer grandes incisiones en el área abdominal, y diseccionar los embriones a electroporación / microinyección del útero con unas tijeras finas y pinzas.
    6. Cosecha cerebros de los embriones con unas tijeras finas y pinzas.
    7. Coloque cada cerebro en una placa de cultivo de 10 cm colocado en el cubo de hielo. Dividir dos hemisferios utilizando una cuchilla afilada, y coloca cada unohemisferio en el plato con el plano sagital medio tocando el fondo del plato. verter rápidamente en la solución de agarosa sobre el cerebro (alrededor de 500 l por hemisferio).
    8. Usando una cuchilla afilada, corte cuadrado de la agarosa alrededor de un cerebro para hacer un bloque de agarosa al cerebro embebido.
    9. El uso de adhesivo tisular, pegamento abajo de la superficie plano sagital medio del bloque de agarosa en un montaje de vibratome. Llenar la cámara vibratome con ACSF enfriado previamente cortado y 200 micras rodajas de cerebro sagital.
    10. Incubar las rebanadas agudas en ACSF suplementado con -inositol 3 mM myo, ácido ascórbico 0,4 mM, y piruvato de sodio 2 mM a 33 ° C durante 42 min mientras se burbujeaba con 5% de CO 2: 95% de O 2 gas.
    11. Después de 42 minutos, apague el calentador y continuar incubar las rodajas a temperatura ambiente con burbujeo. Iniciar la grabación de parches de células enteras al menos 15 minutos después de apagar el calentador.
  5. La grabación de la célula entera con Luz de la activación
    1. Preparar el intracsolución ellular que contiene 130 mM de gluconato de potasio, 4 mM MgCl 2 mM, HEPES 5, EGTA 1,1 mM, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM fosfato de creatina de sodio, y 0,1 mM Na 3 GTP a pH 7,3 ajustado con KOH.
    2. Tire de pipetas de parches de electrodos de vidrio utilizando un extractor de micropipeta comercial para tener 3-6 mO resistencia pipeta.
    3. Configurar la plataforma de electrofisiología para la rebanada de células enteras patch clamp y superfuse la cámara de grabación con ACSF a 2 ml / min con una velocidad de bomba de perfusión. Ajuste la temperatura de la cámara de alrededor de 33 ° C.
      Nota: El equipo de perforación rebanada electrofisiología está equipado con una cámara de perfusión, un objetivo de inmersión en agua y un controlador de temperatura. Además, el filtro de GFP se requieren (675/130 nm de excitación:: 580/20 nm de emisión) (excitación:: 480/30 nm, emisión 535/40 nm) y el filtro mCherry.
      1. Instalar un LED con la emisión de 385 nm por el microscopio en la plataforma para entregar la luz al punto focal de 1 cm de distancia en unos 45 °ángulo. Compruebe la alimentación del LED con un medidor de potencia de luz.
    4. Recoja cuidadosamente un corte de cerebro con una pipeta de vidrio y colocar en la cámara de perfusión. Mantenga pulsada la tecla en el sector con un arpa.
    5. Parchear una neurona con fluorescencia mCherry / GFP de la región neocortical 27. actividad PIRK registro usando método de fijación de voltaje (V-clamp). En primer lugar, mantener el potencial de membrana a -60 mV. Entonces, registrar las corrientes a potenciales fijos negativos de membrana (-100 mV) o rampas de tensión (-100 mV a 40 mV). Específicamente, dar seguimiento Kir2.1 corrientes de entrada específicos a -100 mV.
    6. Manualmente o utilizando el software de adquisición de datos, el flash de un pulso (un pulso de 100 ms -1 segundos de duración) de la luz LED de la neurona durante la grabación, y ver si se activan las proteínas Pirk. Una vez que se activa PIRK, corrientes hacia el interior a -100 mV aumentarían significativamente.
    7. Añadir 0,5 mM BaCl2 al baño y verificar si PIRK se inactiva de nuevo.

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Representative Results

Para genéticamente incorporar un Uaa en una proteína en las neuronas, el primer paso importante es diseñar gen apropiado construye para entregar y expresar genes de manera eficiente en las neuronas. Hay tres componentes genéticos para Uaa incorporación: (1) el gen diana con el codón de parada TAG ámbar introducido en el sitio elegido para Uaa incorporación (2) un ARNt ortogonal a reconocer la mutado codón de parada TAG, y (3) una aminoacil ortogonal -tRNA sintetasa para cargar la SAU en el ARNt ortogonal. Cada componente debe ser dirigido por el promotor apropiado. Estos tres casetes de genes se pueden incluir en un plásmido o separados en varios plásmidos. Para expresar PIRK en las neuronas, la foto-reactiva Uaa Cmn se incorpora en Kir2.1 utilizando los ortogonales tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA sintetasa) par evolucionado para ser específico para Cmn 21,29. Residuos Cys169 de gen Kir2.1 se muta al codón de parada TAG ámbar (Kir2.1-TAG), y la proteína fluorescente mCitrine se fusiona al C-terminal de Kir2.1 para visualizar la expresión PIRK en cultivo neuronal (Figura 1).

La obtención de cultivo neuronal de buena calidad es un requisito previo para experimentos exitosos Pirk. el día postnatal 1-4 crías de ratas Sprague Dawley se utilizan generalmente para la preparación de cultivo neuronal, sin embargo, también se utilizan con frecuencia embriones de rata. Cuando se sembraron en cubreobjetos en placas de 24 pocillos a 1,0-1,5 x 10 5 células / pocillo densidad, uno debe ver las neuronas sanas bien separadas con no demasiado microglia u otros residuos (Figura 2A). Las neuronas sanas tienen procesos extensos, y los cuerpos celulares (soma) son rollizo (Figura 2B). Distintivamente estructura suborganelle visible es generalmente un signo de la cultura malsana. Cultivo neuronal se puede mantener durante 2-3 semanas a 35 ° C en el 5% de CO 2: incubador humidificado 95% de aire.

dofosfato alcium (Ca-P) transfección es un método de transfección muy suave apropiado para cultivo neuronal sensible. Sin embargo, requiere una precisión extrema y precaución para lograr una alta eficiencia de transfección en las neuronas. Las soluciones madre necesitan ser almacenados a 4 ° C, y se mezcla para hacer tampón de BBS 2x en el día de la transfección. ajuste del pH precisa es la clave para obtener resultados exitosos reproducible. La solución de CaCl2 2,5 M también debe hacerse fresco en el día de la transfección. Todos los tampones deben ser filtrada. Por otra parte, los plásmidos de ADN frescas con alta pureza y calidad mejoran los resultados. Para obtener los mejores resultados, se puede obtener mini preparado de ADN recién salidos de la cultura no cubierto Escherichia coli (~ 12 horas a 37 ° C en la incubadora de agitación). Después de que todos los tampones están listas, llevar las soluciones de la campana de cultivo de tejidos y prepararse para la transfección. El uso de un vórtice a una velocidad baja, agitar la solución de transfección mientras se mezcla. Inmediatamente añadir la solución mixta a la cu neuronallture, y llevar la placa de cultivo de nuevo a la incubadora. Detener la transfección después de 45 min-1 hr, y añadir el medio de cultivo original de nuevo a la cultura para la incubación continua. Las neuronas transfectadas se pueden visualizar de 6 hr después de la transfección se termina (Figura 3). En presencia de Cmn en los medios de cultivo, PIRK se expresa y las neuronas que expresan Pirk son de color verde fluorescente debido a la proteína mCitrine fusionado al extremo C-terminal de PIRK (Figura 3D). Neuronas que expresan Pirk tienen fisiología basal normal y que son capaces de disparar los potenciales de acción en respuesta a corrientes inyectadas (Figura 4). Sin embargo, esta serie de potenciales de acción se suprime inmediatamente con un breve pulso de luz brillaba a la célula (Figura 4A). Cuando 0,5 mM BaCl 2, un inhibidor específico Kir2.1, se añade al baño, la descarga neuronal se reanuda, lo que indica que la supresión anterior se debió a la activación de Kir2.1 por el lvuelo (Figura 4B). Las neuronas de control no transfectadas no responden a la luz o Ba2 + (Figura 4 C, D).

Para expresar PIRK in vivo, plásmidos de ADN altamente puros y concentrados (2-5 mg / l) deben prepararse. Plásmidos específicos utilizados en estos experimentos se muestran en la Figura 5A. Además de la ortogonal par tRNA Leu CUA / CmnRS y el gen Kir2.1-TAG objetivo, un gen que codifica proteína fluorescente verde con una mutación TAG (GFP-TAG) es también co-electroporación como reportero fluorescente. La detección de la fluorescencia de GFP indicaría la entrega exitosa de los tres plásmidos, ya que la supresión de TAG en GFP requeriría tanto el ARNt Leu CUA y los CmnRS; CMN incorporación de GFP-TAG sugeriría CMN incorporación en Kir2.1-Tagas así, debido a que ambos genes están presentes en la misma celda. Las tres construcciones génicas son todos injected en el ventrículo lateral de embriones de ratón en E14.5 (Figura 5B, panel izquierdo). Después de la electroporación, devolver los embriones a la cavidad abdominal para permitir que los embriones para continuar el desarrollo. Dos días más tarde, se inyectan aproximadamente 2-5 l CMN-Ala (500 mM) a un lado a electroporación o ambos lados del ventrículo lateral, en la manera similar a la inyección de ADN (Figura 5B, panel central). Una vez más, devolver los embriones a la cavidad abdominal para el desarrollo continuo. Los embriones pueden ser cosechadas en E17.5 para formación de imágenes o ensayos electrofisiológicos. Como era de esperar, sólo que con la inyección de CMN-Ala, se observan células fluorescentes verdes en el neocórtex ratón. Las células con fluorescencia roja y verde tanto deberían haber incorporado en Cmn Kir2.1-TAG para hacer canales Pirk (Figura 6A). grabación de célula completa de la rebanada neocortical embrionario se realiza de manera similar como se hace en la cultura neuronal. Las neuronas fluorescentes verdes y rojas tienen ninguna corriente hacia dentro en nenegati- potencial de mantenimiento, pero un breve pulso de luz se activa rápidamente la corriente hacia el interior (Figura 6B). La corriente está completamente bloqueado por la adición de Ba2 +, lo que confirma que es generada por PIRK.

Figura 1
Figura 1: PIRK plásmido de expresión para el conjunto de neuronas cultura esquema que muestra el diseño plásmido ejemplar para la expresión PIRK en cultivo neuronal.. Top plásmido codifica el gen Kir2.1 (gris) con una única mutación en el aminoácido 169 de sitio bajo el promotor de citomegalovirus (CMV). C169 está mutado en el codón de parada TAG ámbar, donde se incorporaría la SAU Cmn. gen Kir2.1 es seguido por el gen mCitrine (verde). mCitrine se fusiona al C-terminal del gen Kir2.1 para visualizar las células que expresan Pirk. plásmido codifica parte inferior CmnRS (rosa), la sintetasa específica Cmn, impulsados ​​por la quinasa-1 promotor fosfoglicerato ratón (mPGK). ARNt > Leu CUA (azul), la ortogonal tRNA 21, también se expresa en el mismo plásmido dirigido por el promotor H1, pero en una dirección inversa.

Figura 2
Figura 2: rata del hipocampo cultivo neuronal primaria ejemplares que muestran imágenes de rata sana cultivos neuronales del hipocampo.. (A) Una imagen DIC de cultivo neuronal en 10 días in vitro (DIV). Las neuronas maduran a medida que se ramifican dendritas y axones. células de microglía (células pequeñas y redondas sin procesos) coexisten pero no abrumar a la cultura. Una imagen DIC ampliada de neuronas cultivadas sanos (B). Una neurona sana exhibe cuerpo celular rollizo (soma) y se pronuncia / dendritas axones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figura 3
Figura 3:. PIRK expresión en las neuronas primarias cultivadas DIC y las imágenes de fluorescencia de las neuronas del hipocampo de rata en cultivo in vitro y transfectadas con construcciones de genes representados en la figura 1 para la expresión PIRK. Cuando Cmn no se agrega en el cultivo después de la transfección (A y B), no fluorescencia verde se detecta a partir de las neuronas. En presencia del CMN (1 mM) en el medio de crecimiento, las neuronas transfectadas son capaces de expresar proteínas PIRK-mCitrine de larga duración, lo que muestra la fluorescencia verde (C y D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4:. Luz de la activación de PIRK suprime la cocción de las neuronas del hipocampo de rata (A) Un pulso de luz sola suprime la actividad de la neurona del hipocampo que expresan PIRK. trazas de tensión representativas se registran continuamente en la corriente-clamp. Potencial de acción disparando es evocado por 20 pA inyección de corriente (I etapa). Exposición a la luz (385 nm, 40 mW / cm 2, 1 seg; indicado con la flecha) rápida y completamente suprime la descarga neuronal. La cocción se restaura con extracelular mM BaCl2 500, que inhibe selectivamente los canales Kir2.1. (B) La radiación ultravioleta (UV) iluminación (385 nm, 40 mW / cm2, 6 s; se indica con la caja amarilla) no altera la excitabilidad de control, las neuronas no transfectadas. Potencial de acción disparando es evocado por 50 pA inyección de corriente (I etapa). (C y D) Ni iluminación UV ni BaCl2 (500 mM) afecta excitabilidad de las neuronas de control. Acción potenteial es evocado por 50 pA inyección de corriente (I etapa).

Figura 5
Figura 5: Procedimientos para la expresión PIRK en el neocórtex de ratón in vivo. Ajustado (A) PIRK plásmido de expresión. Top plásmido: el plásmido para CmnRS dirigido por el promotor CAG y mCherry a través del sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). mCherry fluorescencia sería verificar la expresión con éxito de CmnRS. Plásmido Medio: el plásmido de gen Kir2.1 junto con tres copias de ARNt Leu CUA, el ARNt ortogonal para Cmn incorporación 21. Plásmido inferior: el plásmido para GFP_Y182 TAG. El gen de la GFP está diseñado con un codón de parada ámbar en el sitio Tyr182 permisiva (GFP_Y182 TAG) para visualizar la incorporación exitosa de CMN a sitios TAG 21. (B) sho de dibujos animadosala de un procedimiento experimental para la expresión PIRK in vivo. Construcciones de genes para la expresión PIRK se inyectan en el neocortex ratón (E14.5) y a electroporación en el útero (panel izquierdo). Dos días más tarde, CMN-Ala se inyecta en el ventrículo en el lado electroporación o ambos lados de hemisferios cerebrales (panel central). Rebanada de imágenes y ensayo electrofisiológico se pueden realizar en E17.5-E18.5 (panel derecho).

Figura 6
Figura 6: Expresión PIRK en el neocórtex ratón y activación de la luz. Imágenes (A) de fluorescencia de las neuronas corticales embrionarias de ratón que muestra la incorporación de Cmn en GFP y proteínas Kir2.1 in vivo. Las tres construcciones de genes en la Figura 5A se electroporación en el útero. mCherry fluorescencia demuestra la expresión con éxito de la Synthe específica Cmngen tase, CmnRS. La fluorescencia de GFP se detectó sólo con la inyección de CMN-Ala (inferior), lo que indica la incorporación en Cmn TAG GFP y probablemente incorporación Cmn en TAG Kir2.1. Por lo tanto, la fluorescencia verde y roja indica la expresión exitosa de los tres plásmidos y la incorporación Cmn. (B) IV parcela de corrientes registradas a partir de ratones neuronas neocorticales que muestran la activación dependiente de la luz de PIRK. Dos días después de construcciones de genes en la Figura 5A se sometieron a electroporación, CMN-Ala se inyecta en el útero; 12-48 hr después de la inyección CMN-Ala, rebanadas agudas neocorticales se prepararon a partir de los embriones. Las neuronas en las rebanadas, detectadas tanto por fluorescencia roja y verde PIRK expresan, se registró antes (negro) y después (azul) exposición a la luz (385 nm, 8 mW / cm2, 10 seg para la exposición saturada). Se añade BaCl2 (500 mM) para verificar las corrientes de Pirk específico después de la fotoactivación (naranja).

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Discussion

Para lograr foto-modulación efectiva, el paso inicial importante es decidir dónde incorporar el photoresponsive SAU en la proteína diana. La información estructural y funcional de la proteína diana es muy útil para guiar la selección de los sitios candidatos. Al mismo tiempo, el propósito de la regulación de la luz sería determinar qué sitio es el más adecuado. Después de elegir los sitios candidatos, se recomienda probar los sitios en líneas celulares de mamíferos tales como el riñón embrionario humano (HEK) para el cultivo de células y la manipulación más fácil, antes de proceder a las neuronas primarias e in vivo. Para identificar un sitio para la fotoactivación Kir2.1, múltiples sitios a lo largo del poro de Kir2.1 se han probado inicialmente en células HEK. C169 de Kir2.1 se encontró óptima, debido a que el tamaño de poro Kir2.1 donde reside C169 es lo suficientemente grande como para dar cabida a las cadenas laterales Cmn pero lo suficientemente pequeño para las cadenas laterales CMN a bloquear el paso iónico. Cuando Cmn se incorporó al C169 en Kir2.1 expresado en células HEK, tque el consiguiente deterioro de mutante Kir2.1 estuvo inactivo pero se convirtió en activa cuando se produce un corto pule de la luz, lo que confirma el éxito del desarrollo PIRK 21.

La expresión eficiente de la ortogonal tRNA sintetasa y es crítica para obtener una alta eficacia de incorporación SAU en células e in vivo. El gen de la sintetasa ortogonal se expresa de manera eficiente el uso de promotor de la polimerasa II y las señales de poli-A menudo se utiliza en células de mamíferos y las neuronas. Para la expresión de la tRNA ortogonal, una polimerasa III promotor especial de tipo 3, tales como el promotor H1 se utiliza aquí, junto con una secuencia flanqueante 3 'son necesarios como se describe previamente 18,20. Para los estudios in vivo, se encontró que tres copias de la casete de expresión de tRNA aumentaron eficacia de incorporación Cmn en comparación con una copia (Figura 5A). En otro estudio en células de mamíferos, lo que aumenta el número de casete de expresión de tRNA también aumentó Uaa eficacia de incorporación 30. Therntes, sugerimos optimizar el número de ARNt casetes de expresión para diferentes Uaas, células y proteínas diana cuando la eficiencia de incorporación Uaa necesita mejoras. La biodisponibilidad de Uaas en células e in vivo es otro factor crítico para Uaa incorporación. Estudios anteriores han demostrado que la esterificación de Uaas incrementa su captación en células de mamíferos 31, y que la preparación de Uaas en forma dipéptido aumenta la captación Uaa en células en Caenorhabditis elegans 32. Se encontró que la alimentación directa CMN a los medios de cultivo neuronal es suficiente para Cmn incorporación en Kir2.1 expresa en neuronas primarias cultivadas, pero inadecuado para su incorporación en el cerebro de ratón in vivo 21. Por lo tanto, el dipéptido CMN-Ala se sintetizó y se inyecta en el cerebro del ratón. PEPT2 oligopéptido transportador es altamente expresado en cerebros de roedores 33, que pueden facilitar el transporte del dipéptido en neuronas. El dipe interiorizadoptide se hidroliza por peptidasas celulares para producir la SAU Cmn para su incorporación. De hecho, con esta optimización logramos eficiente incorporación Cmn en proteínas neuronales en múltiples regiones del cerebro de ratón embrionario, incluyendo la neocorteza, el tálamo y el hipotálamo 21.

expresión PIRK éxito en las neuronas depende fuertemente de la preparación de cultivo neuronal sano. Cada paso en el protocolo debe ser realizada de una manera precisa y meticulosa. Después de preparar el cultivo, lo mejor es mantener la cultura en la incubadora sin perturbación. Abrir y cerrar la puerta de la incubadora, así como mover la placa de cultivo dentro y fuera de la incubadora, puede sumar a socavar la calidad de la cultura. Baja temperatura de la incubadora (35 ° C en lugar de 37 ° C) ayuda a reducir la excitotoxicidad. En una nota similar, Ca-P transfección se debe hacer con mucho cuidado. Preparación del tampón 2x ​​BBS es un paso crítico. Es una buena idea a Calibrate el pH óptimo para tampón 2x ​​BBS entre pH 6,90 a 7,15, ya que los nuevos constructos de ADN o preparaciones podrían cambiar las condiciones de transfección. El pH del tampón podría ser ajustado con precisión a las 0.01 dígitos si ayuda a lograr resultados consistentes. Antes de la transfección, el medio de crecimiento de cultivo neuronal se reemplaza con uno nuevo. Es crucial para salvar el medio de cultivo original y volver a agregar a la cultura después de la transfección para restaurar el estado original. El mantenimiento de la cultura de las neuronas en medio fresco después de la transfección interferiría con las neuronas de la recuperación, ya que carece de moléculas clave para la proliferación celular tales como factores de crecimiento liberados de las neuronas.

Para la activación de la luz PIRK en células cultivadas y secciones de tejido, fuente de luz adecuada y método de entrega que ser determinada. CMN absorbe luz UV de onda larga y media (280-400 nm). Sin embargo, la exposición prolongada a la luz UV, especialmente a la luz más corta longitud de onda UV, sería perjudicial para las células. Al samel tiempo de correo, la luz roja lejana podría calentar la muestra perturban las células. Por lo tanto, un LED con una emisión de longitud de onda única que es mejor para la activación PIRK. CMN fotolisis, un LED con la emisión de 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) fue seleccionado. El LED se instala externamente cerca del microscopio, y una fibra óptica se utiliza para suministrar luz, precisamente, a la neurona en el enfoque. Para la adquisición de datos reproducible, la fibra óptica está configurado a 1 cm de distancia en un ángulo de la neurona en el foco 45 °. Potencia de la luz en la muestra se midió 40 mW / cm2. También se recomienda comprobar periódicamente el rendimiento del LED usando un medidor de potencia óptica.

Se demuestra que la electroporación en el útero es una técnica eficaz para incorporar genéticamente Uaas in vivo. En útero de la electroporación de ADN de plásmido en el neocortex de embriones de ratón se realizó como se describió anteriormente 34, con modificaciones menores. Para expresar las proteínas Pirk en neonatal cerebros de ratón, dos procedimientos quirúrgicos son necesarios (Figura 5B). El primer paso es inyectar construcciones génicas para la expresión PIRK seguido de electroporación. Dos días más tarde, la segunda inyección del cerebro se realiza para entregar CMN-Ala. Se requeriría la práctica para realizar cirugías con soltura sin hacer hincapié en los animales demasiado. Después de cada cirugía, los animales deben ser atendidos, y se comprueban de forma regular a lo largo de la recuperación. disponibilidad suficiente y oportuna CMN en el cerebro es esencial para la expresión PIRK adecuada. 2-5 l de CMN-Ala (500 mM) se inyecta típicamente a un cerebro embrionario. A veces, es útil para inyectar CMN-Ala en el ventrículo tanto en la electroporación y el hemisferio opuesto, desde CMN-Ala desde el lado opuesto se difundiría a un lado a electroporación para el suministro prolongado Cmn. Teniendo en cuenta la utilidad general de electroporación en el útero, esta técnica podría ser aplicada no sólo a las neuronas neocorticales, sino también a las neuronasen otras regiones del cerebro tales como el cuerpo estriado, diencéfalo, y el cerebelo, cuando sitio / inyección electroporación se ajusta para cada región. cerebros de embriones / neonatales son mucho más suaves que los cerebros adultos, por lo que sería difícil conseguir rebanadas agudas para experimentos de electrofisiología. incrustación de agarosa ayuda a estabilizar la estructura del cerebro embrionario de vibratome corte. A pesar de agarosa de bajo punto de fusión minimiza el choque de temperatura de los tejidos del cerebro, es necesario tener precaución cuando se vierte agarosa derretida sobre cerebros fríos. El efecto de choque de temperatura en el tejido de la incrustación de agarosa fue imperceptible durante toda la grabación celular.

Genéticamente que codifica photoresponsive Uaas en neuronas cultivadas e in vivo, ejemplificada por PIRK aquí, brindará una técnica optogenética para controlar diversas actividades de proteínas neuronales con la luz en su ambiente nativo. El protocolo actual presenta un procedimiento paso a paso para llevar a cabo la expresión y activación PIRK experimentos in cultivo neuronal in vitro e in vivo en cerebros de roedores, lo que representa el primer éxito en el desarrollo del sistema Uaa para su uso en los cerebros de mamíferos. Tiene potencial para beneficiar a la investigación de muchas proteínas naturales, así como su implicación en enfermedades. Por ejemplo, los receptores de 5-metil-4-isoxazolpropiónico α-amino-3-hidroxi de ácido (AMPA) y los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) comparten estructuras transmembrana similares con canales Kir2.1. Por tanto, sería factible aplicar la metodología PIRK a estos canales iónicos activados por ligando. Por otra parte, la técnica PIRK también podría ser utilizado para tratar la fisiopatología de las enfermedades genéticas relacionadas Kir2.1, tales como el síndrome de Andersen y síndrome cardíaco QT corto 35,36. Además de "bloque y liberación" Cys vía Cmn, múltiples aminoácidos tales como tirosina, serina, lisina, glutamato, aspartato, y glicina han sido enjaulado con diferentes grupos photoreleasable 37. Por lo tanto, las estrategias similares pueden ser usod para foto-regular estos aminoácidos en las neuronas in vitro e in vivo. Además, el control óptico reversible se puede lograr con azobenceno que contiene Uaas, y tales Uaas ahora han sido genéticamente codificado en E. coli y células de mamíferos 38,39.

En resumen, este protocolo presenta un método general para controlar la actividad de las proteínas neuronales en sus configuraciones nativas con la luz. En comparación con otros métodos que implican optogenética opsina-familia y otra luz proteínas sensibles o dominios, este método usa genéticamente codificada Uaas sensible a la luz y los cambios sólo un único residuo. Por lo tanto, debe tener una mínima interferencia a la función, el tráfico y la localización de la proteína diana en estudio. Alta selectividad sitio también se puede lograr con estos Uaas sensible a la luz codificados genéticamente para proporcionar una mayor flexibilidad y especificidad para la investigación molecular detallada. Este protocolo también proporciona la primera comprehensive, fácil de seguir el procedimiento de cómo incorporar con éxito Uaas en proteínas en las neuronas in vitro e in vivo. Control óptico de proteínas generales por Uaas codificada genéticamente en las neuronas in vitro e in vivo tiene un gran potencial para beneficiar a la ciencia básica y traslacional, y de este protocolo ayudará a promover su aplicación.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

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References

  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

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Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

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