Introduction
従来の電気刺激に比べて、光刺激は、検体の生理学的システムへの干渉が最小と大きな時間的、空間分解能を提供しています。 1971年1でニューロンを刺激するためにレーザーを使用してのデモンストレーション以来、多くの創造的な方法は、外因的に光で神経活動を制御するために発明されています。フォトケージアゴニストの光学リリースが長いリガンド2,3,4への神経回路網の生理学的応答を研究するために使用されています。この技術は、ケージドアゴニストの拡散に起因する特異性が限られています。遺伝子特異性は、異所的に発現している感光性オプシンチャネルによって達成さ5,6,7ポンプ 、正常に多様なモデル生物における選択された神経回路網を調節するために適用されているされています。しかし、他のタンパク質へのオプシンタンパク質からの光応答をグラフトするため、光学的に、様々な他のニューロンタンパク質を制御するためにこの方法を適用することは困難であろうwoul検討中のタンパク質の天然の特性を変更することができる強烈なエンジニアリングを必要とdは。化学的にタンパク質の外因性の感光性リガンドがチャネルタンパク質8,9,10の機能を制御する別の方法を示した係留。リガンドが提示またはアゾベンゼン部分の光異性化を介してタンパク質の結合部位から引き抜かれます。テザリング化学は、細胞内側面と細胞内タンパク質を除き、主に膜タンパク質の細胞外側への適用を制限します。
光応答Uaasは、タンパク質に組み込まれた後、光を有するタンパク質を操作するための一般的な戦略を提供します。初期の努力では、化学的にフォトケージUaasでアシル化したtRNAは、その構造と機能の関係12,13,14の理解を進めてきた膜受容体およびイオンチャネル11へUaasを組み込むためにアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションしました。このマイクロインジェクション法は、主に大規模な卵母細胞に限定されています。 UAAの遺伝的取り込みは、生細胞15,16,17,18における内因性タンパク質の翻訳を介してUAAを組み込んだ直交tRNA /シンテターゼ対を使用して技術的に困難のtRNAアシル化およびマイクロインジェクションをバイパスします。神経タンパク質へUAAの取り込みは、一次ニューロンおよび神経幹細胞19,20に実証されています。最近では、光応答UAAは、遺伝的に初めて21 in vivoでの哺乳類の脳内の神経タンパク質に組み込まれています。これらの進歩は、それらの天然の細胞環境にUaasと神経細胞のタンパク質を研究することを可能にします。
内向き整流カリウムチャネルKir2.1は、細胞の外よりにより容易にK +電流を通過させる強力な整流器であり、細胞の興奮性、血管緊張、心拍数、再を含む生理学的プロセスを調節するのに不可欠です最終塩の流れとインスリン放出22。 Kir2.1の過剰発現は少なく、興奮23,24となるターゲットニューロンの膜電位を高分極します。カンら 、そのネイティブの細胞におけるKir2.1光学的に制御する。Kir2.1への遺伝的に組み込まれた光応答性UAAは、哺乳動物細胞、神経細胞および胚性マウス脳21で表しました。光の短いパルスは、このようにターゲットKir2.1タンパク質を活性化する、天然アミノ酸のCysにUAAを変換することができました。この写真誘導性内向き整流カリウム（PIRK）チャネルタンパク質は、ラット海馬初代神経細胞で発現させた場合には、光活性化に応答してニューロンの発火を抑制しました。また、PIRKチャネルは、胚性マウス新皮質で発現させ、皮質ニューロンにおける光活性PIRK電流を測定しました。哺乳類の脳におけるインビボでのUAA技術の実装を成功させるには、光学的にニューロンタンパク質を制御するための扉を開きます彼らのネイティブ環境で、分子レベルでの神経細胞のプロセスとメカニズムの光学解剖を可能になります。
このプロトコルでは、文化およびin vivoでのマウス胎児の脳内の主要なニューロンへUaasの遺伝子組み込みのための手順について説明します。光応答UAA CMNとKir2.1処理を説明するために使用されます。成功UAA取り込みおよび神経タンパク質活性の光制御を評価するための方法が提供されます。このプロトコルは、遺伝的に神経細胞およびin vivoで Uaasをコードする、および光学的に光応答UAAを介した神経タンパク質の機能を調節するために明確なガイドを提供します。私たちは、このプロトコルは、神経科学と光遺伝学、生物学的研究のためのin vivoでの UAA技術の採用を促進することを期待しています。
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Protocol
現在の研究のすべての手順は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）を用いて実施したソーク研究所、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州で動物取扱プロトコルを承認
1. UAA Kir2.1で設立し、初代神経細胞培養における結果として生じるPIRKの発現
- DNA構築
- UAAの取り込みのためのKir2.1の標的部位を選択します。光応答UAA組み込まれたと選択されたサイトはKir2.1機能21の光変調を可能にするように、Kir2.1の構造と機能についての事前の知識や情報を活用します。
- TAGアンバー終止コドンに変異選ばれたサイトとの組換えDNAをコードするKir2.1遺伝子を構築します。哺乳動物発現プラスミドにKir2.1-TAGのDNAをクローニングするために、標準的なクローニング技術25を使用してください。
- UAAに特異的であり、に応じて、UAAを組み込むクローンのtRNA /合成酵素遺伝子別の哺乳動物発現プラスミド21にTAG終止コドン。
注：最適なUAAを組み込むための、（のtRNA、シンテターゼ、およびKir2.1のために）別のプロモーターおよび遺伝子カセットの組み合わせが異なるプラスミドで試験することができます。 - 製造業者のプロトコルに従ってミニプレップまたはマキシプレップ市販のキットを用いて高品質のプラスミドDNAを得ます。 260/280比の1.9の周りに精製されたDNAに最適です。必要な場合、プレップDNA 25の純度を確認するためにアガロースゲル電気泳動を行います。高純度のスーパーコイルプラスミドDNAは、神経細胞のトランスフェクションに最適です。
- 文化ラット海馬一次ニューロン
- 場所のカバーガラス24ウェルプレート中（円、直径12ミリメートル）、各ウェルに1カバーガラス、およびコート各ウェルに0.5mg / mlのポリ-D-リジン（100mMのホウ酸緩衝液中の250μlの持つ：1.24グラムのホウ酸および脱イオン蒸留H 2 OまたはのddH 2の400ミリリットル中1.90グラムの四ホウ酸ナトリウム
- 解剖の日に、イソフルランでそれらを麻酔し、decapitating後に出生後の仔ラット（1-4生後日）から新生児の脳を収集します。イソフルラン（2-4％）を含む麻酔室に子犬を麻酔。彼らは意識を失い、触覚刺激にし、足のピンチに応答しないまで待ってください。
- 標準的な技術26を使用して、（〜37℃）生理食塩水（10mMのHEPESおよびハンクス液で追加した20mMのD-グルコース）暖かいに脳から海馬を解剖し、4.5ミリリットル温かい生理食塩水でコニカルチューブに海馬を集めます。
- 海馬（0.25％最終トリプシン濃度）を2.5％トリプシンの500μlを添加し、37℃の水浴中で10分間インキュベートします。
- 徹底的に生理食塩水（3×10ml）および粉砕物を用いて組織をすすぎます。
- 1ミリリットルワットで解離ニューロンを回復5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した最小必須培地（MEM）を含有するアーム増殖培地、21.2 mMのD-グルコース、2mMのL-グルタミン、2％B-27、および0.1％血清エクステンダー。
注：新鮮な増殖培地を準備するために解剖の日にL-グルタミンおよびB-27を追加します。 - 血球計数器を持つニューロンをカウントし、40μmのナイロンメッシュを通して濾過した後、500μlの増殖培地で1.0〜1.5×10 5細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートにカバーガラス上にそれらをプレート。
- 2-3週間95％空気加湿インキュベーター：5％CO 2中35℃での神経培養をインキュベートします。最良の結果については、インキュベーション中に可能な限りの文化を乱しません。
- 初代神経培養のリン酸カルシウム（CA-P）トランスフェクション
- 4℃でストック溶液とストアを行います。0.5 M BES（N、N -ビス[2-ヒドロキシエチル] -2-アミノエタンスルホン酸）緩衝液（10倍）。 150mMののNa 2 HPO 4（100倍）。 2.8 MのNaCl（10X）;無菌のddH 2 O;滅菌1NのNaOH。
- トランスフェクションの日に、0.22μmのフィルターでのddH 2 Oで新鮮2.5 MのCaCl 2溶液および滅菌フィルターを作ります。 0.22μmのフィルターを用いてpHを7.00（NaOHでpHを調整）し、滅菌フィルターの50mMのBES、1.5mMののNa 2 HPO 4、および280 mMのNaClを含有する新鮮な2×BES緩衝生理食塩水（BBS）のバッファを作成します。
注：トランスフェクトするのCaCl 2溶液とカバースリップの数に応じてBBSバッファの量を計算します。また、1.3.4を見てください。 - 500μlの新鮮な予熱したトランスフェクションの増殖培地で培養増殖培地を交換してください。 （トランスフェクション培地はMEMプラス21.2 mMのD-グルコースを用いて作製することができます）。
注意：古いメディアを廃棄しないでください。 - ddH 2 Oの量を計算し、1.65μlののCaCl 2、0.7μgのDNAを含有するトランスフェクション溶液（各カバースリップあたり33μl）を作るために追加するための準備、および16.5＆＃181;リットルの2×BBS。
- 文化に追加する前に、すぐにトランスフェクション溶液を準備します。ゆっくりチューブを攪拌しながら準備するには、最初のCaCl 2とのddH 2 Oを兼ね備えています。攪拌を続行し、ゆっくりと溶液中にDNAを追加します。攪拌しながら最後に、2×BBS緩衝滴下を追加します。
- すぐに神経培養の各カバースリップにトランスフェクション溶液の30μlを添加します。
- 45分〜1時間の95％空気の加湿インキュベーター：溶液を混合し、5％CO 2中35℃でインキュベートし、培養皿を数回揺すります。ニューロンは、トランスフェクション溶液と共にインキュベートした後、非常に細かいのCa-P析出物は、ニューロンを覆う層を形成します。
- 500μlの予熱した洗浄緩衝液（135mMのNaClを、20mMのHEPES、4のKCl、2mMのCaCl 2を、1mMのMgCl 2、1 mMののNa 2 HPO 4、pHが7.3で10 mMグルコース、無菌でトランスフェクション培地を交換してください0.22μmのフィルターで濾過）し、35でインキュベート6; 5％CO 2でC：15-20分間、95％空気の加湿インキュベーター。 Ca-Pの析出物は、洗浄工程の後に消えてしまいます。
- 500μlの新鮮な増殖培地で洗浄緩衝液を交換してください。ここでも、保存された元のメディアに成長培地を交換してください。
- 1 mMの最終濃度に達するように培養し（50μlの暖かい増殖培地中でプレミックス）UAA CMNを追加します。
- アッセイの前に12から48時間、インキュベーターを加湿95％空気：5％CO 2中35℃でトランスフェクトされた培養物をインキュベートします。
- 光活性化と細胞全体の録音
- 余分な/細胞内の溶液を調製します。細胞内液は、135mMのグルコン酸カリウム、10mMのNaClを、2のMgCl 2、10mMのHEPES、1mMのEGTA、2.56 mMのK 2 ATP、およびpH7.4の0.3mMのリチウム2 GTPが含まれています。細胞外記録溶液は、150mMのNaCl、3mMの塩化カリウムを含有する5mMのMgCl 2、0.5mMのCaCl 2を、5mMグルコース、およびpH7.4の10mMのHEPES。
- 45°の角度で1センチメートルawayから焦点に光を提供するためにリグの顕微鏡により385 nmでの発光の発光ダイオード（LED）をインストールします。光パワーメータとLEDの電源を確認してください。
- 3-6MΩピペット耐性を持つように商業マイクロピペットプラーを用いてガラス電極からパッチピペットを引き出します。マイクロピペットプラーを設定するには、製造元の指示に従ってください。
- ピペット抵抗をテストするには、最初に細胞内溶液でピペットを記入し、電極ホルダ上に配置します。顕微鏡P上に配置された細胞外溶液を充填した35mmの培養皿にピペットを浸しlatform。回路を完成するために皿に接地電極を浸し。
- アンプ/デジタイザをオンにして、データ収集ソフトを起動します。膜の試験プロトコルを用いてピペットの抵抗を監視します。
- インキュベーターからニューロン文化のカバースリップを取り出し、細胞外液中に一回すすぎます。真空グリースを使用して、新鮮な細胞外液で満たされた35mm培養皿の中央にカバースリップを押したままにします。
- 電気生理学顕微鏡プラットフォーム上のカバーガラス/皿を置きます。
- 標準パッチクランプ技術を用いて、mCitrine蛍光27でニューロンにパッチを適用。電流クランプ（I-クランプ）メソッドを使用して録音神経活動。まず、小電流を注入することによって周り-72 mVでの静止電位を調整します。その後、活動電位の連続発射（5-15 Hz）を誘導するためにステップ電流（10-200 PA）を注入します。
- 手動で、またはデータ収集ソフトウェアを使用して、パルスフラッシュ（罪GLE記録中のニューロンへのLEDライトの100ミリ秒-1秒の持続時間）のパルス、および活動電位が影響を受けるかどうかを確認します。
- 浴に0.5 mMののBaCl 2を追加し、活動電位が回復しているかどうかを確認します。
2. Kir2.1でUAA定款およびin vivoでのマウス胚の脳内の結果として生じるPIRKの発現
- DNA構築
- ステップ1.1と同様にプラスミドDNAを設計します。 in vivoでの発現のために、このようなCAG（CMVエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーター）などの強力なプロモーターを使用しています。
- 製造業者のプロトコルに従って、エンドトキシンフリーマキシプレップ市販のキットを用いてDNAを精製します。 （2-5μgの/μlに凝縮）極めて高品質のDNAを取得するためにエタノール沈殿25に続くフェノール-クロロホルム抽出を行います。
- マウス胚新皮質への子宮内エレクトロポレーションで
注：基本的なテクニック子宮内エレクトロポレーションのためのqueのは、以前28に記載されています。- ペントバルビタールナトリウム（腹腔内注射、グラム体重あたり50μgの）またはイソフルラン（吸入、2から4パーセント）と胎生14.5（E14.5）で時限妊娠マウスを麻酔。意識の喪失および触覚刺激に応答なしをチェックすることにより、そして足のピンチに麻酔深度を監視します。
- 腹部正中線に小さな切開を行います。静かに鉗子や指先で子宮角を露出させます。
- 子宮壁を通して挿入されたガラスピペットを用いて各同腹の側脳室へ（コンストラクトに応じて、各プラスミドの2-5μgの/μL、）約1μlのDNA溶液を注入します。ほとんどの場合、総胚の約60〜80％が注入されます。
- エレクトロ（33-35 V、50ミリ秒の持続時間、950ミリ秒間隔、4-8パルス）で胚をエレクトロポ。
- 以下のために静かに腹腔に子宮角を返します。CEPSと指先。筋肉壁を縫合した後、胚は開発を継続することを可能にする手術用縫合糸で皮膚。
- UAAマイクロインジェクション
- E16.5で再び腹部正中線に小さな切開を行い、そして静かに鉗子や指先で子宮角を露出させます。
- エレクトロ側又は子宮壁を通して挿入ガラスピペットで側脳室の両側に約2~5μlのCMN-ALA（500ミリモル）を注入します。 CMNの生物学的利用能を高めるために、 生体内 21 に CMNを提供するためにジペプチドCMN-ALA（CMN-アラニン）を使用します。
- ここでも、ピンセットと指先で軽く腹腔に子宮角を返します。筋肉壁を縫合した後、胚は開発を継続することを可能にする手術用縫合糸で皮膚。
- 急性脳スライスを取得
- 119のNaCl、2.5mMのKClを、1.3のMgCl 2、2.5 mMの塩化カルシウムを含む1 L人工脳脊髄液（ACSF）を作ります
- 20〜30分間、-80℃で200ミリリットルのACSFと高速凍結してください。室温で95％O 2ガス：CO 2 5％とバブルACSFの残りの部分を。
- 胚からの脳を採取する手術ツールを準備し、滅菌します。また、氷のバケツを用意。
- 電子レンジで加熱することによりフラスコ中〜100ミリリットル4％低融点アガロース溶液を作ります。それが固化し始める前に、約5分間のソリューションをクールダウン。
- CO 2過剰投与によりCMN-Alaの注射後のマウス12-24時間を安楽死させます。腹部に大きな切開を行い、微細なハサミやピンセットで子宮からのエレクトロポレーション/マイクロインジェクション胚を解剖します。
- 細かいハサミやピンセットで胚からの収穫の脳。
- アイスバケットに配置された10cmの培養皿上で各脳を置きます。鋭い刃を使用して2つの半球を分割し、それぞれを配置皿の底に触れる正中矢状面と皿の上半球。迅速（半球あたり500μlの周りの）脳の上にアガロース溶液を注ぎます。
- 鋭い刃を使用して、正方形の脳に埋め込まれたアガロースブロックを作るために、脳の周りにアガロースを切りました。
- 組織接着剤を使用して、ビブラトームのマウント上のアガロースブロックの正中矢状平面ダウン接着剤。予め冷却ACSFでビブラトーム室を記入し、200μmの矢状脳スライスをカット。
- 95％O 2ガス：5％CO 2でバブリングしながら42分間33℃で3mmのミオの -イノシトール、0.4mMのアスコルビン酸、および2mMのピルビン酸ナトリウムを補充したACSF中の急性切片をインキュベートします。
- 42分後、ヒーターをオフにして泡立てながら室温でスライスをインキュベートし続けます。ヒーターをオフにした後、全細胞パッチ記録を少なくとも15分を開始します。
- 119のNaCl、2.5mMのKClを、1.3のMgCl 2、2.5 mMの塩化カルシウムを含む1 L人工脳脊髄液（ACSF）を作ります
- 光活性化と細胞全体の録音
- INTRACを準備130ミリモルのグルコン酸カリウム、4のMgCl 2、5mMのHEPES、1.1 mMのEGTA、3.4 mMののNa 2 ATP、10mMのナトリウムクレアチンリン酸、およびKOHでpH調整7.3で0.1mMののNa 3 GTPを含むellularソリューション。
- 3-6MΩピペット耐性を持つように商業マイクロピペットプラーを用いてガラス電極からパッチピペットを引き出します。
- 全細胞パッチクランプ用のスライス電気生理学リグを設定し、2ミリリットル/灌流ポンプと分の速度でACSFで記録チャンバーを表面かん流します。周りに33°Cにチャンバ温度を調整します。
注意：スライスの電気生理学リグは、灌流チャンバー、水浸対物レンズ及び温度コントローラを備えています。また、GFPフィルター（励起：30分の480 nmの発光：40分の535 nm）をmCherryをフィルター（励起：20分の580 nmの発光：130分の675 nm）が必要です。- 45℃で1センチメートルawayから焦点に光を提供するためにリグで顕微鏡で385nmでの発光のLEDインストール角度。光パワーメータとLEDの電源を確認してください。
- 慎重に灌流チャンバー内のガラスピペットと場所で脳スライスを拾います。ハープとのスライスを押したままにします。
- 新皮質領域27からmCherryを/ GFPの蛍光を有するニューロンにパッチを適用します。電圧クランプ（V-クランプ）メソッドを使用してレコードPIRK活動。まず、-60 mVので膜電位を保持します。次に、固定された負の膜電位（-100 mVの）または電圧ランプでの記録電流（+ 40mVまでには-100mV）。具体的には、-100mVのでKir2.1特定の内向き電流を監視します。
- 手動、またはデータ収集ソフトウェアを使用して、記録しながらニューロンにLED光のパルス（100ミリ秒-1秒の持続時間の単一パルス）を点滅し、PIRKタンパク質が活性化されるかどうかを確認します。 PIRKが起動されると、-100 mVので内向き電流が大幅に増加するであろう。
- 浴に0.5 mMののBaCl 2を追加し、PIRKが再び不活性化されるかどうかを確認します。
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Representative Results
遺伝的に神経細胞におけるタンパク質にUAAを組み込むために、最初の重要なステップは、適切な遺伝子を提供し、神経細胞に効率的に遺伝子を発現するために構築設計することです。 UAAの取り込みのための3つの遺伝子コンポーネントがある：（1）UAA取り込み（2）変異したTAG停止コドンを認識する直交tRNA、及び（3）直交アミノアシルために選択された部位に導入されたTAGアンバー終止コドンを有する標的遺伝子-tRNAシンテターゼは直交tRNAにUAAを充電します。各コンポーネントは、適切なプロモーターによって駆動される必要があります。これら三つの遺伝子カセットは、1つのプラスミドに含まれる、またはいくつかのプラスミドに分離することができます。ニューロンにおけるPIRKを表現するために、光反応性UAA CMNは直交tRNA Leuの CUA / CmnRS（CMN-tRNA合成酵素）CMN 21,29のために特異的であるように進化したペアを使用して、Kir2.1に組み込まれています。 Kir2.1遺伝子の残基Cys169は、TAGアンバー終止コドン（Kir2に変異しています。1-TAG）、及びmCitrineがニューロン培養におけるPIRK発現を可視化するKir2.1のC末端に融合された蛍光タンパク質（ 図1）。
良質な神経培養を得ることに成功しPIRK実験のための前提条件です。生後1-4スプラーグドーリーラットの仔は、一般に、ニューロン培養物を調製するために使用される、まだラット胚も頻繁に使用されます。 1.0から1.5×10 5細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートにカバースリップ上に播種すると、1はあまりないミクログリアまたは他の破片（ 図2A）で十分に分離健康なニューロンが表示されるはずです。健康なニューロンは、広範囲のプロセスを有しており、細胞体（体細胞）（ 図2B）ふっくらしています。はっきり見えるsuborganelle構造は、通常、不健康な文化のサインです。 95％空気の加湿インキュベーター：ニューロン培養物を、5％CO 2中で35℃で2〜3週間維持することができます。
C言語alciumリン酸（CA-P）トランスフェクションは、敏感な神経細胞培養のための適切な非常に穏やかなトランスフェクション法です。しかし、それはニューロンにおける高いトランスフェクション効率を達成するために、極端な精度と注意が必要です。ストック溶液は4℃で保存し、そしてトランスフェクションの日に、2×BBS緩衝液を作るために混合される必要があります。正確なpH調整が再現可能に成功した結果を得るための鍵です。 2.5 MのCaCl 2溶液はまた、トランスフェクションの日に新しく作られるべきです。全ての緩衝液をろ過する必要があります。また、高純度と品質の新鮮なDNAプラスミドは、結果を改善します。最良の結果を得るために、1は、新鮮なDNAミニプレップ生い茂っていない大腸菌培養（振盪インキュベーター中で37℃で〜12時間）からを取得することができます。すべてのバッファの準備ができた後、組織培養フードにソリューションを提供し、トランスフェクションのために準備します。混合しながら低速でボルテックスを用いて、トランスフェクション溶液を攪拌。すぐに神経細胞のcuに混合溶液を追加lture、バックインキュベーターに培養皿を持って来ます。 45分〜1時間後、トランスフェクションを停止し、継続的なインキュベーションのための培養に元の増殖培地を追加します。トランスフェクションは、（ 図3）が終了した後、トランスフェクトされたニューロンは、6時間で可視化することができます。培地中のCMNの存在下では、PIRKが発現され、PIRK発現ニューロン起因PIRK（ 図3D）のC末端に融合mCitrineタンパク質と緑色蛍光です。 PIRK発現ニューロンは、正常な基礎生理を有し、それらは、注入電流（ 図4）に応答して活動電位を発射することが可能です。しかし、活動電位のこのシリーズは、セル（ 図4A）に輝いた短い光パルスですぐに抑制されています。 0.5ミリモルのBaCl 2、Kir2.1特異的阻害剤は、浴に添加されると、ニューロン発火は、前の抑制がLでKir2.1の活性化によるものであったことを示し、再開されますIGHT（ 図4B）。トランスフェクトしていないコントロールニューロンは、光又はBa 2+（ 図4C、D）に応答しません。
生体内で PIRKを発現させるために、高純度、濃縮DNAプラスミド（2-5μgの/μl）を準備する必要があります。これらの実験で使用される特定のプラスミドは、 図5Aに示されています。直交tRNA Leuの CUA / CmnRS対と標的Kir2.1-TAG遺伝子に加えて、TAG突然変異（GFP-TAG）と緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、蛍光レポーターとして共電気穿孔です。 GFPのタグ抑制はtRNAのレイ CUAとCmnRSの両方を必要とするため、GFP蛍光の検出は、すべての3つのプラスミドの配信成功を示すであろう。両方の遺伝子が同じ細胞中に存在しているため、GFP-TAGでCMNの取り込みは、よくKir2.1-TAGasでCMNの取り込みを示唆しています。 3遺伝子構築物はすべて麟蹄ありますE14.5（ 図5B、左パネル）上のマウス胚の側脳室にCTED。エレクトロポレーション後、胚は開発を継続できるようにするために腹腔に胚を戻します。二日後、DNA注入（ 図5B、中央のパネル）と同様にして、エレクトロ側または側脳室の両側に約2~5μlのCMN-ALA（500ミリモル）を注入します。この場合も、継続的な開発のための腹腔に胚を戻します。胚は、イメージングまたは電気生理学的アッセイのためにE17.5に収穫することができます。予想されるように、唯一のCMN-ALAの注射で、緑色蛍光細胞は、マウス新皮質において観察されます。赤と緑の両方の蛍光を有する細胞は、CMNはPIRKチャンネル（ 図6A）を作るためにKir2.1-TAGに組み込まれている必要があります。それは神経培養に行われているように、胚性新皮質スライスからホールセル記録も同様に行われます。緑と赤の蛍光ニューロンがneでない内向き電流を持っていません保持電位gativeが、光の短いパルスは、急速に内向き電流（ 図6B）を活性化します 。電流は完全にはPIRKによって生成されたことを確認、のBa 2+を添加することによりブロックされます。
図1：神経細胞培養に設定PIRK発現プラスミドスキームは、神経細胞培養中のPIRK発現のための例示的なプラスミドの設計を示 します。トッププラスミドは、サイトメガロウイルス下C169部位における単一アミノ酸変異（CMV）プロモーターでKir2.1遺伝子（灰色）をコードします。 C169は、UAA CMNが組み込まれることになるTAGアンバー終止コドンに変異しています。 Kir2.1遺伝子mCitrine遺伝子（緑色）が続きます。 mCitrineはPIRK発現細胞を可視化するKir2.1遺伝子のC末端に融合されます。ボトムプラスミドは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ-1（mPGK）プロモーターによって駆動されるCmnRS（ピンク）、CMN特定の合成酵素をコードします。 tRNA
図2：ラット海馬初代神経培養健康なラット海馬ニューロン培養物を示す代表的な写真。 （A）in vitroで 10日に神経培養のDIC画像（DIV）。彼らは樹状突起と軸索を分岐としてのニューロンが成熟します。ミクログリア細胞（プロセスなしの小さな丸い細胞）が共存するが、文化を圧倒していません。 （B）健康培養神経細胞の拡大DICイメージ。健康的なニューロンはふっくら細胞体（ソーマ）を示すと樹状突起/軸索と発音。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：初代培養神経細胞におけるPIRK式 DICおよびin vitroで培養し、PIRKの発現のために、図1に示された遺伝子構築物をトランスフェクトしたラット海馬ニューロンの蛍光画像。 CMNは、トランスフェクション（A及びB）の後に培養中に添加されていない場合には、何の緑色蛍光は神経細胞から検出されません。増殖培地中CMN（1ミリモル）の存在下で、トランスフェクトされたニューロンは、このように緑色蛍光（CとD）を示す、完全長PIRK-mCitrineタンパク質を発現することが可能である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4：PIRKの光活性化がラット海馬ニューロンからの発火抑制 （A）単一の光パルスは、PIRKを表現する海馬ニューロンの活性を抑制する。代表的な電圧トレースは、電流クランプに連続的に記録されています。活動電位発火は20 pAの電流注入（I-ステップ）によって誘発されます。露光（385nmで、40ミリワット/ cm 2で、1秒、矢印で示す）は、迅速かつ完全にニューロンの発火を抑制することができます。焼成は、選択的にKir2.1チャンネルを阻害し、細胞外の500mMのBaCl 2、で復元されています。 （B）紫外線（UV）照射（385nmで、40ミリワット/ cm 2で、6秒、黄色のボックスで示されている）は、制御、トランスフェクトしていない神経細胞の興奮性を変化させません。活動電位発火は50 pAの電流注入（I-ステップ）によって誘発されます。 （CおよびD）のいずれもUV照射ものBaCl 2（500 mM）を制御ニューロンの興奮性に影響を与えます。強力なアクションIALは50 pAの電流注入（I-ステップ）によって誘発されます。
図 5：in vivoでの マウスの新皮質におけるPIRK発現のための手順 。 （A）PIRK発現プラスミドのセット。トッププラスミド：内部リボソーム侵入部位（IRES）を介して、CAGプロモーターとmCherryをによって駆動CmnRS用プラスミド。 mCherryを蛍光はCmnRSの発現の成功を確認することになります。ミドルプラスミド：CMNの取り込み21のtRNA Leuの CUAの3つのコピー、直交tRNAに結合されたKir2.1遺伝子のためのプラスミド。ボトムプラスミド：GFP_Y182 タグ用プラスミド。 GFPの遺伝子は部位21をタグにCMNの成功取り込みを可視化するために許容Tyr182サイトにアンバー終止コドン（GFP_Y182 タグ ）で設計されています。 （B）漫画翔翼in vivoでの PIRK発現のための実験手順。 PIRK発現のための遺伝子構築物は、マウスの新皮質（E14.5）に注入し、 子宮内 （左パネル） にエレクトロポレーションされています。 2日後、CMN-Alaが電気穿孔側の心室または大脳半球の両側（中央パネル）に注入されます。スライス撮影や電気生理学的アッセイは、E17.5-E18.5（右パネル）上で実行することができます。
図6：マウスの新皮質と光活性化PIRK式。 インビボでの （A）マウスGFPにCMNの取り込みを示す胚皮質ニューロンおよびKir2.1タンパク質の蛍光画像です。 図5Aの3遺伝子構築物は、 子宮内でエレクトロポレーションされています。 mCherryを蛍光はCMN特定のシンセの発現の成功を実証しますTASE遺伝子、CmnRS。 GFP蛍光は、GFP タグとKir2.1 TAGでそうCMNの取り込みにおけるCMNの取り込みを示す、唯一のCMN-Alaの注射（下）で検出されました。このように、緑と赤の蛍光が成功したすべての3つのプラスミドの発現およびCMNの取り込みを示しています。 （B）PIRKの光依存性活性化を示すマウス新皮質の神経細胞から記録された電流のIVプロット。 図5Aの遺伝子構築物をエレクトロポレーションした二日後、CMN-Alaが子宮内に注入しました。 CMN-ALAの注射後12〜48時間では、新皮質の急性切片を胚から調製しました。両方の赤と緑の蛍光によって検出されたスライスにおけるPIRK発現ニューロンは、（黒）前と（青）露光（385nmで、8ミリワット/ cm 2であり、飽和露光10秒）後に記録されています。 BaCl 2（500 mM）を光活性化（オレンジ色）の後PIRK固有の電流を確認するために添加されます。
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Discussion
効果的な光変調を実現するために、重要な最初のステップは、ここで標的タンパク質に光応答UAAを組み込むことを決定することです。標的タンパク質の構造的および機能的情報は、候補サイトの選択を導くために非常に有用です。これと同時に、光調節の目的は、最も適しているサイト決定するであろう。候補地を選択した後、私たちは、一次ニューロンへとin vivoで進める前に、このようなヒト胚性腎臓（HEK）容易文化や操作のための細胞などの哺乳動物細胞株でサイトをテストすることをお勧めします。 Kir2.1光活性化のための部位を同定するために、Kir2.1の孔に沿って複数のサイトが最初にHEK細胞で試験されています。 C169が存在Kir2.1孔径はCMN側鎖を収容するのに十分な大きさが、イオンの通過を遮断するCMN側鎖のために十分に小さいため、Kir2.1のC169は、最適な発見されました。 CMNはKir2.1にC169に組み込まれたときにHEK細胞で発現、トン彼は不活性であったが、成功したPIRK開発21を確認し、光の短いPuleの際に活性化になった突然変異体Kir2.1を結果として生じます。
直交tRNAと合成酵素の効率的な発現は、細胞およびin vivoで高UAAの取り込み効率を得るために重要です。直交シンテターゼ遺伝子を効率的に多くの場合、哺乳動物細胞およびニューロンにおいて使用されるポリメラーゼIIプロモーターおよびポリAシグナルを使用して表現されます。以前に18,20説明したように直交tRNAの発現のために、一緒に3 '隣接配列を持つような、ここで使用さH1プロモーターなどの特殊なタイプ-3ポリメラーゼIIIプロモーターは、必要とされています。 in vivoでの研究のために、我々は、tRNAの発現カセットの3つのコピーが一つのコピー（ 図5A）と比較して、CMNの取り込み効率を増加させることを見出しました。哺乳動物細胞における別の研究では、tRNAの発現カセットの数を増やすこともUAA取り込み効率30が増加しました 。 THEREFORE、我々はUAAの取り込み効率が改善を必要とする場合、異なるUaas、細胞、および標的タンパク質についてのtRNAの発現カセットの数を最適化することを示唆しています。細胞およびin vivoでのUaasの生物学的利用能は、UAAの取り込みのためのもう一つの重要な要因です。以前の研究は、Uaasのエステル化は、哺乳動物細胞31内のそれらの取り込みを増加させ、ジペプチド形態でUaasの調製は、 線虫（Caenorhabditis elegans）32で細胞にUAAの取り込みを増加させる示されています。我々は、Kir2.1でCMNの取り込みは、培養一次ニューロンにおいて発現が、 インビボ 21 におけるマウスの脳内取り込みのための不十分なために直接ニューロン培地にCMNを供給するのに十分であることを見出しました。したがって、ジペプチドCMN-ALAを合成し、マウスの脳に注射しました。オリゴペプチドトランスポーターPEPT2は非常にニューロンにジペプチドの輸送を容易にすることができる齧歯動物の脳33、で表されます。内在化DIPEptideは、組み込みのためUAA CMNを得るために携帯ペプチダーゼによって加水分解されるであろう。確かに、この最適化で、我々は新皮質、視床と視床下部21を含むマウス胎児の脳の複数の領域、でニューロンタンパク質への効率的なCMNの取り込みを達成しました。
ニューロンにおける成功PIRK式は、健康な神経培養の準備に強く依存します。プロトコルのすべてのステップは、正確かつ細心の方法で実行する必要があります。培養調製後、それが妨害することなく、インキュベーター内で培養を維持するのがベストです。オープニングとインキュベータの扉を閉じ、同様に、インキュベーターの外に培養皿を動かし、文化の質を損なうまで追加することができます。下インキュベーター温度（代わりに37°Cの35°C）興奮毒性を減らすことができます。同様のノートでは、カルシウム-Pのトランスフェクションは、余分な注意が必要です。 2×BBS緩衝液の調製は、重要なステップです。それはカリに良いアイデアです新しいDNA構築物または調製物は、トランスフェクション条件を変更する可能性があるため、pHは6.90から7.15の間に2倍BBSバッファの最適pHをBRATE。それは一貫した結果を達成するのに役立つ場合、緩衝液のpHは0.01桁の精度で調整することができます。トランスフェクションの前に、神経細胞培養の増殖培地を新鮮なものと交換されます。オリジナルの増殖培地を保存し、元の状態を復元するために、トランスフェクション後に培養物に戻って追加することが重要です。このような神経細胞から放出される成長因子などの細胞増殖に重要な分子を欠いているので、トランスフェクション後、新鮮な培地中で神経細胞培養物を維持することは、回復からニューロンを妨げます。
培養細胞および組織切片におけるPIRKの光活性化のために、適切な光源と配信方法を決定する必要があります。 CMNは長く、中波UVライト（280から400 nm）を吸収します。しかしながら、特に、より短い波長のUV光に、UV光への曝露を延長し、細胞に有害であろう。 SAMで電子時間は、遠赤色光は、細胞を摂動試料を加熱できました。したがって、単一波長の放射を持つLEDはPIRK活性化のための最善の方法です。 CMNの光分解のために、385 nmの（〜40ミリワット; Prizmatix）の発光のLEDを選択しました。 LEDは、外部顕微鏡の近くに設置され、光ファイバを正確に焦点の神経細胞に光を送達するために使用されます。再現性のあるデータ収集のために、光ファイバが1センチメートル離れ焦点のニューロンから45°の角度で設定されています。試料に光パワーを40ミリワット/ cm 2で測定しました。また、定期的に光パワーメータを用いたLEDの性能をチェックすることをお勧めします。
私たちは、 子宮内エレクトロポレーションでは 、遺伝的に生体内で Uaasを組み込むに有効な手法であることを実証している。わずかな変更で、以前に34を説明したように、マウスの胚性新皮質へのプラスミドDNAの子宮内エレクトロポレーションが行われます。 neonataにPIRKタンパク質を発現させるために、リットルのマウスの脳は、2の外科的処置は、（ 図5B）が必要です。最初のステップは、エレクトロポレーションに続いてPIRKの発現のための遺伝子構築物を注入することです。二日後、第二脳注入はCMN-ALAを実現するために行われます。それは上手すぎて動物を強調せずに手術を行うために練習を必要とするであろう。各手術後、動物を世話しなければならないと回復を通じて定期的にチェックしました。脳内のCMNの十分かつタイムリーな可用性が適切PIRKの発現に必須です。 CMN-ALA（500 mM）のの2-5μlのは、典型的には、胚の脳に注入されます。反対側からCMN-Alaで拡張CMN供給のための電気穿孔側に拡散することになるので、時々、それは、エレクトロポレーションの両方で心室と反対の半球にCMN-ALAを注入するのに役立ちます。 子宮内エレクトロポレーションでの一般的な有用性を考慮すると、この技術は、新皮質の神経細胞にだけでなく、ニューロンに限らず適用することができますエレクトロ/注射部位は、領域毎に調整される線条体、間脳、及び小脳のような他の脳領域です。胚/新生児の脳は大人の脳よりもはるかに柔らかいので、電気生理学実験用の急性スライスを取得することは困難です。アガロース埋め込みはビブラトーム切断のための胚の脳の構造を安定化するのに役立ちます。低融点アガロースは、脳組織の温度の衝撃を最小限に抑えるが冷脳上アガロース溶融注湯時に、注意が必要です。アガロース埋め込みから組織への温度衝撃の効果は、全細胞記録中に目立たなくなりました。
遺伝的にここPIRKで例示、培養神経細胞およびin vivoでの光応答Uaasをコードする、彼らのネイティブ環境での光で様々な神経細胞のタンパク質活性を制御するための光遺伝学の手法を与えるであろう。現在のプロトコルは、PIRKの発現および活性化の実験私を実行するためのステップバイステップの手順を提示します哺乳類の脳で使用するためのUAAシステムの最初の開発に成功したことを表すin vivoでの in vitroおよびげっ歯類の脳におけるnのニューロン培養物。それは多くの天然タンパク質の研究、ならびに疾患におけるその含意に利益をもたらす可能性を秘めています。例えば、α - アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4- isoxazolepropionic酸（AMPA）受容体およびN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体は、Kir2.1チャンネル同様の膜貫通構造を共有します。従って、これらのリガンド依存性イオンチャネルにPIRK方法を適用することが可能であろう。また、PIRK技術はまた、アンデルセン症候群および心臓短QT症候群35,36としてKir2.1関連する遺伝病の病態に対処するために利用することができます。 CMNを介して「ブロック・アンド・リリース」のCysに加えて、チロシン、セリン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびグリシンのような複数のアミノ酸が異なるphotoreleasableグループ37とケージされています。このように、同様の戦略は使用することができますin vitroおよびin vivoでニューロンにおけるこれらのアミノ酸を光調節するD。また、可逆光制御は、アゾベンゼン含有Uaasで達成することができ、そのようなUaasは現在、遺伝的にE.でエンコードされています大腸菌および哺乳動物細胞38,39。
要約すると、このプロトコルは、光でその本来の設定でニューロンタンパク質の活性を制御するための一般的な方法を提示します。オプシン家族や他の光に敏感なタンパク質またはドメインを含む他の光遺伝学の方法と比較して、この方法は、遺伝的にのみ単一残基感光Uaas、変更をエンコードされた使用します。したがって、それは、研究中の標的タンパク質の機能、人身売買とローカリゼーションへの最小限の干渉を持っている必要があります。高いサイトの選択はまた、詳細な分子研究のために、より大きな柔軟性と特異性を提供するために、これらの遺伝的にコードされた光応答性Uaasで達成することができます。このプロトコルはまた、最初の共同提供しますmprehensive、正常にin vitroおよびin vivoで神経細胞内タンパク質にUaasを組み込むための方法を簡単にフォロー手続き。 in vitroでの神経細胞およびin vivoで遺伝的にコードされUaasを経由して、一般的なタンパク質の光制御は、基本的なおよび翻訳の両方科学に利益をもたらす大きな可能性を秘めている、とこのプロトコルは、その適用を促進に役立つだろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 | |
| Dissecting Knife - Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 | |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 | |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 | |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | ||
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
References
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y.
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G.
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
