Contrôle optique d'une protéine Neuronal L'utilisation d'un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Introduction

Par rapport à la stimulation électrique classique, photostimulation offre une plus grande résolution temporelle et spatiale avec un minimum d'interférences dans le système physiologique de spécimens. Depuis la démonstration de l' utilisation de lasers pour stimuler les neurones en 1971 ^1, de nombreuses façons créatives ont été inventés pour contrôler l' activité neuronale exogène avec la lumière. Libération optique des agonistes photocaged a longtemps été utilisé pour étudier la réponse physiologique du réseau neuronal à des ligands ^2,3,4. Cette technique a limité la spécificité due à la diffusion des agonistes en cage. Spécificité génétique est obtenue en exprimant de manière ectopique canaux opsin sensibles à la lumière et des pompes ^5,6,7, et elle a été appliquée avec succès pour moduler des réseaux neuronaux sélectionnés dans des organismes modèles divers. Cependant, il serait difficile d'appliquer cette méthode pour contrôler optiquement diverses autres protéines neuronales, étant donné que le greffage photoresponsiveness à partir des protéines opsin à d'autres protéines would exiger l'ingénierie intense qui peut modifier les caractéristiques naturelles de la protéine à l'étude. Chimiquement attacher un ligand photosensible exogène à une protéine a montré une autre façon de contrôler la fonctionnalité des protéines de canal ^8,9,10. Le ligand est présenté ou retiré du site de liaison de la protéine à travers la photoisomérisation du fragment azobenzène. chimie d'attache limite l'application principalement sur le côté extracellulaire de protéines membranaires, à l'exclusion du côté intracellulaire et des protéines intracellulaires.

Photosensibles Uaas, après avoir été incorporé dans les protéines, fournir une stratégie générale pour manipuler les protéines avec de la lumière. Dans les premiers efforts, ARNt acylé chimiquement avec Uaas photocaged ont été microinjection dans des ovocytes de Xenopus pour incorporer les Uaas dans des récepteurs membranaires et des canaux ioniques ^11, qui ont fait progresser la compréhension de leurs relations structure-fonction ^12,13,14.Cette approche de microinjection est principalement limitée aux grandes ovocytes. Incorporation génétique d'un Uaa contourne le défi technique ARNt acylation et microinjection en utilisant une paire ARNt / synthétase orthogonale, qui intègre le Uaa grâce à la traduction de protéine endogène dans les cellules vivantes ^15,16,17,18. UAA incorporation dans les protéines neuronales a été démontrée dans des neurones primaires et des cellules souches neurales ^19,20. Plus récemment, Uaa photoréactif a été génétiquement incorporé dans une protéine neuronale dans le cerveau d'un mammifère in vivo pour la première fois ^21. Ces avancées permettent d'étudier les protéines neuronales avec Uaas dans leur environnement cellulaire natif.

Rectification entrante du canal potassique Kir2.1 est un redresseur solide qui passe courants K ⁺ plus facilement dans qu'à l' extérieur de la cellule, et il est essentiel dans la régulation des processus physiologiques tels que l' excitabilité cellulaire, le tonus vasculaire, la fréquence cardiaque, reflux de sel finale et la libération d' insuline ^22. La surexpression de Kir2.1 hyperpolarise le potentiel de membrane du neurone cible, qui devient moins excitables ^23,24. Pour contrôler optiquement Kir2.1 dans ses cellules natives, Kang et al. Génétiquement incorporé un Uaa photo-sensible en Kir2.1 exprimé dans les cellules de mammifères, les neurones et les cerveaux de souris embryonnaires ^21. Une brève impulsion de lumière a été en mesure de convertir le Uaa en un acide aminé naturel Cys, activant ainsi la cible protéine Kir2.1. Lorsque cette potassium à rectification entrante (PIRK) protéine de canal photo-inductible de rat a été exprimé dans les neurones hippocampiques primaires, on supprime la décharge neuronale en réponse à l'activation par la lumière. En outre, le canal de PIRK a été exprimé dans le néocortex embryonnaire de la souris et le courant PIRK activé par la lumière dans les neurones corticaux a été mesurée. La mise en œuvre réussie de la technologie Uaa in vivo dans le cerveau des mammifères ouvre la porte à contrôler optiquement protéines neuronalesdans leur environnement natif, ce qui permettra à la dissection optique des processus et des mécanismes neuronaux au niveau moléculaire.

Dans ce protocole , nous décrivons les procédures d'incorporation génétique des Uaas dans les neurones primaires en culture et dans le cerveau de souris embryonnaires in vivo. Le photoréactif Uaa Cmn et Kir2.1 sont utilisés pour illustrer le processus. Des méthodes pour évaluer l'incorporation réussie Uaa et le contrôle optique de l'activité de la protéine neuronale sont fournis. Ce protocole fournit un guide clair génétiquement codant Uaas dans les neurones et in vivo, et de réguler optiquement fonction de la protéine neuronale via un Uaa photosensible. Nous nous attendons à ce protocole pour faciliter l'adoption de la technologie Uaa in vivo pour les neurosciences et les études biologiques optogénétiques.

Protocol

Toutes les procédures de la présente étude ont été effectuées en utilisant des protocoles pour la manipulation des animaux au Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, en Californie Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) approuvé

1. Uaa Incorporation dans Kir2.1 et expression de l'Resultant PIRK dans la Neuronal Culture primaire

1. ADN Construction
   1. Sélectionnez un site cible de Kir2.1 pour Uaa incorporation. Exploiter les connaissances antérieures et des informations sur la structure et la fonction de Kir2.1, de sorte que le site choisi avec le photoréactif Uaa incorporé permet une modulation optique de la fonction Kir2.1 ^21.
   2. La construction d'un gène Kir2.1 d'ADN recombinant codant pour le site choisi muté au codon d'arrêt TAG ambre. Utilisez les techniques de clonage standard ²⁵ pour cloner l'ADN Kir2.1-TAG dans un plasmide d'expression de mammifère.
   3. Clone ARNt gènes / synthétase qui sont spécifiques pour l'UAA et intègrent le Uaa en réponse àle codon d'arrêt TAG dans un autre plasmide d' expression de mammifère ^21.
      Remarque: Pour optimiser l'incorporation UAA, différents promoteurs et des combinaisons de cassettes de gènes (par ARNt synthétase, et Kir2.1) peuvent être testés dans des plasmides différents.
   4. Obtenir un ADN de plasmide de haute qualité en utilisant miniprep ou MaxiPrep kits commerciaux selon le protocole du fabricant. Autour de 1,9 du ratio 260/280 est optimal pour l'ADN purifié. Si nécessaire, effectuer une électrophorèse sur gel d' agarose pour vérifier la pureté de l'ADN préparée ^25. Superenroulé ADN plasmidiques avec une grande pureté sont les meilleurs pour la transfection neuronale.
2. Culture Rat hippocampique Neurones primaire
   1. lamelles Lieu de verre (cercles, 12 mm de diamètre) dans des plaques à 24 puits, une lamelle sur chaque puits, et enrober chaque puits avec 250 pi de 0,5 mg / ml de poly-D-lysine (dans 100 mM de tampon borate: 1,24 g borique tétraborate de sodium et 1,90 g d' acide dans 400 ml d' eau désionisée distillée H ₂ O ou ₂ ddH
   2. Le jour de la dissection, recueillir les cerveaux néonatales de bébés rats postnataux (1-4 jour postnatal) après les anesthésier avec isoflurane et décapitant. Anesthetize les chiots dans une chambre d'anesthésie contenant isoflurane (2-4%). Attendez jusqu'à ce qu'ils perdent conscience et ne parviennent pas à répondre à des stimuli tactiles et de pincement des pattes.
   3. En utilisant la technique standard ^26, disséquer hippocampes du cerveau dans un endroit chaud (~ 37 ° C) une solution saline (10 mM de HEPES et 20 mM de D-glucose ajoutée dans une solution saline équilibrée de Hank), et collecter des hippocampes dans un tube conique de 4,5 ml de sérum physiologique tiède .
   4. Ajouter 500 ul de 2,5% de trypsine à hippocampes (0,25% de concentration finale de la trypsine) et laisser incuber pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 ° C.
   5. Rincer soigneusement le tissu avec une solution saline (3 x 10 ml) et trituré.
   6. Récupérer les neurones dissociés dans 1 ml wdes milieux de croissance contenant du bras du milieu essentiel minimum (MEM) additionné de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 21,2 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 2% B-27 et de dilution du sérum à 0,1%.
      Note: Ajouter la L-glutamine et B-27 le jour de la dissection pour préparer un milieu de croissance frais.
   7. Compter les neurones avec un hémocytomètre et la plaque eux sur des lamelles dans des plaques 24 puits à raison de 1,0 à 1,5 x 10 ⁵ cellules / puits avec une densité du milieu de croissance de 500 microlitres après filtration à travers une maille de nylon de 40 pm.
   8. Incuber la culture des neurones à 35 ° C dans 5% de _CO2: 95% d' air humidifié incubateur pendant 2-3 semaines. Pour le meilleur résultat, ne pas perturber la culture autant que possible au cours de l'incubation.
3. Le phosphate de calcium (Ca-P) Transfection de la culture primaire Neuronal
   1. Faire des solutions mères et conserver à 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -bis [2-hydroxy-éthyl] -2-aminoéthanesulfonique acide) tampon (10x); 150 mM Na ₂ HPO ₄ (100x); 2,8 M de NaCl (10x); ddH stérile ₂ O; NaOH stérile N 1.
   2. Le jour de la transfection, faire fraîche M solution 2,5 CaCl ₂ en ddH ₂ O et le filtre stérile avec filtre de 0,22 um. Faire 2x frais BES tamponnée Saline (BBS) contenant BES 50 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO ₄ et NaCl 280 mM à pH 7,00 (ajuster le pH avec NaOH) et le filtre stérile avec filtre de 0,22 um.
      Remarque: Calculer la quantité de solution de CaCl ₂ et du tampon BBS en fonction du nombre de lamelles à transfecter. Regardez aussi 1.3.4.
   3. Remplacez le support de croissance de la culture avec 500 milieux de croissance de transfection préchauffée ul frais. (Milieu de transfection peuvent être fabriqués avec du MEM, plus 21,2 mM de D-glucose).
      Note: Ne pas jeter les anciens médias.
   4. Calculer la quantité de ddH ₂ O et se préparer à ajouter afin de rendre la solution de transfection (33 pi par chaque lamelle) contenant 1,65 ul de _CaCl2, 0,7 pg d' ADN, et 16,5 &# 181; l 2x BBS.
   5. Préparer immédiatement la solution de transfection avant de l'ajouter à la culture. Pour préparer, d' abord combiner CaCl ₂ et ddH ₂ O tout en agitant doucement le tube. Continuer à agiter et ajouter lentement de l'ADN dans la solution. Enfin, ajouter goutte à goutte tampon 2x BBS tout en agitant.
   6. Immédiatement ajouter 30 ul de solution de transfection à chaque lamelle de la culture des neurones.
   7. Rock the boîte de culture à quelques reprises pour mélanger la solution et incuber à 35 ° C dans un 5% de CO _2: 95% d' air incubateur humidifié pendant 45 min-1 heure. Après que les neurones sont incubés avec la solution de transfection, des précipités très fins Ca-P formeraient une couche recouvrant les neurones.
   8. Remplacer le milieu de transfection de 500 ul préchauffée tampon de lavage (135 mM de NaCl, 20 mM d' HEPES, 4 mM de KCl, 2 mM de _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 1 mM de Na ₂ HPO _4, 10 mM de glucose à pH 7,3, stériles filtrée avec filtre de 0,22 um) et incuber à 356; C dans un 5% de CO _2: 95% d' air humidifié incubateur pendant 15-20 min. Ca-P précipités disparaîtraient après l'étape de lavage.
   9. Remplacer le tampon de lavage avec 500 ul de milieu de croissance frais. Encore une fois, remplacer le milieu de croissance avec le support d'origine enregistrée.
   10. Ajouter l'Uaa Cmn (pré-mélangé dans 50 ul de milieux de culture chaud) à la culture pour atteindre 1 mM de concentration finale.
   11. Incuber la culture transfectées à 35 ° C dans 5% de _CO2: 95% d' air humidifié incubateur pendant 12 à 48 heures avant les essais.
4. Le total d'enregistrement portable avec activation Lumière
   1. Préparer des solutions supplémentaires / intracellulaires. La solution intracellulaire contenant 135 mM de gluconate de potassium, 10 mM de NaCl, 2 mM de _MgCl2, 10 mM de HEPES, 1 mM d' EGTA, 2,56 mM de K ₂ ATP et 0,3 mM de GTP Li ₂ à pH 7,4. La solution d'enregistrement extracellulaire contient du NaCl 150 mM, KCl 3 mM, 5 mM de _MgCl2, 0,5 mM de CaCl _2, 5 mM de glucose et 10 mM de HEPES à pH 7,4.
   2. Installez une diode électroluminescente (LED) avec une émission de 385 nm par le microscope à la plate-forme pour fournir de la lumière au point focal de 1 cm à un angle de 45 °. Vérifiez la puissance de la LED avec un compteur de puissance lumineuse.
5. Tirez pipettes de patch à partir d'électrodes de verre en utilisant un extracteur micropipette commercial pour avoir 3-6 Mohm de pipette. Suivez les instructions du fabricant pour mettre en place l'extracteur micropipette.
   1. Pour tester la résistance à la pipette, d'abord remplir la pipette avec la solution intracellulaire et le positionner sur le support d'électrode. Trempez la pipette dans une boîte de culture de 35 mm rempli de la solution extracellulaire, placé sur le microscope platform. Immergez une électrode de masse dans le plat pour compléter un circuit.
   2. Allumez l'amplificateur / numériseur et commencer un logiciel d'acquisition de données. Surveiller la résistance de la pipette à un protocole d'essai de la membrane.
6. Prendre une lamelle couvre-objet de la culture des neurones de l'incubateur et rinçage une fois dans la solution extracellulaire. Utilisation de la graisse à vide, maintenez la lamelle au milieu d'une boîte de culture de 35 mm rempli de la solution extracellulaire frais.
7. Placez la lamelle / plat sur la plate-forme électrophysiologie de microscope.
8. En utilisant les techniques de patch de serrage standard, patcher un neurone avec mCitrine fluorescence ^27. activité neuronale Enregistrer avec pince de courant de la méthode (I-clamp). En premier lieu, d'ajuster le potentiel de repos de -72 mV environ par injection d'un faible courant. Ensuite, d'injecter un courant de l'étape (10 à 200 pA) pour induire une cuisson en continu (5-15 Hz) des potentiels d'action.
9. Manuellement ou en utilisant le logiciel d'acquisition de données, clignote une impulsion (un péchégle impulsion de 100 ms ^-1 durée sec) de la lumière LED au neurone lors de l' enregistrement, et voir si les potentiels d'action sont affectés.
10. Ajouter mM _BaCl2 0,5 au bain et à vérifier si les potentiels d'action sont récupérés.

2. Uaa Incorporation dans Kir2.1 et expression de l'Resultant PIRK dans le cerveau de souris embryonnaires in vivo

1. ADN Construction
   1. Concevoir l'ADN plasmidique de manière similaire à l'étape 1.1. Pour l' expression in vivo, utiliser un promoteur fort tel que l' ACG (poulet bêta-actine promoteur CMV activateur).
   2. Purifier l'ADN avec un maxiprep kit commercial sans endotoxine selon le protocole du fabricant. Effectuer une extraction au phénol-chloroforme suivie par une précipitation à l'éthanol ²⁵ pour acquérir l' ADN de très haute qualité (condensé à 2-5 pg / pl).
2. In Utero électroporation à la souris embryonnaires néocortex
   Note: La techni baseQue in utero électroporation a été décrite précédemment ^28.
   1. Anesthésier une souris enceinte chronométré au jour embryonnaire 14,5 (E14.5) avec du pentobarbital sodique (injection intraperitoneale, 50 pg par kg de poids corporel en grammes) ou isoflurane (par inhalation, 2-4%). Surveiller profondeur de l'anesthésie en vérifiant la perte de conscience et aucune réponse à des stimuli tactiles et de pincement des pattes.
   2. Faire une petite incision sur la ligne médiane abdominale. exposer doucement les cornes utérines avec des pinces et du bout des doigts.
   3. Injecteront environ 1 pi de solution d'ADN (2-5 pg / pl de chaque plasmide, en fonction de la construction) dans le ventricule latéral de chaque littermate avec une pipette en verre inséré à travers la paroi utérine. Dans la plupart des cas, environ 60 à 80% des embryons sont injectés au total.
   4. Électroporation les embryons avec un electroporator (33-35 V, 50 msec, 950 msec intervalle, 4-8 impulsions).
   5. Remettre les cornes utérines à la cavité abdominale doucement avec pourCèpes et du bout des doigts. Suturer la paroi musculaire et la peau avec une suture chirurgicale pour permettre aux embryons de poursuivre le développement.
3. Uaa microinjection
   1. Faire une petite incision sur la ligne médiane abdominale à nouveau à E16,5, et d'exposer doucement les cornes utérines avec des pinces et du bout des doigts.
   2. Injecter environ 5/2 pi Cmn-Ala (500 mM), du côté électroporation ou les deux côtés du ventricule latéral avec une pipette en verre inséré à travers la paroi utérine. Pour augmenter la biodisponibilité Cmn, utilisez le dipeptide Cmn-Ala (CMN-alanine) pour délivrer Cmn in vivo ^21.
   3. Encore une fois, retourner les cornes utérines à la cavité abdominale doucement avec une pince et le bout des doigts. Suturer la paroi musculaire et la peau avec une suture chirurgicale pour permettre aux embryons de poursuivre le développement.
4. Obtenir aiguë tranches cerveau
   1. Faire 1 litre de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) contenant du NaCl 119 mM, 2,5 mM de KCl, 1,3 mM de _MgCl2, 2,5 mM de CaCl 2 PO _4, 26,2 mM NaHCO _3, et 11 mM de glucose à pH 7,3.
   2. Prenez 200 ml ACSF et de congélation rapide à -80 ° C pendant 20-30 min. Bubble le reste de l' ACSF avec 5% de CO _2: 95% de O ₂ gazeux à la température ambiante.
   3. Préparer et stériliser les outils de chirurgie pour récolter les cerveaux des embryons. Aussi préparer un seau de glace.
   4. Faire ~ solution d'agarose à bas point de fusion de 100 ml à 4% dans un flacon en chauffant dans un four micro-ondes. Refroidir solution pendant environ 5 min avant qu'il ne commence à se solidifier.
   5. Euthanasier la souris 12-24 h après l' injection Cmn-Ala par CO ₂ surdosage. Faire de grandes incisions dans la zone abdominale, et de disséquer les embryons électroporées / microinjection de l'utérus avec des ciseaux fins et forceps.
   6. cerveaux de récolte des embryons avec des ciseaux fins et des pinces.
   7. Placez chaque cerveau sur une boîte de culture de 10 cm placé sur le seau à glace. Divisez deux hémisphères en utilisant une lame tranchante, et placer chaquehémisphère sur le plat avec le plan sagittal médian de toucher le fond du plat. Verser rapidement sur la solution d'agarose sur le cerveau (environ 500 pi par hémisphère).
   8. En utilisant une lame bien aiguisé, couper carré l'agarose autour d'un cerveau pour faire un bloc d'agarose cerveau intégré.
   9. Utilisation de tissu adhésif, colle vers le bas de la surface de plan sagittal médian du bloc d'agarose sur un support pour vibratome. Remplir la chambre de vibratome avec ACSF pré-réfrigérés et couper 200 um tranches de cerveau sagittal.
   10. Incuber tranches aiguës dans ACSF supplémenté avec 3 mM myo - inositol, l' acide ascorbique 0,4 mM et du pyruvate de sodium 2 mM à 33 ° C pendant 42 min tout en faisant barboter avec 5% de CO _2: 95% O ₂ gazeux.
   11. Après 42 min, éteignez l'appareil et continuer à incuber les tranches à la température ambiante avec barbotage. Commencez à cellules entières d'enregistrement de patch au moins 15 minutes après avoir éteint le chauffage.
5. Le total d'enregistrement portable avec activation Lumière
   1. Préparer le intracellular solution contenant 130 mM de gluconate de potassium, 4 mM de _MgCl2, 5 mM de HEPES, 1,1 mM d' EGTA, 3,4 mM de Na ₂ ATP, 10 mM de créatine phosphate de sodium et 0,1 mM de Na ₃ GTP à un pH de 7,3 ajusté avec KOH.
   2. Tirez pipettes de patch à partir d'électrodes de verre en utilisant un extracteur micropipette commercial pour avoir 3-6 Mohm de pipette.
   3. Mettre en place la tranche électrophysiologie rig pour la cellule entière patch clamp et superfuse la chambre d'enregistrement avec ACSF à 2 ml / min débit d'une pompe à perfusion. Réglez la température de la chambre à environ 33 ° C.
      Remarque: La plate-forme tranche d'électrophysiologie est équipée d'une chambre de perfusion, d'un objectif à immersion dans l'eau et un régulateur de température. En outre, le filtre de la GFP (excitation: 480/30 nm, émission: 535/40 nm) et le filtre mCherry (excitation: 580/20 nm émission: 675/130 nm) sont nécessaires.
      1. Installez une LED avec une émission de 385 nm par le microscope à la plate-forme pour fournir de la lumière au point focal de 1 cm à 45 °angle. Vérifiez la puissance de la LED avec un compteur de puissance lumineuse.
   4. Prenez soigneusement une tranche de cerveau avec une pipette en verre et placer dans la chambre de perfusion. Maintenez la tranche avec une harpe.
   5. Patch un neurone avec fluorescence mCherry / GFP de la région du néocortex ^27. activité PIRK d'enregistrement à l'aide de verrouillage de tension de la méthode (V-clamp). Tout d'abord, maintenir le potentiel de membrane à -60 mV. Puis, fiche courants à des potentiels fixes négatifs de la membrane (-100 mV) ou des rampes de tension (-100 mV à +40 mV). Plus précisément, surveiller Kir2.1 courants entrants spécifiques à -100 mV.
   6. Manuellement ou en utilisant le logiciel d'acquisition de données, clignote une impulsion (une seule impulsion de 100 ms ^-1 durée sec) de la lumière LED au neurone lors de l' enregistrement, et voir si les protéines Pirk sont activées. Une fois PIRK est activé, courants entrants à -100 mV augmenteraient considérablement.
   7. Ajouter mM _BaCl2 0,5 au bain et à vérifier si PIRK est inactivée à nouveau.

Representative Results

Pour incorporer génétiquement un Uaa en une protéine dans les neurones, la première étape importante consiste à concevoir gène approprié construit pour délivrer et exprimer des gènes efficacement dans les neurones. Il y a trois composantes génétiques pour Uaa incorporation: (1) le gène cible avec le codon d'arrêt TAG ambrée introduit au site choisi pour Uaa incorporation (2) un ARNt orthogonal à reconnaître le codon d'arrêt TAG muté, et (3) une aminoacyl orthogonale -tRNA synthétase pour charger la Uaa sur le ARNt orthogonal. Chaque composant doit être conduit par le promoteur approprié. Ces trois cassettes de gènes peuvent être inclus dans un plasmide ou dans plusieurs plasmides séparés. Pour exprimer PIRK dans les neurones, la photo-réactive Uaa Cmn est incorporé dans Kir2.1 en utilisant les orthogonales ARNt ^Leu _ACU / CmnRS (CMN-ARNt synthétase) paire évolué pour être spécifique pour Cmn ^21,29. Résidu Cys169 du gène Kir2.1 est muté au codon d'arrêt TAG ambre (KIR2.1-TAG) et la protéine fluorescente mCitrine est fusionnée à l'extrémité C-terminale de Kir2.1 pour visualiser l' expression de PIRK dans la culture neuronale (figure 1).

L'obtention de la culture neuronale de bonne qualité est une condition préalable pour des expériences de Pirk réussies. jour postnatal 1-4 bébés rats Sprague Dawley sont généralement utilisés pour la préparation de la culture neuronale, mais les embryons de rats sont aussi fréquemment utilisés. Lorsque plaqués sur des lamelles dans des plaques à 24 puits à 1,0-1,5 x 10 ⁵ cellules / puits densité, on devrait voir les neurones sains et bien séparés avec microglie pas trop ou d' autres débris (figure 2A). Neurones sains ont des processus étendus, et les corps cellulaires (soma) sont dodues (figure 2B). Distinctively structure suborganelle visible est généralement un signe de culture malsaine. La culture neuronale peut être maintenue pendant 2-3 semaines à 35 ° C dans 5% de _CO2: 95% d' air humidifié incubateur.

Cphosphate alcium (Ca-P) transfection est une méthode de transfection très doux approprié pour la culture neuronale sensible. Cependant, il exige une extrême précision et de prudence pour obtenir une efficacité de transfection élevée dans les neurones. Les solutions mères doivent être stockés à 4 ° C, et mélanger pour obtenir un tampon BBS 2x le jour de la transfection. ajustement du pH précis est la clé pour obtenir de bons résultats reproductibles. 2,5 M solution de CaCl ₂ doit également être fraîches le jour de la transfection. Tous les tampons doivent être filtrés. En outre, des plasmides d'ADN frais avec une grande pureté et de qualité améliorent les résultats. Pour de meilleurs résultats, on peut obtenir un mini-prepped d'ADN frais de ne pas envahi la culture d' Escherichia coli (~ 12 h à 37 ° C dans l'incubateur avec agitation). Après tous les tampons sont prêts, apporter les solutions dans la culture de tissus hotte et préparer pour la transfection. À l'aide d'un vortex à faible vitesse, agiter la solution de transfection tout en mélangeant. Immédiatement ajouter la solution mélangée à la cu neuronallture, et amener la boîte de culture de retour à l'incubateur. Arrêter la transfection après 45 min-1 heure, et ajouter le milieu de croissance d'origine à la culture pour l'incubation continue. Les neurones transfectées peuvent être visualisées à partir de 6 h après la transfection est terminée (figure 3). En présence de Cmn dans les milieux de culture, PIRK est exprimée et les neurones Pirk exprimant sont vert fluorescent en raison de la protéine mCitrine fusionnée à l'extrémité C-terminale de PIRK (Figure 3D). PIRK neurones exprimant ont la physiologie normale de base , et ils sont capables de tirer des potentiels d'action en réponse aux courants injectés (figure 4). Cependant, cette série de potentiels d'action est supprimée immédiatement avec une impulsion de lumière brève brilla à la cellule (figure 4A). Quand mM BaCl ₂ à 0,5, un inhibiteur spécifique Kir2.1, on ajoute au bain, la décharge neuronale est alors repris, ce qui indique que la suppression précédente était due à l'activation par l Kir2.1roite (figure 4B). Les neurones de contrôle non transfectées ne répondent pas à la lumière ou Ba ²⁺ (figure 4C, D).

Pour exprimer PIRK in vivo, des plasmides d'ADN hautement purs et concentrés (2-5 pg / pl) doivent être préparés. Des plasmides spécifiques utilisés dans ces expériences sont présentés sur la figure 5A. En plus de la paire ARNt ^Leu _ACU / CmnRS orthogonale et le gène Kir2.1-TAG cible, un gène codant pour la protéine fluorescente verte avec une mutation de TAG (GFP-TAG) est également co-électroporation en tant que rapporteur fluorescent. La détection de fluorescence de la GFP indiquerait la prestation réussie de tous les trois plasmides, étant donné que la suppression de TAG dans la GFP , il faudrait à la fois l'ARNt ^Leu _ACU et les CmnRS; Cmn incorporation dans GFP-TAG suggère Cmn incorporation dans Kir2.1-Tagas bien, parce que les deux gènes sont présents dans la même cellule. Les trois constructions de gènes sont tous InjeCTED dans le ventricule latéral d'embryons de souris sur E14.5 (figure 5B, panneau de gauche). Après électroporation, le retour des embryons à la cavité abdominale pour permettre aux embryons de poursuivre le développement. Deux jours plus tard, injecter environ 5/2 pi Cmn-Ala (500 mM) , du côté électroporation ou les deux côtés du ventricule latéral, de la même manière que l' injection d'ADN (figure 5B, panneau du milieu). Encore une fois, le retour des embryons à la cavité abdominale pour le développement continu. Les embryons peuvent être récoltées sur E17.5 pour l'imagerie ou des analyses électrophysiologiques. Comme on s'y attendait, avec seulement une injection Cmn-Ala, les cellules fluorescentes vertes sont observées dans le néocortex de souris. Les cellules avec une fluorescence rouge et verte auraient Cmn incorporé dans Kir2.1-TAG pour faire des canaux de Pirk (Figure 6A). enregistrement cellules entières de la tranche du néocortex embryonnaire se fait de façon similaire comme cela se fait sur la culture neuronale. Les neurones fluorescents verts et rouges ont aucun courant vers l'intérieur negatif potentiel de maintien, mais une brève impulsion de lumière active rapidement le courant vers l' intérieur (figure 6B). Le courant est complètement bloqué en ajoutant Ba ^2+, confirmant qu'il est généré par PIRK.

Figure 1: PIRK set expression plasmidique pour la culture neurone Schéma montrant la conception plasmidique exemplaire pour l' expression de PIRK dans la culture neuronale.. Top plasmide code gène Kir2.1 (gris) avec une mutation d'un seul acide aminé dans le site C169 sous cytomégalovirus (CMV). C169 est muté au codon d'arrêt TAG ambre, où la SAU Cmn serait incorporé. gène Kir2.1 est suivi par le gène mCitrine (vert). mCitrine est fusionnée à l'extrémité C-terminale du gène Kir2.1 pour visualiser les cellules exprimant PIRK. plasmidique Bottom code CmnRS (rose), la synthétase spécifique Cmn, poussés par la phosphoglycérate de la souris kinase-1 (MPGK) promoteur. ARNt > Leu _ACU (bleu), l'ARNt orthogonal ^21, est également exprimé dans le même plasmide entraîné par le promoteur H1, mais en sens inverse.

Figure 2: Rat hippocampique culture neuronale primaire images exemples montrant rat sain cultures de neurones hippocampiques.. (A) Une image CIVD de la culture neuronale de 10 jours in vitro (DIV). Neurones matures comme ils se ramifient dendrites et des axones. les cellules microgliales (petites et rondes cellules sans processus) coexistent mais ne submergent la culture. (B) une image agrandie DIC des neurones cultivés en bonne santé. Un neurone sain présente corps cellulaire dodue (soma) et prononcé dendrites / axones. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3:. PIRK expression dans les neurones en culture primaire DIC et des images de fluorescence des neurones d'hippocampe de rat en culture in vitro et transfectées avec des constructions de gènes représentés sur la figure 1 pour l' expression de PIRK. Lorsque Cmn est pas ajouté dans la culture après la transfection (A et B), aucune fluorescence verte est détectée à partir des neurones. En présence de Cmn (1 mM) dans le milieu de croissance, les neurones transfectées sont capables d'exprimer toute la longueur des protéines PIRK-mCitrine, montrant ainsi la fluorescence verte (C et D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4:. Activation Lumière de PIRK supprime le tir des neurones hippocampiques de rat (A) Une impulsion lumineuse unique supprime l' activité du neurone hippocampique exprimant PIRK. traces de tension représentatifs sont enregistrées en continu dans le courant-clamp. Action tir potentiel est évoqué par 20 pA injection de courant (I-étape). Exposition à la lumière (385 nm, 40 mW / cm ^2, 1 secondes, indiqué par la flèche) rapidement et complètement supprime la décharge neuronale. La cuisson est restaurée avec extracellulaire mM BaCl 500 _2, qui inhibe sélectivement les canaux Kir2.1. (B) Les rayons ultraviolets (UV) éclairage (385 nm, 40 mW / cm ^2, 6 sec, indiqué avec la boîte jaune) ne modifie pas l' excitabilité du contrôle, les neurones non transfectées. Action tir potentiel est évoqué par 50 pA injection de courant (I-étape). (C et D) Ni illumination UV ni BaCl ₂ (500 mM) affecte excitabilité des neurones témoins. action puissanteial est évoqué par 50 pA injection de courant (I-étape).

Figure 5: Procédure pour l' expression PIRK dans le néocortex de souris in vivo. (A) PIRK plasmide d' expression défini. Top plasmidique: le plasmide pour CmnRS entraînés par le promoteur CAG et mCherry via site interne d'entrée du ribosome (IRES). mCherry fluorescence vérifierait expression réussie de CmnRS. Plasmide intermédiaire: le plasmide pour le gène Kir2.1 couplé avec trois copies de ARNt ^Leu _ACU, l'ARNt orthogonal pour le MCN incorporation ^21. Plasmidique Bottom: le plasmide pour GFP_Y182 _TAG. Le gène de la GFP est conçu avec un codon d'arrêt ambre sur le site Tyr182 permissive (GFP_Y182 _TAG) pour visualiser l' incorporation réussie de Cmn TAG ²¹ sites. (B) sho Cartoonaile d' une procédure expérimentale pour l' expression de PIRK in vivo. Des constructions génétiques pour l' expression PIRK sont injectés dans le néocortex de souris (E14,5) et une électroporation in utero (panneau de gauche). Deux jours plus tard, le MCN-Ala est injecté dans le ventricule du côté électroporation ou les deux côtés hémisphères cérébraux (panneau du milieu). Slice imagerie et analyse électrophysiologique peuvent être effectuées sur E17.5-'a 18,5 (panneau de droite).

Figure 6: expression de PIRK dans le néocortex de la souris et de l' activation de la lumière. Images (A) de fluorescence de souris neurones corticaux embryonnaires montrant l'incorporation de Cmn en GFP et les protéines Kir2.1 in vivo. Les trois constructions de gènes de la figure 5A sont soumis à une électroporation in utero. mCherry fluorescence démontre l'expression réussie de la synthe spécifique Cmngène tase, CmnRS. Fluorescence de la GFP est détectée seulement avec injection Cmn-Ala ( en bas), ce qui indique Cmn incorporation dans GFP _TAG et probablement incorporation Cmn dans _TAG Kir2.1. Ainsi, la fluorescence verte et rouge indique l'expression réussie de tous les trois plasmides et Cmn incorporation. (B) IV parcelle de courants enregistrés sur des souris neurones du néocortex montrant l' activation dépendant de la lumière de PIRK. Deux jours après constructions de gènes de la figure 5A électroporation, Cmn-Ala a été injecté dans l' utérus; 12-48 h après l'injection Cmn-Ala, des tranches aiguës néocortex ont été préparés à partir des embryons. Neurones dans les tranches, détectées à la fois par fluorescence rouge et vert PIRK exprimant, sont enregistrés avant (noir) et après (bleu) exposition à la lumière (385 nm, 8 mW / cm ^2, 10 sec pour l' exposition saturée). BaCl ₂ (500 mM) est ajouté pour vérifier les courants spécifiques à PIRK après photoactivation (orange).

Discussion

Pour réaliser la photo-modulation efficace, la première étape importante est de décider où incorporer le Uaa photosensible dans la protéine cible. Les informations structurelles et fonctionnelles de la protéine cible est très utile pour guider la sélection des sites candidats. Dans le même temps, le but de la réglementation lumière déterminerait quel site est le plus approprié. Après avoir choisi les sites candidats, nous vous recommandons de tester les sites dans des lignées cellulaires de mammifères tels que le rein embryonnaire humain (HEK) cellules pour la culture et la manipulation plus facile, avant de procéder à des neurones primaires et in vivo. Identifier un site pour une photoactivation Kir2.1, de multiples sites le long des pores de Kir2.1 ont été initialement testés dans des cellules HEK. C169 de Kir2.1 a été trouvée optimale, parce que la taille des pores Kir2.1 où C169 réside est assez grande pour accueillir des chaînes latérales Cmn mais assez petit pour les chaînes latérales Cmn pour bloquer le passage ionique. Lorsque Cmn a été incorporé à C169 en Kir2.1 exprimé dans les cellules HEK, til résultante mutant Kir2.1 était inactif , mais est devenu actif sur une courte pule de la lumière, ce qui confirme le développement de PIRK succès ^21.

L' expression efficace de l'ARNt synthétase orthogonale et est essentielle pour obtenir un rendement élevé d'incorporation Uaa dans des cellules in vivo. Le gène de synthétase orthogonale est exprimé efficacement en utilisant la polymérase II de promoteur et des signaux poly-A souvent utilisés dans les cellules et les neurones de mammifères. Pour l' expression de l'ARNt orthogonal, d' un type 3 polymérase III promoteur spécial, tel que le promoteur H1 utilisé ici, conjointement avec une séquence flanquante en 3 'sont nécessaires , comme décrit précédemment ^18,20. Pour les études in vivo, nous avons constaté que trois copies de la cassette d'expression ARNt augmenté Cmn efficacité d'incorporation par rapport à une copie (figure 5A). Dans une autre étude dans les cellules de mammifères, ce qui augmente le nombre de ARNt cassette d'expression a également augmenté l' efficacité Uaa incorporation ^30. Thervant, nous vous suggérons d'optimiser le nombre de ARNt cassettes d'expression pour différents Uaas, des cellules et des protéines cibles lorsque Uaa efficacité d'incorporation doit être améliorée. Biodisponibilité de Uaas dans les cellules et in vivo est un autre facteur critique pour Uaa incorporation. Des études antérieures ont montré que l' estérification de Uaas augmente leur absorption dans les cellules de mammifères ^31, et que la préparation des Uaas sous forme de dipeptide augmente Uaa absorption dans des cellules Caenorhabditis elegans ^32. Nous avons constaté que l' alimentation directement Cmn aux milieux de culture neuronale est suffisante pour Cmn incorporation dans Kir2.1 exprimé dans les neurones primaires en culture, mais insuffisante pour l' incorporation dans le cerveau de souris in vivo ^21. Par conséquent, le dipeptide Cmn-Ala a été synthétisé et injecté dans le cerveau de la souris. Oligopeptide transporteur PEPT2 est fortement exprimé dans le cerveau de rongeurs ^33, ce qui peut faciliter le transport du dipeptide dans les neurones. Le dipe intérioriséptide serait hydrolysé par peptidases cellulaires pour obtenir le Uaa Cmn pour l'incorporation. En effet, avec cette optimisation nous avons atteint efficace incorporation Cmn en protéines neuronales à de multiples régions du cerveau de souris embryonnaires, y compris le néocortex, le thalamus et l' hypothalamus ^21.

expression PIRK réussie dans les neurones dépend fortement de la préparation de la culture neuronale saine. Chaque étape du protocole doit être effectué d'une manière précise et méticuleuse. Après la préparation de la culture, il est préférable de maintenir la culture dans l'incubateur sans perturbation. Ouverture et fermeture de la porte de l'incubateur, ainsi que le déplacement de la boîte de culture dans et hors de l'incubateur, peut ajouter jusqu'à porter atteinte à la qualité de la culture. la température d'incubation inférieure (35 ° C au lieu de 37 ° C) permet de réduire l'excitotoxicité. Sur une note similaire, Ca-P transfection doit être fait avec prudence. Préparation de tampon 2x BBS est une étape critique. Il est une bonne idée de calibrer le pH optimal pour le tampon 2x BBS entre pH 6,90 à 7,15, étant donné que de nouvelles constructions d'ADN ou préparations peuvent modifier les conditions de transfection. Le pH du tampon peut être ajusté avec précision à 0,01 chiffres si elle permet d'obtenir des résultats cohérents. Avant la transfection, les milieux de culture neuronale de croissance est remplacé par un nouveau. Il est crucial pour sauver les médias de croissance d'origine, et rajouter à la culture après transfection pour restaurer l'état d'origine. Le maintien de la culture des neurones dans des milieux frais après transfection interférerait avec les neurones de la récupération, car il manque des molécules clés pour la prolifération des cellules telles que les facteurs de croissance libérés par les neurones.

Pour l'activation de la lumière PIRK dans des cellules cultivées et des tranches de tissu, source de lumière appropriée et le mode de livraison doivent être déterminées. Cmn absorbe les lumières UV ondes longues et moyennes (280-400 nm). Toutefois, l'exposition à la lumière UV étendue, en particulier à la lumière UV plus courte longueur d'onde, serait préjudiciable aux cellules. Au same temps, la lumière rouge lointain pourrait chauffer l'échantillon perturbant les cellules. Par conséquent, une LED avec une émission unique longueur d'onde est la meilleure pour l'activation de PIRK. Pour Cmn photolyse, une LED avec une émission de 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) a été sélectionné. La LED est externe installé à proximité du microscope, et une fibre optique est utilisée pour fournir de la lumière précisément au neurone au point. Pour l'acquisition des données reproductibles, la fibre optique est installée à une distance de 1 cm à un angle du neurone au point 45 °. Puissance lumineuse à l'échantillon a été mesurée à 40 mW / cm ^2. Il est également recommandé de vérifier périodiquement la performance LED à l'aide d'un compteur de puissance optique.

Nous démontrons que électroporation in utero est une technique efficace pour incorporer génétiquement Uaas in vivo. In utero électroporation d'ADN plasmidique dans le néocortex embryonnaire de la souris est effectuée comme décrit précédemment ^34, avec des modifications mineures. Pour exprimer des protéines de Pirk dans neonatal cerveaux de souris, deux interventions chirurgicales sont nécessaires (Figure 5B). La première étape consiste à injecter des constructions de gènes pour l'expression de PIRK suivie par électroporation. Deux jours plus tard, la deuxième injection du cerveau est effectuée pour fournir Cmn-Ala. Il faudrait la pratique d'effectuer efficacement les chirurgies sans stresser les animaux trop. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux doivent être soignés et contrôlés sur une base régulière tout au long de la reprise. disponibilité suffisante et en temps opportun des Cmn dans le cerveau est essentiel pour l'expression correcte de PIRK. 2-5 pi de Cmn-Ala (500 mM) est généralement injecté à un cerveau embryonnaire. Parfois, il aide à injecter Cmn-Ala dans le ventricule à la fois sur l'électroporation et l'hémisphère opposé, depuis Cmn-Ala du côté opposé diffuserait sur le côté électroporation pour l'alimentation Cmn prolongée. En considérant l' utilité générale d'électroporation in utero, cette technique pourrait être appliquée non seulement aux neurones du néocortex , mais aussi pour les neuronesdans d'autres régions du cerveau telles que le striatum, diencéphale, et le cervelet, lorsque électroporation / site d'injection est ajustée pour chaque région. cerveaux embryonnaires / néonatales sont beaucoup plus doux que le cerveau adulte, de sorte qu'il serait difficile d'obtenir des tranches aiguës pour des expériences d'électrophysiologie. plongement Agarose aide à stabiliser la structure du cerveau embryonnaire pour vibratome coupe. Bien que faible point de fusion d'agarose minimise le choc de la température dans les tissus du cerveau, la prudence est nécessaire lors de la coulée fondue agarose sur des cerveaux froids. L'effet de choc thermique au tissu de plongement agarose était indécelable pendant tout l'enregistrement de la cellule.

Génétiquement codant Uaas photosensible dans les neurones en culture et in vivo, illustrée par PIRK ici, fournira une technique optogenetic pour contrôler diverses activités de protéines neuronales avec la lumière dans leur environnement naturel. Le protocole actuel présente une procédure étape par étape pour effectuer l'expression de PIRK et d'activation des expériences in culture neuronale in vitro et dans le cerveau de rongeurs in vivo, ce qui représente le premier succès du développement du système Uaa pour une utilisation dans le cerveau des mammifères. Il a le potentiel de profit de la recherche de nombreuses protéines naturelles, ainsi que leur implication dans les maladies. Par exemple, les α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) des récepteurs et des N-méthyl-D-aspartate (NMDA) partagent des structures transmembranaires similaires avec des canaux Kir2.1. Il serait donc possible d'appliquer la méthodologie de PIRK à ces canaux ioniques ligand-dépendants. En outre, la technique de PIRK pourrait également être utilisé pour traiter la pathophysiologie des maladies génétiques liées Kir2.1, tels que le syndrome d'Andersen et le syndrome du QT court cardiaque ^35,36. En plus de "bloquer et relâcher» Cys via CMN, de multiples acides aminés tels que la tyrosine, la sérine, la lysine, le glutamate, l' aspartate et la glycine ont été mis en cage avec différents groupes photoreleasable ^37. Ainsi, des stratégies similaires peuvent être utiliserd pour la photo-réguler ces acides aminés dans les neurones in vitro et in vivo. En outre, un contrôle optique réversible peut être réalisé avec l' azobenzène contenant Uaas, et de telles Uaas ont été codés génétiquement dans E. coli et des cellules de mammifères ^38,39.

En résumé, ce protocole présente une méthode générale pour contrôler l'activité des protéines neuronales dans leurs milieux d'origine avec la lumière. En comparaison à d'autres méthodes optogénétiques impliquant opsin-famille et d'autres protéines de lumière ou des domaines sensibles, cette méthode utilise génétiquement codée Uaas sensible à la lumière et les changements d'un seul résidu. Par conséquent, elle devrait avoir un minimum d'interférence à la fonction, de la traite et la localisation de la protéine cible à l'étude. site sélectivité élevée peut également être obtenue avec ces Uaas sensibles à la lumière génétiquement codés pour fournir une plus grande flexibilité et une spécificité pour la recherche moléculaire détaillée. Ce protocole prévoit également la première comprehensive, facile à suivre la procédure comment intégrer avec succès Uaas en protéines dans les neurones in vitro et in vivo. Contrôle optique de protéines générales par codé génétiquement Uaas dans les neurones in vitro et in vivo a un grand potentiel pour bénéficier la science fondamentale et translationnelle, et ce protocole aiderait à promouvoir son application.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm	Carolina Biologicals	633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine	Corning Discovery Labware	354210
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769
Iris Spatula-curved	Fine Science Tool	10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip	Fine Science Tool	10056-12
GlutaMAX-I Supplement	Life Technologies	35050-061
MITO+ Serum Extender	BD Biosciences	355006
Falcon 40 µm Cell Strainer	Corning Life Sciences	352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)	Sigma-Aldrich	B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385	Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade	Promega	V2111