Introduction
Em comparação com a estimulação elétrica convencional, fotoestimulação oferece maior resolução temporal e espacial com a mínima interferência no sistema fisiológico das amostras. Desde a demonstração do uso de lasers para estimular neurônios em 1971 1, muitas maneiras criativas foram inventados para controlar exogenamente atividade neuronal com a luz. Libertação óptica de agonistas photocaged tem sido muito utilizado para estudar a resposta fisiológica da rede neuronal para ligandos 2,3,4. Esta técnica tem limitado especificidade devido à difusão de agonistas enjaulados. Especificidade genética é conseguido por ectopicamente que expressam canais de opsina sensíveis à luz e bombas de 5,6,7, e que tem sido aplicado com sucesso para modular redes neuronais seleccionadas em diversos organismos modelo. No entanto, seria difícil de aplicar este método para controlar opticamente várias outras proteínas neuronais, uma vez que enxertia photoresponsiveness das proteínas a outras proteínas opsina acolherá-D necessitam de engenharia intenso que podem alterar as características naturais da proteína em estudo. Quimicamente amarrar um ligando fotossensível exógeno a uma proteína demonstrou uma outra maneira de controlar a funcionalidade de proteínas de canal 8,9,10. O ligando é apresentado ou retirado do local de ligação da proteína através da foto-isomerização da porção azobenzeno. Partilha química limita a aplicação, principalmente, para o lado extracelular de proteínas de membrana, excluindo o lado intracelular e proteínas intracelulares.
Fotossensíveis UAAS, depois de ter sido incorporada em proteínas, fornecer uma estratégia geral para manipular proteínas com luz. Em esforços iniciais, tRNAs quimicamente acilados com UAAS photocaged receberam microinjeções em oócitos de Xenopus para incorporar as UAAS em receptores de membrana e canais iônicos 11, que têm avançado a compreensão de suas relações estrutura-função 12,13,14.Esta abordagem microinjeção é limitado principalmente para grandes oócitos. Incorporação genética de uma Uaa ignora o desafio técnico tRNA acilação e microinjecção usando um par ARNt / sintetase ortogonal, que incorpora SAU através da tradução de proteína endógena em células vivas 15,16,17,18. Uaa incorporação proteínas neuronais tem sido demonstrada em neurónios primárias e células estaminais neurais 19,20. Mais recentemente, fotossensíveis Uaa foi geneticamente incorporada uma proteína neuronal no cérebro de mamíferos, in vivo, pela primeira vez 21. Estes avanços tornam possível estudar proteínas neuronais com UAAS no seu ambiente celular nativo.
Interiormente retificação do canal de potássio Kir2.1 é um forte retificador que passa K + correntes mais facilmente em que para fora da célula, e é essencial na regulação de processos fisiológicos incluindo excitabilidade das células, tônus vascular, a frequência cardíaca, refluxo sal nal e insulina liberar 22. A sobre-expressão de Kir2.1 hiperpolariza o potencial de membrana do neurónio-alvo, que se torna menos excitável 23,24. Para controlar opticamente Kir2.1 nas suas células nativas, Kang et ai. Geneticamente incorporou um Uaa foto-sensível em Kir2.1 expresso em células de mamíferos, os neurónios e cérebro do rato embriónica 21. Uma breve pulso de luz foi capaz de converter o EAU em um aminoácido natural Cys, activando assim a proteína Kir2.1 alvo. Quando esta proteína de canal de foto-indutível interiormente rectificação de potássio (Pirk) foi expresso em neurónios primários do hipocampo do rato, que suprimiu o disparo neuronal em resposta à activação de luz. Além disso, o canal Pirk foi expressa no neocórtex de rato embrionário, e a corrente activado pela luz Pirk em neurónios corticais foi medida. A implementação bem sucedida da tecnologia Uaa in vivo no cérebro de mamíferos abre a porta para controlar opticamente proteínas neuronaisno seu ambiente nativo, o que permitirá dissecção óptico dos processos e mecanismos neuronais, a nível molecular.
Neste protocolo, descrevemos os procedimentos para a constituição genética de UAAS em neurônios primários na cultura e no cérebro do rato embrionário in vivo. O fotossensíveis Uaa CMN e Kir2.1 são utilizados para ilustrar o processo. Métodos para avaliar bem-sucedida incorporação Uaa e controle óptico da actividade da proteína neuronal são fornecidos. Este protocolo fornece um guia claro para codificar geneticamente UAAS em neurônios e in vivo, e para a regulação opticamente função da proteína neuronal através de um Uaa fotossensíveis. Esperamos que este protocolo para facilitar a adoção da tecnologia in vivo Uaa para a neurociência e estudos biológicos optogenética.
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Protocol
Todos os procedimentos do presente estudo foram realizadas utilizando Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) aprovou protocolos para lidar com os animais no Instituto Salk para Estudos Biológicos, La Jolla, CA.
Uaa 1. Incorporação em Kir2.1 e Expressão da resultante Pirk na cultura neuronal primária
- DNA Construção
- Selecione um local alvo de Kir2.1 relativamente à SAU incorporação. Explorar o conhecimento prévio e informações sobre a estrutura e função de Kir2.1, de modo que o local escolhido com o fotossensíveis Uaa Incorporated permite a modulação da função óptica Kir2.1 21.
- Construir um gene de codificação de ADN recombinante Kir2.1 com o local escolhido mutado para o codão de paragem TAG âmbar. Use as técnicas de clonagem convencionais 25 para clonar o ADN Kir2.1-TAG num plasmídeo de expressão de mamífero.
- genes / sintetase Clone tRNA que são específicos para a SAU e incorporar SAU em resposta ao codão de paragem TAG em outro plasmídeo de expressão de mamífero 21.
Nota: Para incorporação óptima Uaa, diferentes promotores e combinações de cassetes de genes (para ARNt, sintetase, e Kir2.1) podem ser testados em diferentes plasmídeos. - Obter DNAs de plasmídeos de alta qualidade usando miniprep ou maxiprep kits comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Cerca de 1,9 do rácio 260/280 é óptima para o ADN purificado. Quando necessário, realizar uma eletroforese em gel de agarose para verificar a pureza do DNA preparado 25. DNAs de plasmídeos super-enrolados com elevado grau de pureza são os melhores para transfecção neuronal.
- Cultura Rat neurônios do hipocampo primária
- lamelas lugar de vidro (círculos, de 12 mm de diâmetro) em placas de 24 poços, uma lamela em cada poço, e revestimento de cada poço com 250 pL de 0,5 mg / ml de poli-D-lisina (em 100 mM de tampão de borato: 1,24 g bórico ácido e 1,90 g de tetraborato de sódio em 400 ml de s ionizada destilada H2O ou 2 DDH
- No dia da dissecção, coletar cérebros neonatais de filhotes de ratos pós-natal (1-4 dias pós-parto), depois de anestesiar-los com isoflurano e decapitar. Anestesiar as crias numa câmara contendo anestesiados com isoflurano (2-4%). Espere até que eles perdem a consciência e deixar de responder a estímulos tácteis e beliscar das patas.
- Usando a técnica de padrão 26, dissecar hipocampo do cérebro em quente (~ 37 ° C), solução salina (HEPES a 10 mM e D-glicose 20 mM adicionado em solução salina equilibrada de Hank), e recolher hipocampos num tubo cónico de 4,5 ml de solução salina morna .
- Adicionar 500 uL de 2,5% de tripsina para o hipocampo (0,25% de concentração final de tripsina), e incubar durante 10 min num banho de água a 37 ° C.
- Enxaguar minuciosamente o tecido com solução salina (3 x 10 ml) e triturado.
- Recuperar os neurônios dissociados em 1 ml wmeios de crescimento braço contendo Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS), mM de D-glucose 21,2, 2 mM de L-glutamina, 2% de B-27, e 0,1% de diluição de soro.
Nota: Adicionar L-glutamina e B-27, no dia da dissecção para preparar o meio de crescimento fresco. - Contagem de neurónios com um hemocitómetro, e placa-los em lamelas em placas de 24 poços a 1,0-1,5 x 10 5 células / poço densidade com 500 ul de meio de crescimento depois de filtrada através de uma malha de nylon de 40? M.
- Incubar a cultura neuronal, a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar humidif içado, durante incubadora 2-3 semanas. Para obter o melhor resultado, evitar perturbar a cultura, tanto quanto possível durante a incubação.
- O fosfato de cálcio (Ca-P) Transfecção de Cultura neuronal primária
- Fazer soluções de reserva e armazenar a 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hidroxi-etil] -2-aminoetanossulfónico ácido) tampão (10x); 150 mM de Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M de NaCl (10x); DDH estéril 2 O; estéril de NaOH 1 N.
- No dia da transfecção, fazer fresco M de solução 2,5 CaCl 2 em ddH2O e filtro esterilizado com filtro de 0,22 um. Adicione fresco 2x BES-salino tamponado (BBS) tampão contendo BES 50 mM, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, e NaCl 280 mM a pH 7,00 (ajustar o pH com NaOH) e com o filtro estéril de 0,22 um filtro.
Nota: Calcular a quantidade de solução de CaCl2 e o tampão BBS, dependendo do número de lamelas a ser transfectada. Também olhar para 1.3.4. - Substituir o meio de crescimento de cultura com 500 meios de crescimento transfecção pré-aquecido ul fresco. (Meio de transfecção pode ser feita com MEM mais mM de D-glicose 21,2).
Nota: Não descarte a mídia. - Calcular a quantidade de ddH2O e preparar para adicionar, a fim de fazer a solução de transfecção (33 ul por cada lamela) contendo 1,65 mL de CaCl 2, 0,7 ug de ADN, e de 16,5 &# 181; l 2x BBS.
- Preparar a solução de transfecção imediatamente antes de o adicionar à cultura. Para se preparar, em primeiro lugar combinar CaCl 2 e ddH2O, enquanto lentamente agitando o tubo. Continuar a agitação e adiciona-se lentamente a solução de DNA em. Por último, adicione tampão 2x BBS gota a gota com agitação.
- Imediatamente adicionar 30 ul da solução de transfecção para cada lamela de cultura neuronal.
- Balance o prato de cultura de algumas vezes para misturar a solução e incubar a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar humidificado incubadora durante 45 min-1 h. Depois de neurónios são incubadas com a solução de transfecção, muito finos precipitados de Ca-P iria formar uma camada de cobertura neurónios.
- Substituir o meio de transfecção com 500 ul de pré-aquecido tampão de lavagem (NaCl 135 mM, HEPES 20 mM, KCl a 4 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de glucose a pH 7.3, esterilizado filtrada com filtro de 0,22 um) e incubar a 356; C numa atmosfera de 5% de CO2: 95% de ar incubador humidificado durante 15-20 min. precipitados Ca-P desapareceria após a etapa de lavagem.
- Substitua o tampão de lavagem com 500 mL de meio de crescimento fresco. Mais uma vez, substituir o meio de crescimento com a mídia original salvo.
- Adicionar SAU Cmn (pré-misturado em 50 ul de mídia crescimento quente) à cultura para chegar a 1 mM de concentração final.
- Incubar a cultura transf ectadas a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar humidificado durante 12-48 incubadora horas antes dos ensaios.
- Gravação de células inteiras com fotoativação
- Preparar soluções extra / intracelular. A solução intracelular contém gluconato de potássio 135 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM, ATP 2 K 2,56, e 0,3 mM de Li 2 GTP a pH 7,4. A solução de registo extracelular contém NaCl 150 mM, KCl 3 mM, MgCl 2 5 mM, CaCl 2 0,5 mM, glucose a 5 mM e HEPES 10 mM a pH 7,4.
- Instalar um díodo emissor de luz (LED), com emissão de 385 nm pelo microscópio na plataforma para fornecer luz para o ponto focal de 1 cm de distância em um ângulo de 45 °. Verifique a potência do LED com um medidor de energia de luz.
- Puxe pipetas de patch a partir de eletrodos de vidro usando um extrator micropipeta comercial para ter 3-6 mohms resistência pipeta. Siga as instruções do fabricante para configurar o extrator micropipeta.
- Para testar a resistência pipeta, primeiro encher a pipeta com a solução intracelular e posicioná-lo no suporte de eléctrodo. Mergulhar o pipeta em uma placa de cultura de 35 milímetros preenchido com a solução extracelular, colocado no microscópio Platform. Mergulhe um eletrodo terra no prato para completar o circuito.
- Ligue o amplificador / digitalizador e iniciar um programa de aquisição de dados. Monitorar a resistência da pipeta com um protocolo de teste da membrana.
- Retire uma lamela do neurónio cultura do incubador e lavar uma vez na solução extracelular. Usando graxa de vácuo, mantenha pressionada a lamela no meio de uma placa de cultura 35 milímetros cheio com a solução extracelular fresco.
- Coloque a lamela / prato na plataforma eletrofisiologia microscópio.
- Usando as técnicas de patch de fixação padrão, remendar um neurônio com mCitrine fluorescência 27. actividade neuronal registro usando pinça de corrente (I-clamp) método. Em primeiro lugar, ajustar o potencial de repouso de -72 mV em torno através da injecção de uma pequena corrente. Em seguida, injetar uma corrente passo (10-200 pA) para induzir disparo contínuo (5-15 Hz) dos potenciais de ação.
- Manualmente, ou usar o software de aquisição de dados, piscar um pulso (um pecadogle pulso de 100 ms-1 s de duração) da luz LED para o neurônio durante a gravação, e ver se os potenciais de ação são afetados.
- Adicionar BaCl 0,5 mM 2 para o banho e verificar se os potenciais de ação são recuperados.
2. Incorporação Uaa em Kir2.1 e Expressão da Pirk resultante no Rato In Vivo cérebro embrionário
- DNA Construção
- Design o DNA de plasmídeo de forma semelhante como no passo 1.1. Para a expressão, in vivo, utilizar um promotor forte tal como o CAG (promotor da beta-actina de galinha com CMV).
- Purifica-se o ADN com um kit comercial maxiprep isento de endotoxinas de acordo com o protocolo do fabricante. Realizar a extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol 25 para adquirir ADN qualidade extremamente elevada (condensado de 2-5 ug / uL).
- In Utero Eletroporação à embrionárias de camundongos Neocortex
Nota: O techni básicathat para in utero electroporação foi descrito anteriormente 28.- Anestesiar um ratinho grávida cronometrado no dia embrionário 14,5 (E14.5) com pentobarbital sódico (injecção intraperitoneal, 50 ug por grama de peso corporal) ou isoflurano (inalação, 2-4%). Monitorização da profundidade anestésica, verificando perda de consciência e nenhuma resposta a estímulos tácteis e beliscar das patas.
- Fazer uma pequena incisão na linha média abdominal. Gentilmente expor os cornos uterinos com uma pinça e pontas dos dedos.
- Injectar solução cerca de 1 uL de ADN (2-5 ug / mL de cada plasmídeo, dependendo da construção) no ventrículo lateral de cada ninhada com uma pipeta de vidro introduzido através da parede uterina. Na maioria dos casos, cerca de 60-80% dos embriões totais são injectados.
- Electroporate os embriões com um electroporator (33-35 V, 50 mseg de duração, 950 intervalo de milissegundos, 4-8 pulsos).
- Devolver os cornos uterinos à cavidade abdominal suavemente com aceps e pontas dos dedos. Sutura parede muscular e, em seguida, a pele com sutura cirúrgica para permitir que os embriões para continuar o desenvolvimento.
- SAU microinjeção
- Fazer uma pequena incisão na linha média abdominal novamente em E16.5, e suavemente expor as trompas uterinas com uma pinça e alcance.
- Injectar cerca de 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) para o lado a electroporação ou ambos os lados do ventrículo lateral, com uma pipeta de vidro introduzido através da parede uterina. Para aumentar Cmn biodisponibilidade, utilize o dipeptídeo Cmn-Ala (CMN-alanina) para entregar Cmn in vivo 21.
- Mais uma vez, retornar os cornos uterinos à cavidade abdominal suavemente com uma pinça e pontas dos dedos. Sutura parede muscular e, em seguida, a pele com sutura cirúrgica para permitir que os embriões para continuar o desenvolvimento.
- Obter aguda fatias do cérebro do
- Adicione 1 L de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1,3 mM, CaCl 2,5 mM
- Tome 200 ml ACSF e rápido por congelação a -80 ° C durante 20-30 min. Bolha o resto de ACSF com 5% de CO2: 95% de gás O2 à temperatura ambiente.
- Preparar e esterilizar instrumentos cirúrgicos para colher os cérebros dos embriões. Também prepare um balde de gelo.
- Adicione ~ solução de agarose de baixo ponto de fusão de 100 ml de 4% num balão por aquecimento num forno de microondas. Arrefecer solução para cerca de 5 minutos antes de começar a solidificar.
- Eutanásia do hr rato 12-24 após Cmn-Ala injecção de CO 2 overdose. Fazer grandes incisões na área abdominal, e dissecar os embriões / microinjetados electroporado do útero com uma tesoura fina e fórceps.
- cérebros colheita dos embriões com uma tesoura fina e fórceps.
- Coloque cada cérebro em uma placa de cultura de 10 centímetros colocados no balde de gelo. Dividir dois hemisférios usando uma lâmina afiada, e colocar cadahemisfério no prato com o plano sagital mediano tocar no fundo do prato. Rapidamente despeje sobre a solução de agarose sobre cérebros (cerca de 500 ul por hemisfério).
- Usando uma lâmina afiada, quadrado cortar a agarose em torno de um cérebro para fazer um bloco de agarose-embedded cérebro.
- Usando cola de tecido, cola para baixo a superfície plano sagital médio do bloco de agarose em uma montagem para vibratome. Encha a câmara vibratome com ACSF pré-refrigerados e cortar 200 mm fatias de cérebro sagital.
- Incubar fatias agudas em ACSF suplementado com 3 mM de inositol mio, ácido ascórbico 0,4 mM e piruvato de sódio 2 mM a 33 ° C durante 42 min enquanto se fazia borbulhar com 5% de CO2: 95% de gás O2.
- Após 42 min, desligue o aquecedor e continuar a incubar as fatias à temperatura ambiente com borbulhante. Iniciar a gravação de patch-célula inteira, pelo menos, 15 minutos após desligar o aquecedor.
- Adicione 1 L de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1,3 mM, CaCl 2,5 mM
- Gravação de células inteiras com fotoativação
- Prepare o INTRACellular solução contendo gluconato de potássio 130 mM, MgCl 2 4 mM, HEPES 5 mM, EGTA 1,1 mM, 3,4 mM de Na 2 ATP, fosfato de creatina de sódio 10 mM, e 0,1 mM de Na 3 GTP a pH 7,3 ajustado com KOH.
- Puxe pipetas de patch a partir de eletrodos de vidro usando um extrator micropipeta comercial para ter 3-6 mohms resistência pipeta.
- Configurar o equipamento eletrofisiologia fatia para fixação de patch de células inteiras e superfuse a câmara de gravação com ACSF a 2 mL / min taxa com uma bomba de perfusão. Ajustar a temperatura da câmara para cerca de 33 ° C.
Nota: O equipamento de fatia electrofisiologia está equipado com uma câmara de perfusão, uma objectiva de imersão em água e um controlador de temperatura. Além disso, o filtro GFP (excitação: 480/30 nm, emissão: 535/40 nm) e filtro de mCherry (excitação: 580/20 nm de emissão: 675/130 nm) são obrigatórios.- Instalar um LED com emissão de 385 nm pelo microscópio na plataforma para fornecer luz para o ponto focal a partir de 1 cm de distância em um 45 °ângulo. Verifique a potência do LED com um medidor de energia de luz.
- Cuidadosamente pegar uma fatia do cérebro com uma pipeta de vidro e coloque na câmara de perfusão. Mantenha pressionada a fatia com uma harpa.
- Remendar um neurônio com fluorescência mCherry / GFP da região neocortical 27. atividade Pirk registro usando braçadeira de tensão (V-clamp) método. Em primeiro lugar, têm o potencial de membrana de -60 mV. Então, as correntes recorde em potenciais fixos negativos membrana (-100 mV) ou rampas de tensão (-100 mV a +40 mV). Especificamente, Kir2.1 monitorizar correntes de entrada específicos a -100 mV.
- Manualmente, ou usar o software de aquisição de dados, piscar um pulso (um único pulso de 100 ms -1 duração seg) de luz LED para o neurônio durante a gravação, e ver se as proteínas Pirk são ativados. Uma vez Pirk é ativado, correntes de entrada em -100 mV aumentaria significativamente.
- Adicionar BaCl 0,5 mM 2 para o banho e verificar se Pirk é inativado novamente.
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Representative Results
Para incorporar um Uaa geneticamente para uma proteína em neurónios, o primeiro passo importante é a concepção de gene apropriado constrói para proporcionar e expressar genes de forma eficiente em neurónios. Há três componentes genéticos para Uaa incorporação: (1) o gene alvo com o codão de paragem TAG âmbar introduzido no local escolhido para Uaa incorporação (2) um ARNt ortogonal para reconhecer o codão de paragem TAG mutado, e (3) uma aminoacil ortogonal -tRNA sintetase de cobrar SAU para o ARNt ortogonal. Cada componente tem de ser conduzido pelo promotor apropriado. Estes três cassetes de genes podem ser incluídos em um plasmídeo ou separado em vários plasmídeos. Para expressar Pirk em neurônios, a foto-reativa Uaa Cmn é incorporada Kir2.1 usando as ortogonais tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA sintetase) par evoluiu para ser mais específico para a CMN 21,29. Resíduo Cys169 do gene Kir2.1 é mutado para o codão de paragem TAG âmbar (Kir2.1-TAG), e a proteína fluorescente mCitrine é fundido com o terminal C de Kir2.1 para visualizar a expressão de Pirk em cultura neuronal (Figura 1).
Obtenção de cultura neuronal de boa qualidade é um pré-requisito para as experiências bem-sucedidas Pirk. dia pós-natal 1-4 crias de rato Sprague Dawley são geralmente utilizados para a preparação de culturas neuronais, ainda embriões de ratazana são também utilizados frequentemente. Quando plaqueadas em lamelas em placas de 24 poços a 1,0-1,5 x 10 5 células / poço densidade, deve-se ver neurónios saudáveis bem separados com não muito microglia ou outros detritos (Figura 2A). Neurônios saudáveis têm processos extensas e corpos celulares (SOMA) são gordo (Figura 2B). Distintamente estrutura suborganelle visível é geralmente um sinal de cultura insalubre. Cultura neuronal pode ser mantida durante 2-3 semanas a 35 ° C em 5% de CO 2: 95% de ar incubadora humidificada.
Cfosfato alcium (Ca-P) transfecção é um método de transfecção muito suave apropriado para a cultura neuronal sensível. No entanto, requer extrema precisão e cautela para atingir alta eficiência de transfecção em neurônios. As soluções de reserva têm de ser armazenadas a 4 ° C, e misturou-se para fazer tampão BBS 2x no dia da transfecção. ajuste de pH precisa é a chave para obter reproducibly resultados bem sucedidos. O M solução 2,5 CaCl2 também deve ser feita no dia da transfecção. Todos os tampões devem ser filtrada. Além disso, os plasmídeos de ADN frescos com elevado grau de pureza e qualidade melhorar os resultados. Para melhores resultados, pode-se obter mini-preparada de ADN não frescas de cultura Escherichia coli coberto (~ 12 h a 37 ° C no incubador com agitação). Depois de todos os buffers estiver pronto, traga as soluções na capa de cultura de tecido e se preparar para transfecção. Usando um vórtice a baixa velocidade, agitar a solução durante a mistura de transfecção. Adicionar imediatamente a solução misturada à Cu neuronalLTURE, e trazer o prato de cultura de novo na incubadora. Pare o transfecção após 45 min-1 hr, e adicionar o meio de crescimento original de volta para a cultura para incubação contínua. Os neurónios transfectadas pode ser visualizada a partir de 6 horas após a transfecção é terminada (Figura 3). Na presença de Cmn nos meios de cultura, se expressa Pirk e neurónios que expressam Pirk são verde-fluorescente devido à proteína mCitrine fundida com a extremidade C-terminal de Pirk (Figura 3D). Neurônios que expressam Pirk têm fisiologia basal normal e eles são capazes de disparar potenciais de ação em resposta às correntes injectadas (Figura 4). No entanto, esta série de potenciais de ação é suprimida imediatamente com um pulso de luz breve brilhou para a célula (Figura 4A). Quando BaCl 2 0,5 mM, um inibidor específico Kir2.1, é adicionado ao banho, o disparo neuronal é então retomado, o que indica que a supressão anterior era devida à activação de Kir2.1 pela Light (Figura 4B). Neurónios de controlo não transfectadas não respondem à luz ou Ba 2+ (Figura 4C, D).
Para expressar Pirk in vivo, plasmídeos de ADN altamente puro e concentrado (2-5 mg / mL) deve ser preparado. Plasmídeos específicos utilizados nestas experiências são mostrados na Figura 5A. Além do par ARNt CUA Leu / CmnRS ortogonal e o gene Kir2.1-TAG-alvo, um gene que codifica a proteína verde fluorescente com uma mutação TAG (GFP-TAG) é também co-electroporadas, tal como um repórter fluorescente. A detecção de fluorescência de GFP indica a entrega bem sucedida de todas as três plasmídeos, já que a supressão TAG em GFP exigiria tanto o ARNt Leu CUA e os CmnRS; Cmn incorporação em GFP-TAG sugeriria cmn incorporação em Kir2.1-Tagas bem, porque ambos os genes estão presentes na mesma célula. Os três construções de genes são todos injected no ventrículo lateral de embriões de ratinho em E14.5 (Figura 5B, painel esquerdo). Após a electroporação, os embriões de regresso à cavidade abdominal para permitir que os embriões para continuar o desenvolvimento. Dois dias mais tarde, injectam cerca de 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) para o lado a electroporação ou ambos os lados do ventrículo lateral, de maneira semelhante, como a injecção de ADN (Figura 5B, painel do meio). Mais uma vez, retornar os embriões para a cavidade abdominal para o desenvolvimento contínuo. Os embriões podem ser colhidas em E17.5 para imagens ou ensaios eletrofisiológicos. Como esperado, apenas com injecção Cmn-Ala, células fluorescentes verdes são observados no neocórtex de rato. As células com fluorescência tanto vermelho e verde deveria ter Cmn incorporados em Kir2.1-TAG para fazer canais de Pirk (Figura 6A). a gravação de célula inteira a partir da fatia neocortical embrionário é feita de forma semelhante, como é feito em cultura neuronal. Os neurônios fluorescentes verdes e vermelhas têm nenhuma corrente para dentro na negativos potencial de realização, mas uma breve pulso de luz ativa rapidamente a corrente para dentro (Figura 6B). A corrente é completamente bloqueada pela adição de Ba2 +, confirmando que é gerado por Pirk.
Figura 1: Pirk conjunto plasmídeo de expressão para neurônio cultura Esquema mostrando projeto plasmídeo exemplar para a expressão Pirk em cultura neuronal.. Top plasmídeo codifica genes Kir2.1 (cinza) com uma mutação de um único aminoácido no local C169 sob citomegalovírus promotor (CMV). C169 é mutado para o codão de paragem TAG âmbar, onde SAU Cmn seria incorporado. gene Kir2.1 é seguido pelo gene mCitrine (verde). mCitrine é fundida com a extremidade C-terminal do gene Kir2.1 para visualizar as células que expressam Pirk. plasmídeo inferior codifica CmnRS (rosa), a sintetase específica Cmn, impulsionado pela quinase-1 promotor do mouse fosfoglicerato (mPGK). tRNA
Figura 2: Rat hipocampo cultura neuronal primária imagens exemplificativas que mostram ratos saudáveis culturas neuronais do hipocampo.. (A) Uma imagem DIC de cultura neuronal em 10 dias in vitro (DIV). Neurônios maduros como eles se ramificam dendritos e axônios. células microgliais (células pequenas e redondas, sem processos) coexistem, mas não sobrecarregar a cultura. (B) Uma imagem de neurônios cultivados saudáveis DIC ampliada. Um neurônio saudável exibe corpo da célula gorda (soma) e pronunciado dendritos / axônios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Pirk expressão em neurónios primários em cultura de DIC e imagens de fluorescência de neurónios do hipocampo de rato em cultura in vitro e transfectadas com construções de genes descritos na Figura 1 para a expressão Pirk. Quando Cmn não é adicionado na cultura após a transfecção (A e B), ausência de fluorescência verde é detectado a partir dos neurónios. Na presença da CMN (1 mM) no meio de crescimento, os neurônios transfectadas são capazes de expressar-metragens proteínas Pirk-mCitrine, mostrando assim fluorescência verde (C e D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4:. Activação Luz de Pirk suprime disparo de neurônios do hipocampo de ratos (A) Um pulso de luz única suprime a atividade do neurônio hipocampo expressar Pirk. vestígios de tensão representativos são registrados continuamente na corrente-clamp. Acção disparo potencial é evocado por 20 injecção de corrente de pA (I-passo). A exposição à luz (385 nm, 40 mW / cm2, 1 s, indicado com a seta) rápida e completamente suprime o disparo neuronal. Disparo é restaurado com extracelular BaCl mM 500 2, que inibe selectivamente canais Kir2.1. (B) de ultravioleta (UV) de iluminação (385 nm, 40 mW / cm 2, 6 seg; indicada com caixa amarela) não altera a excitabilidade de controlo, os neurónios não transfectadas. Acção disparo potencial é evocado por 50 injecção de corrente de pA (I-passo). (C e D) Nem iluminação UV ou BaCl2 (500 mM) afecta a excitabilidade de neurónios de controlo. potente açãoial é evocado por 50 injecção de corrente de pA (I-passo).
Figura 5: Procedimentos para a expressão Pirk no neocórtex de rato in vivo. (A) Pirk plasmídeo de expressão definido. Top plasmídeo: o plasmídeo para CmnRS conduzido pelo promotor de CAG e mCherry via entrada site ribossoma (IRES). mCherry fluorescência iria verificar a expressão bem sucedida de CmnRS. Plasmídeo Médio: o plasmídeo para o gene Kir2.1 juntamente com três cópias de tRNA Leu CUA, o ARNt ortogonal para a CMN incorporação 21. Plasmídeo inferior: o plasmídeo para GFP_Y182 TAG. O gene para GFP é projetada com um códon de terminação âmbar no local Tyr182 permissiva (GFP_Y182 TAG) para visualizar incorporação bem sucedida da CMN para TAG locais 21. (B) sho dos desenhos animadosala um procedimento experimental para a expressão in vivo Pirk. Construções de genes para a expressão Pirk são injectados no neocórtex de rato (E14.5) e electroporado no útero (painel da esquerda). Dois dias mais tarde, o CMN-Ala é injectado para o ventrículo no lado electroporação ou ambos os lados de hemisférios cerebrais (painel do meio). Fatia de imagem e ensaio electrofisiológico pode ser realizada em E17.5 E18.5-(painel da direita).
Figura 6: expressão Pirk no neocórtex do mouse e ativação de luz. Imagens (A) de fluorescência de rato neurônios corticais embrionárias mostrando a incorporação da CMN em GFP e proteínas Kir2.1 in vivo. Os três construções de genes na Figura 5a são electroporados no útero. mCherry fluorescência demonstra a expressão bem sucedida do Synthe específica Cmngene tase, CmnRS. GFP fluorescência é detectada apenas com injeção Cmn-Ala (em baixo), indicando Cmn incorporação nos TAG GFP e provavelmente incorporação Cmn no TAG Kir2.1. Assim, a fluorescência verde e vermelho indica expressão bem sucedida de todos os três plasmídeos e Cmn incorporação. (B) enredo IV de correntes gravados a partir de ratos neurônios neocorticais que mostram a ativação dependente da luz de Pirk. Dois dias após a construções de genes na Figura 5A foram electroporadas, Cmn-Ala foi injectada no útero; 12-48 h após a injecção de Cmn-Ala, fatias agudas neocorticais foram preparados a partir dos embriões. Neurônios em fatias, detectados por ambos fluorescência vermelha e verde Pirk-expressando, são registrados antes (preto) e depois (azul) a exposição à luz (385 nm, 8 mW / cm 2, 10 seg para a exposição saturada). BaCl2 (500 mM) é adicionado para verificar correntes específicas do Pirk depois de fotoactivação (laranja).
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Discussion
Para alcançar photo-modulação eficaz, o passo inicial importante é decidir onde a incorporar SAU fotossensíveis na proteína alvo. A informação estrutural e funcional da proteína alvo é muito útil para orientar a selecção de locais candidatos. Ao mesmo tempo, o efeito de regulação da luz iria determinar que o local é o mais adequado. Depois de escolher locais candidatos, é recomendável para testar os sítios em linhas celulares de mamíferos, tais como o rim embrionário humano (HEK) células de cultura e mais fácil manipulação, antes de prosseguir para os neurónios primários e in vivo. Para identificar um local para fotoactivação Kir2.1, vários locais ao longo da poro de Kir2.1 foram inicialmente testados em células HEK. C169 de Kir2.1 foi encontrado ideal, porque o tamanho dos poros Kir2.1 onde C169 reside é grande o suficiente para acomodar cadeias laterais Cmn mas pequena o suficiente para cadeias laterais CMN bloquear a passagem iônica. Quando Cmn foi incorporada na C169 em Kir2.1 expressa em células HEK, Tele resultante mutante Kir2.1 estava inativo, mas tornou-se activada quando ocorre um curto pule de luz, confirmando o desenvolvimento bem sucedido Pirk 21.
A expressão eficiente do ARNt ortogonal e sintetase é essencial para obter uma elevada eficiência de incorporação SAU de células e in vivo. O gene da sintetase ortogonal é eficientemente expresso utilizando um promotor de polimerase II e sinais de poli-A que muitas vezes usado em células de mamífero e neurónios. Para a expressão do ARNt ortogonal, um tipo especial de 3-polimerase III, o promotor, tais como o promotor H1 utilizado aqui, em conjunto com uma sequência flanqueante 3 'são necessárias, tal como descrito anteriormente 18,20. Para estudos in vivo, verificou-se que três cópias da cassete de expressão aumentada ARNt Cmn eficiência de incorporação comparado com uma cópia (Figura 5A). Em outro estudo em células de mamíferos, o aumento do número de cassete de expressão de ARNt também aumentou a eficácia de incorporação de 30 Uaa. Therntes, sugerimos a optimização do número de cassetes de expressão tRNA para diferentes UAAS, células e proteínas-alvo quando Uaa eficiência de incorporação precisa ser melhorado. Biodisponibilidade de UAAS nas células e in vivo é outro factor crítico relativamente à SAU incorporação. Estudos anteriores demonstraram que a esterificação de UAAS aumenta a sua absorção em células de mamífero 31, e que a preparação de UAAS na forma de dipéptido Uaa aumenta a absorção em células em Caenorhabditis elegans 32. Descobrimos que diretamente alimentando Cmn aos meios de cultura neuronal é suficiente para Cmn incorporação nos Kir2.1 expressa em neurônios primários cultivados, mas insuficiente para incorporação no cérebro do rato in vivo 21. Portanto, o dipéptido Cmn-Ala foi sintetizado e injectado no cérebro do rato. PEPT2 oligopéptido transportador é altamente expresso no cérebro de roedores 33, que podem facilitar o transporte do dipéptido-se em neurónios. O DIPE internalizadoptide seria hidrolisado por peptidases celulares para produzir SAU CMN para incorporação. Na verdade, com essa otimização conseguimos eficiente incorporação Cmn em proteínas neuronais em várias regiões do cérebro embrionário do rato, incluindo neocórtex, tálamo e hipotálamo 21.
expressão Pirk bem sucedido em neurônios depende fortemente da preparação da cultura neuronal saudável. Cada passo no protocolo deve ser realizada de uma maneira precisa e minuciosa. Após preparação de cultura, que é melhor para manter a cultura na incubadora, sem perturbação. Abrindo e fechando a porta da incubadora, bem como movendo-se da placa de cultura dentro e para fora da incubadora, pode adicionar-se a diminuir a qualidade da cultura. Baixa temperatura da incubadora (35 ° C em vez de 37 ° C) ajuda a reduzir a excitotoxicidade. Em uma nota similar, Ca-P transfecção deve ser feito com cuidado extra. Preparação de tampão de 2x BBS é um passo crítico. É uma boa idéia para Calibrate o pH ideal para o tampão 2x BBS entre pH 6,90-7,15, uma vez que novas construções de DNA ou preps poderia mudar as condições de transfecção. O pH pode ser ajustado com precisão para os 0,01 dígitos se isso ajudar a conseguir resultados consistentes. Antes da transfecção, o meio de crescimento de cultura neuronal é substituído com meio fresco. É crucial para salvar o meio de crescimento original, e adicionar de volta para a cultura após transfecção para restaurar a condição original. A manutenção de cultura neuronal em meio fresco após a transfecção iria interferir com a recuperação a partir de neurónios, uma vez que carece moléculas-chave para a proliferação celular, tais como factores de crescimento libertados a partir dos neurónios.
Para a ativação da luz de Pirk em células em cultura e fatias de tecido, fonte de luz adequada e método de entrega precisa ser determinado. CMN absorve luzes UV de onda longa e média (280-400 nm). No entanto, prolongado a exposição a luz UV, especialmente a luz UV de comprimento de onda mais curto, pode ser prejudicial para as células. No same tempo, a luz vermelha distante poderia aquecer a amostra perturbando as células. Portanto, um LED com uma emissão de comprimento de onda único é melhor para ativação Pirk. Para Cmn fotólise, um LED com emissão de 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) foi selecionado. O diodo emissor de luz está instalado externamente perto do microscópio, e uma fibra óptica é usada para proporcionar uma luz precisamente ao neurónio em foco. Para a aquisição de dados reprodutível, a fibra óptica está configurado 1 cm de distância em um ângulo a partir do neurónio em foco 45 °. De energia de luz na amostra foi medida de 40 mW / cm 2. Também é recomendado para verificar periodicamente o desempenho LED usando um medidor de potência óptica.
Demonstramos que no electroporação útero é uma técnica eficaz para incorporar UAAS geneticamente in vivo. Em electroporação útero de ADN plasmídicos para o neocórtex embrionário do rato é realizada como descrito anteriormente 34, com pequenas modificações. Para expressar proteínas Pirk em neonatal cérebro do rato, dois procedimentos cirúrgicos são necessários (Figura 5B). O primeiro passo é para injectar as construções de genes para a expressão Pirk seguido por electroporação. Dois dias mais tarde, a segunda injecção cérebro é executada para fornecer Cmn-Ala. Seria necessário prática para executar eficientemente cirurgias sem forçar os animais muito. Depois de cada cirurgia, os animais devem ser cuidadas e verificados em uma base regular ao longo da recuperação. disponibilidade suficiente e oportuna da CMN no cérebro é essencial para a expressão Pirk adequada. 2-5 ul da CMN-Ala (500 mM) é geralmente injectado a uma cérebro embrionário. Às vezes, ele ajuda a injectar Cmn-Ala no ventrículo em ambos os electroporado e o hemisfério oposto, desde Cmn-Ala a partir do lado oposto se difundiria para o lado electroporado para fornecimento Cmn estendida. Considerando utilidade geral de electroporação no útero, esta técnica poderia ser aplicada não só aos neurónios neocorticais, mas também para os neuróniosem outras regiões do cérebro tais como o estriado, diencéfalo, cerebelo e, quando o local / injecção electroporação é ajustado para cada região. cérebros embrionárias / neonatais são muito mais suaves do que cérebros adultos, por isso seria difícil de obter fatias aguda para experimentos de eletrofisiologia. incorporação de agarose ajuda a estabilizar a estrutura do cérebro embrionário para vibratome corte. Apesar de agarose de baixo ponto de fusão minimiza choque de temperatura para os tecidos cerebrais, é necessário cuidado ao derrame derretido agarose sobre cérebros frias. O efeito do choque térmico no tecido de incorporação de agarose era imperceptível durante toda a célula de gravação.
Geneticamente codificação fotossensíveis UAAS em neurônios cultivados e in vivo, exemplificado por Pirk aqui, vai pagar uma técnica optogenética para controlar várias atividades de proteínas neuronais com a luz em seu ambiente nativo. O protocolo atual apresenta um procedimento passo-a-passo para executar expressão Pirk e activação experiências iN cultura neuronal in vitro e em cérebros de roedores in vivo, o que representa o primeiro o desenvolvimento bem sucedido do sistema Uaa para uso em cérebros de mamíferos. Tem o potencial para beneficiar a pesquisa de muitas proteínas naturais, bem como a sua implicação em doenças. Por exemplo, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA) e receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) partilham estruturas transmembranares semelhantes com canais Kir2.1. Seria, portanto, possível aplicar metodologia Pirk a estes canais iónicos dependentes de ligandos. Além disso, a técnica Pirk também poderia ser utilizado para abordar a fisiopatologia das doenças genéticas relacionadas Kir2.1, como a síndrome de Andersen e síndrome cardíaca curta QT 35,36. Além de "bloqueio e de libertação" Cys via Cmn, vários aminoácidos, tais como tirosina, serina, lisina, glutamato, aspartato, e glicina foram engaiolados com diferentes grupos photoreleasable 37. Assim, estratégias semelhantes podem ser utilizaçãod para foto-regular estas aminoácidos de neurónios in vitro e in vivo. Além disso, o controlo óptico reversível pode ser conseguido com azobenzeno contendo UAAS, e tais UAAS já foram geneticamente codificado em E. coli e células de mamífero 38,39.
Em resumo, este protocolo representa um método geral para controlar a atividade das proteínas neuronais em seus ambientes nativos com a luz. Em comparação com outros métodos de optogenética envolvendo opsina-família e outros ligeiros proteínas sensíveis ou domínios, este método utiliza geneticamente codificado sensível à luz UAAS e alterações apenas um único resíduo. Portanto, ele deve ter o mínimo de interferência com a função, tráfico e localização da proteína-alvo em estudo. Site-alta selectividade também pode ser conseguido com estes UAAS luz-responsivo geneticamente codificados para proporcionar uma maior flexibilidade e especificidade para investigação molecular detalhada. Este protocolo também fornece a primeira comprehensive, fácil de seguir o procedimento como incorporar com sucesso UAAS em proteínas em neurônios in vitro e in vivo. Controle óptico de proteínas gerais através de UAAS geneticamente codificado em neurônios in vitro e in vivo tem um grande potencial para beneficiar a ciência básica e translacional, e este protocolo iria ajudar a promover a sua aplicação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 | |
| Dissecting Knife - Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 | |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 | |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 | |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | ||
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
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