Introduction
Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation bietet Photo größere zeitliche und räumliche Auflösung bei minimaler Störung des physiologischen Systems von Proben. Seit der Demonstration Laser mit Neuronen im Jahr 1971 1, viele kreative Möglichkeiten zu stimulieren erfunden worden exogen mit Licht neuronale Aktivität zu kontrollieren. Optische Freisetzung von photoaktivierbaren Agonisten ist seit langem verwendet worden , um Liganden 2,3,4 physiologische Antwort des neuronalen Netzes zu untersuchen. Diese Technik hat Spezifität begrenzt durch Diffusion von caged-Agonisten. Genetische Spezifität wird durch ektopisch exprimieren , lichtempfindliche Opsin Kanäle erreicht und Pumpen 5,6,7, und es wurde erfolgreich zu modulieren ausgewählte neuronale Netzwerke in verschiedenen Modellorganismen eingesetzt. Allerdings würde es schwierig sein, diese Methode anzuwenden, optisch auf verschiedene andere neuronale Proteine steuern, da Photoreaktivität von den Opsin Proteinen an andere Proteine Pfropfung would intensiv Engineering erfordern, die die natürlichen Eigenschaften des Proteins untersuchten verändern können. Chemisch Anbindehaltung ein exogener lichtempfindlichen Ligand an ein Protein einen anderen Weg , um die Funktionalität von Kanalproteinen 8,9,10 zu steuern unter Beweis gestellt hat. Der Ligand wird präsentiert oder von der Bindungsstelle des Proteins durch die Photoisomerisierung des Azobenzoleinheit zurückgezogen. Anbinden Chemie beschränkt die Anwendung vor allem auf der extrazellulären Seite der Membranproteine, mit Ausnahme der intrazellulären Seite und intrazellulären Proteinen.
Lichtempfindliche UAAs, nachdem sie in Proteine eingebaut werden, eine allgemeine Strategie Proteine mit Licht zu manipulieren. In frühen Bemühungen, tRNAs chemisch acyliert mit photoaktivierbaren UAAs in Xenopus - Oozyten mikroinjiziert wurden 11, die UAAs in Membranrezeptoren und Ionenkanäle zu integrieren , die das Verständnis ihrer Struktur-Funktionsbeziehungen 12,13,14 vorangebracht haben.Diese Mikroinjektions Ansatz ist vor allem auf große Eizellen begrenzt. Genetische Einbau eines Uaa umgeht die technisch anspruchsvolle tRNA Acylierung und die Mikroinjektion durch eine orthogonale tRNA / Synthetase - Paar verwenden, die die Uaa durch endogene Proteintranslation in lebenden Zellen 15,16,17,18 enthält. Uaa Einbau in neuronale Proteine wurde in primären Neuronen und neuronalen Stammzellen 19,20 demonstriert. In jüngerer Zeit wurde auf Licht ansprechende Uaa genetisch in ein neuronales Protein im Gehirn von Säugetieren in vivo zum ersten Mal 21 eingebaut. Diese Fortschritte ermöglichen es, neuronale Proteine mit UAAs in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren.
Einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal Kir2.1 ist ein starker Gleichrichter, der K + -Ströme mehr geht leicht in als aus der Zelle, und es ist wichtig bei der Regulierung der physiologischen Prozessen einschließlich Zell Erregbarkeit, Gefäßtonus, Herzfrequenz, renal Salzfluss und Insulinfreisetzung 22. Überexpression von Kir2.1 hyperpolarisiert die Membranpotential des Zielneurons, das weniger erregbar 23,24 wird. Optisch Kir2.1 in seiner nativen Zellen kontrollieren, Kang et al. Genetisch a photo-responsive Uaa in Kir2.1 inkorporiert in Säugerzellen exprimiert, Neuronen und embryonalen Maushirnen 21. Ein kurzer Lichtimpuls konnte die Uaa in einer natürlichen Aminosäure Cys, wodurch die Ziel Kir2.1-Protein aktivierenden zu konvertieren. Wenn diese fotoinduzierbaren einwärtsgleichrichtenden Kalium (PIRK) Kanalprotein in Ratten-Hippocampus primäre Neuronen exprimiert wurde, unterdrückt es neuronale Aktivität in Reaktion auf Lichtaktivierung. Außerdem wurde gemessen, die PIRK Kanal wurde in der embryonalen Maus Neocortex und das lichtaktivierte PIRK Strom in kortikalen Neuronen exprimiert. Die erfolgreiche Umsetzung der Uaa Technologie in vivo im Gehirn von Säugetieren öffnet die Tür zu optisch neuronale Proteine steuernin ihrer natürlichen Umgebung, die optische Präparation neuronaler Prozesse und Mechanismen auf molekularer Ebene ermöglichen.
In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur genetischen Einbau von UAAs in primäre Neuronen in der Kultur und in der embryonalen Gehirn der Maus in vivo. Die photoresponsive Uaa Cmn und Kir2.1 werden verwendet, um den Prozess zu veranschaulichen. Methoden erfolgreich Uaa Einbau und optische Kontrolle der neuronalen Proteinaktivität sind vorgesehen, um beurteilen zu können. Dieses Protokoll stellt eine klare Anleitung zur genetisch kodierend UAAs in Neuronen und in vivo und in optisch neuronale Proteinfunktion über eine auf Licht ansprechende Uaa regulieren. Wir erwarten , dass dieses Protokoll , um die Annahme der in vivo Uaa Technologie für Neurowissenschaften und optogenetische biologische Untersuchungen zu erleichtern.
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Protocol
Alle Verfahren in der aktuellen Studie wurden unter Verwendung von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt Protokolle für die Behandlung der Tiere für biologische Studien, La Jolla, CA am Salk Institute genehmigt
1. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des resultierenden PIRK in den Primary Neuronal Culture
- DNA-Konstruktion
- Wählen Sie eine Zielstelle von Kir2.1 für Uaa Einbau. Exploit vor Wissen und Informationen über Struktur und Funktion von Kir2.1, so dass der gewählte Standort mit dem photoresponsive Uaa Incorporated ermöglicht eine optische Modulation von Kir2.1 - Funktion 21.
- Konstruieren Sie eine rekombinante DNA, die für Kir2.1-Gen mit dem gewählten Standort der TAG-Amber-Stopcodon mutiert. Verwenden Sie die Standard - Klonierungstechniken 25 der Kir2.1-TAG - DNA in einem Säugetier - Expressionsplasmid zu klonen.
- Clone tRNA / Synthetase-Gene, die für die Uaa spezifisch sind und übernehmen die Uaa als Reaktion aufdas TAG - Stopcodon in ein anderes Säugetier - Expressionsplasmids 21.
Anmerkung: Für optimale Uaa Inkorporation unterschiedliche Promotoren und Kombinationen von Genkassetten (für tRNA-Synthetase und Kir2.1) können in verschiedenen Plasmiden getestet werden. - Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA unter Verwendung von Miniprep oder Maxipräp kommerzielle Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers. Etwa 1,9 des 260/280 Verhältnis ist optimal für die gereinigte DNA. Wenn nötig, führen Sie eine Agarose - Gelelektrophorese 25 Reinheit der prepped DNA zu überprüfen. Supercoiled Plasmid-DNA mit hoher Reinheit sind am besten für die neuronale Transfektion.
- Kultur Ratten-Hippocampus Primary Neurons
- Platz Glasplättchen (Kreise, 12 mm Durchmesser) in 24-Well-Platten, ein Deckglas auf jede Vertiefung und jede Schicht gut mit 250 ul von 0,5 mg / ml Poly-D-Lysin (in 100 mM Boratpuffer: 1,24 g Borsäure Säure und 1,90 g Natriumtetraborat in 400 ml H 2 O oder ddH 2 destilliertes deionisiertes
- Am Tag der Dissektion, sammeln neonatalen Gehirn von postnatalen Rattenjungen (1-4 postnatalen Tag), nachdem sie mit Isofluran und enthaupten anesthetizing. Anesthetize die Welpen in einer anesthetization Kammer mit Isofluran (2-4%). Warten Sie, bis sie das Bewusstsein verlieren und nicht auf taktile Reize zu reagieren und der Pfoten zu kneifen.
- Unter Verwendung der Standardtechnik 26, sezieren Hippocampi aus dem Gehirn in warmer (~ 37 ° C) Kochsalzlösung (10 mM HEPES und 20 mM D-Glucose zugesetzt in Hanks balanced salt solution), und sammeln Hippocampi in einem konischen Röhrchen mit 4,5 ml warmem saline .
- Hinzufügen 500 ul 2,5% Trypsin in die Hippocampi (0,25% Trypsin endgültige Konzentration), und inkubiere für 10 min in einem Wasserbad bei 37 ° C.
- Spülen Sie das Gewebe mit einer Kochsalzlösung (3 x 10 ml) und verreiben.
- Recover die dissoziierten Neuronen in 1 ml wArm Nährmedien Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) enthält, 21,2 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 2% B-27 und 0,1% Serum-Extender.
Hinweis: In L-Glutamin und B-27 am Tag der Dissektion frischen Wachstumsmedien herzustellen. - Zähle die Neuronen mit einem Hämozytometer und Platten sie auf Deckgläschen in 24-Well - Platten bei 1,0-1,5 x 10 5 Zellen / well Dichte mit 500 & mgr; l Wachstumsmedium , nachdem es durch einen 40 um Nylon - Mesh filtriert.
- Inkubiere die neuronale Kultur bei 35 ° C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 2-3 Wochen. Für das beste Ergebnis zu vermeiden, so viel wie möglich während der Inkubation der Kultur zu stören.
- Calciumphosphat (Ca-P) Transfektion von primären neuronalen Kultur
- Make - Stammlösungen und lagern bei 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -Bis [2-Hydroxy-ethyl] -2-aminoethansulfonsäure) Puffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); sterile ddH 2 O; steril 1 N NaOH.
- Am Tag der Transfektion machen frisch 2,5 M CaCl 2 -Lösung in ddH 2 O und Sterilfilter mit 0,22 & mgr; m - Filter. Machen frisch 2x BES-gepufferter Salzlösung (BBS) Puffer, der 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4 und 280 mM NaCl bei pH 7,00 (pH - Einstellung mit NaOH) und Sterilfilter mit 0,22 & mgr; m - Filter.
Hinweis: Berechne die Menge an CaCl & sub2 ; -Lösung und BBS - Puffer für die Anzahl der Deckplättchen je transfiziert werden. Schauen Sie auch bei 1.3.4. - Ersetzen Sie das Kulturwachstumsmedium mit 500 & mgr; l frisch Transfektion Wachstumsmedien vorgewärmten. (Transfektionsmedien mit MEM und 21,2 mM D-Glucose hergestellt werden).
Hinweis: Verwenden Sie nicht das alte Medien wegwerfen. - Berechnen Sie die Menge von ddH 2 O und Vorbereitung zu geben, um die Transfektion Lösung (33 & mgr; l pro jedes Deckglas) mit 1,65 ul CaCl 2, 0,7 ug DNA zu machen, und 16,5 &# 181; l 2x BBS.
- Bereiten Sie die Transfektionslösung, unmittelbar bevor es zu der Kultur hinzugefügt wird. Zur Vorbereitung ersten CaCl 2 und ddH 2 O verbinden , während sie langsam das Rohr gerührt. Weiter Rühren und langsam DNA in die Lösung hinzufügen. Schließlich fügen Sie 2x BBS-Puffer tropfenweise unter Rühren.
- Sofort 30 ul der Lösung in jedes Deckglas neuronaler Kultur Transfektion hinzuzufügen.
- Rock the Kulturschale ein paar Mal die Lösung zu mischen und bei 35 ° C in einem 5% CO 2 inkubieren: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 45 min-1 Std. Nach Neuronen mit der Transfektion Lösung inkubiert werden, sehr feine Ca-P-Ausscheidungen würde eine Schicht bedeckt Neuronen bilden.
- Ersetzen die Transfektionsmedium mit 500 & mgr; l vorgewärmten Waschpuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM Glucose bei pH 7,3, sterile bei 35 gefiltert mit 0,22 & mgr; m-Filter) und Inkubation6; C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 15-20 min. Ca-P-Ausscheidungen würden nach dem Waschschritt verschwinden.
- Ersetzen Sie den Waschpuffer mit 500 ul frischem Wachstumsmedium. Auch das Wachstumsmedium mit dem gespeicherten Original-Medien ersetzen.
- Fügen Sie die Uaa Cmn (vorgemischt in 50 & mgr; l warme Wachstumsmedien) zu der Kultur 1 mM Endkonzentration zu erreichen.
- Inkubieren der transfizierten Kultur bei 35 ° C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 12-48 h vor Assays.
- Ganze Zelle Aufnahme mit Lichtaktivierung
- Bereiten Sie extra / intrazellulären Lösungen. Die intrazelluläre Lösung enthält 135 mM Kaliumgluconat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP und 0,3 mM GTP Li 2 bei pH 7,4. Die extrazelluläre Aufzeichnungslösung enthält 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 10 mM HEPES bei pH 7,4.
- Installieren einer Leuchtdiode (LED) mit Emission von 385 nm durch das Mikroskop an der rig Licht von 1 cm entfernt in einem Winkel von 45 ° auf den Brennpunkt zu liefern. Überprüfen Sie die Leistung der LED mit einer Lichtleistungsmesser.
- Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaselektroden einen kommerziellen Mikropipette Abzieher 3-6 MOhm Pipette Beständigkeit aufweisen. Folgen Sie Anweisungen des Herstellers der Mikropipette Puller einzurichten.
- Um zu testen, Pipette Widerstand, füllen Sie zuerst die Pipette mit der intrazellulären Lösung und positionieren Sie es auf dem Elektrodenhalter. Tauchen Sie die Pipette in eine 35-mm-Kulturschale mit der extrazellulären Lösung gefüllt ist, platziert auf dem Mikroskop platform. Tauchen eine Masseelektrode in die Schale, eine Schaltung zu vervollständigen.
- Schalten Sie den Verstärker / Digitalisierer und eine Datenerfassungs-Software starten. Monitor-Pipette Widerstand mit einem Membran-Testprotokoll.
- Nehmen Sie ein Deckglas des Neurons Kultur aus dem Inkubator heraus und spülen Sie einmal in der extrazellulären Lösung. Mit Vakuumfett, halten Sie das Deckglas in der Mitte einer 35 mm Kulturschale mit dem frischen extrazellulären Lösung gefüllt.
- Legen Sie das Deckglas / Schale auf dem Elektro Mikroskop-Plattform.
- Unter Verwendung der Standard - Patch - Clamp - Techniken, Patch ein Neuron mit mCitrine Fluoreszenz 27. Nehmen Sie die neuronale Aktivität mit Stromzange (I-Klemme) -Methode. Zuerst stellen Sie die Ruhepotential auf etwa -72 mV durch einen kleinen Strom zu injizieren. Dann einen Schritt Strom (10-200 pA) injizieren Dauerfeuer (5-15 Hz) der Aktionspotentiale zu induzieren.
- Manuell oder die Datenerfassungssoftware verwenden, einen Impuls (a sin blinkengle Puls sec Dauer 100 ms -1) der LED mit dem Neuron Licht während der Aufnahme, und sehen , ob Aktionspotentiale betroffen sind.
- In 0,5 mM BaCl 2 in das Bad und überprüfen , ob Aktionspotentiale gewonnen werden.
2. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des Resultierende PIRK in der embryonalen Maus - Gehirn - In Vivo
- DNA-Konstruktion
- Entwerfen Sie die Plasmid-DNA in ähnlicher Weise wie in Schritt 1.1. Für in - vivo - Expression, einen starken Promotor wie CAG (Huhn beta-Aktin - Promotor mit CMV - Enhancer) verwenden.
- Reinige DNA mit einer Endotoxin-freien maxiprep kommerziellen Kit nach dem Protokoll des Herstellers. Führen Phenol-Chloroform - Extraktion , gefolgt von Ethanolfällung 25 zu erwerben , extrem hohe Qualität DNA (kondensiert 2-5 ug / ul).
- In Utero Elektroporation zur embryonalen Maus - Neocortex
Hinweis: Die grundlegende technique für in utero Elektroporation wurde zuvor 28 beschrieben.- Anesthetize eine zeitlich schwangere Maus am embryonalen Tag 14,5 (E14,5) mit Natriumpentobarbital (intraperitoneale Injektion, 50 ug pro Körpergewicht Gramm) oder Isofluran (Inhalation, 2-4%). Überwachung der Narkosetiefe durch Verlust des Bewusstseins Überprüfung und keine Reaktion auf taktile Reize und Quetschen der Pfoten.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchmittellinie. aussetzen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und Fingerspitzen.
- Injizieren etwa 1 & mgr; l DNA-Lösung (2-5 ug / ul jedes Plasmids, abhängig von dem Konstrukt) in den lateralen Ventrikel jedes littermate mit einer Glaspipette durch die Gebärmutterwand eingeführt. In den meisten Fällen werden etwa 60-80% der gesamten Embryos injiziert.
- Elektroporation die Embryonen mit einem -Elektroporator (33-35 V, 50 ms Dauer, 950 ms Intervall, 4-8 Pulse).
- Rückgabe der Uterushörner in die Bauchhöhle leicht mit fürCEPS und Fingerspitzen. Nähen Sie die Muskelwand und dann die Haut mit chirurgischem Naht zu ermöglichen, die Embryonen Entwicklung fortzusetzen.
- Uaa Mikroinjektions
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchmittellinie wieder an E16.5 und sanft die Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und Fingerspitzen aus.
- Injizieren etwa 2-5 & mgr; l Cmn-Ala (500 mM) zu dem elektroporierten Seite oder beiden Seiten des lateralen Ventrikels mit einer Glaspipette durch die Gebärmutterwand eingeführt. Cmn Bioverfügbarkeit, verwenden Sie das Dipeptid Cmn-Ala (CMN-Alanin) Zur Erhöhung der Cmn 21 in vivo zu liefern.
- Auch hier geben die Gebärmutterhörner in die Bauchhöhle vorsichtig mit einer Pinzette und Fingerspitzen. Nähen Sie die Muskelwand und dann die Haut mit chirurgischem Naht zu ermöglichen, die Embryonen Entwicklung fortzusetzen.
- Erhalten Akute Hirnschnitten
- Machen Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) , enthaltend 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl
- Nehmen Sie 200 ml ACSF und Schnellgefrier bei -80 ° C für 20-30 min. Bubble der Rest ACSF mit 5% CO 2: 95% O & sub2 ; -Gas bei Raumtemperatur.
- Vorbereiten und chirurgische Werkzeuge sterilisieren Gehirne von den Embryonen zu ernten. Auch einen Eimer mit Eis vorzubereiten.
- Machen Sie ~ 100 ml 4% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Lösung in einem Kolben durch Erhitzen in einer Mikrowelle. Das Abkühlen der Lösung für ca. 5 Minuten, bevor es zu erstarren beginnt.
- Euthanize die Maus 12-24 Stunden nach Cmn-Ala Injektion von CO 2 Überdosierung. Machen Sie große Einschnitte in der Bauchbereich und sezieren aus die elektroporierten / mikroinjiziert Embryonen aus der Gebärmutter mit einer feinen Schere und Pinzette.
- Ernte Gehirne von den Embryonen mit einer feinen Schere und Pinzette.
- Legen Sie jedes Gehirn auf einer 10 cm Kulturschale auf dem Eis Eimer gelegt. Teilen Sie zwei Hemisphären eine scharfe Klinge, und legen Sie jeweilsHalbkugel auf der Schale mit der Medianebene der Boden der Schale berührt. Schnell die Agarose-Lösung über Gehirne übergießen (ca. 500 & mgr; l pro Hemisphäre).
- Mit einem scharfen Messer, schneiden Quadrat der Agarose um ein Gehirn ein Gehirn-embedded Agaroseblock zu machen.
- Mit Gewebekleber, kleben Sie die Midsagittalebene Oberfläche des Agaroseblock an einer Halterung für Vibratom. Füllen Sie die Vibratom Kammer mit vorgekühlten ACSF und schneiden 200 um sagittalen Hirnschnitten.
- Inkubieren Scheiben in acute ACSF mit 3 mM myo - Inositol ergänzt, 0,4 mM Ascorbinsäure und 2 mM Natriumpyruvat bei 33 ° C für 42 min , während sie mit 5% CO 2 sprudelnden: 95% O & sub2 ; -Gas.
- Nach 42 min, drehen Sie die Heizung und weiter zu brüten die Scheiben bei Raumtemperatur mit sprudelnden ab. Beginnen whole-cell Patch Aufzeichnung mindestens 15 min, nachdem die Heizung abgeschaltet wird.
- Machen Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) , enthaltend 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl
- Ganze Zelle Aufnahme mit Lichtaktivierung
- Bereiten Sie die intraczellulären Lösung , enthaltend 130 mM Kaliumgluconat, 4 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM Natriumkreatinphosphat und 0,1 mM Na 3 GTP bei pH 7,3 mit KOH eingestellt.
- Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaselektroden einen kommerziellen Mikropipette Abzieher 3-6 MOhm Pipette Beständigkeit aufweisen.
- Stellen Sie die Scheibe Elektro Rig für Ganzzell-Patch-Clamping und superfuse die Aufnahmekammer mit ACSF bei 2 ml / min Rate mit einer Perfusions-Pumpe. Passen Sie die Raumtemperatur auf etwa 33 ° C.
Hinweis: Die Scheibe Elektro rig ist mit einer Perfusionskammer ausgestattet, einem Wasserimmersionsobjektiv und einem Temperaturregler. Auch GFP-Filter (Anregung: 480/30 nm, Emission: 535/40 nm) und mCherry Filter (Anregung: 580/20 nm-Emission: 675/130 nm) erforderlich.- Installieren Sie eine LED mit Emission von 385 nm durch das Mikroskop auf der Bohrinsel im 45 ° von 1 cm entfernt Licht auf den Brennpunkt zu liefernWinkel. Überprüfen Sie die Leistung der LED mit einer Lichtleistungsmesser.
- Pick vorsichtig ein Gehirn Scheibe mit einer Glaspipette und in der Perfusionskammer auf. Halten Sie die Scheibe mit einer Harfe nach unten.
- Patch Ein Neuron mit mCherry / GFP - Fluoreszenz aus dem Neokortex Bereich 27. Nehmen Sie PIRK Aktivität voltage clamp mit (V-Klemme) -Methode. Erstens halten das Membranpotential bei -60 mV. Dann Rekordströme an festen negativen Membranpotentialen (-100 mV) oder Spannungsrampen (-100 mV bis +40 mV). Insbesondere überwachen Kir2.1 spezifische Einwärtsströme bei -100 mV.
- Manuell oder die Datenerfassungssoftware verwenden, blinken einen Impuls (einen einzigen Impuls von sec Dauer 100 ms -1) von LED - Licht auf das Neuron während der Aufnahme, und sehen , ob PIRK Proteine aktiviert werden. Sobald PIRK aktiviert ist, würde Einwärtsströme bei -100 mV deutlich erhöhen.
- In 0,5 mM BaCl 2 in das Bad und überprüfen , ob PIRK wieder inaktiviert wird.
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Representative Results
Um genetisch eine Uaa in ein Protein in den Nervenzellen übernehmen, ist der erste wichtige Schritt ist, entsprechende Gen zu entwerfen die Gene zu liefern und zu exprimieren effizient in Neuronen. Es gibt drei genetische Komponenten für Uaa Einarbeitung: (1) das Ziel-Gen mit dem TAG amber Stop-Codon an der gewählten Stelle eingeführt für Uaa Einbau (2) eine orthogonale tRNA, die das mutierte TAG Stopcodon, und (3) eine orthogonale Aminoacyl zu erkennen -tRNA Synthetase die Uaa auf die orthogonale tRNA aufzuladen. Jede Komponente benötigt, die in geeigneten Promotor angetrieben werden. Diese drei Genkassetten kann in einem Plasmid oder getrennt in mehreren Plasmiden enthalten sein. Unter Verwendung der orthogonalen tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA - Synthetase) Paar für die CMN 21,29 spezifisch zu sein entwickelte sich zu äußern PIRK in Neuronen, die photoreaktiven Uaa CMN in Kir2.1 eingebaut. Der Rest Cys169 von Kir2.1-Gen wird auf das TAG-Amber-Stopp-Codon (Kir2 mutiert.1-TAG) und das fluoreszierende Protein mCitrine an den C-Terminus von Kir2.1 fusioniert ist PIRK Expression in neuronalen Kultur (1) zu visualisieren.
gute Qualität neuronale Kultur zu erhalten ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche PIRK Experimente. Postnatalen Tag 1-4 Sprague Dawley Ratten-Jungen sind für neuronale Kultur Vorbereitung im Allgemeinen verwendet, noch Rattenembryonen werden ebenfalls häufig verwendet. Wenn auf Deckgläser plattiert in 24-Well - Platten bei 1,0 bis 1,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung Dichte, sollte man mit nicht zu viel Mikroglia oder andere Verunreinigungen (2A) gut getrennten gesunden Neuronen zu sehen. Gesunde Neuronen haben umfangreiche Prozesse und Zellkörper (Soma) sind plump (2B). Unverwechselbar sichtbar suborganelle Struktur ist in der Regel ein Zeichen für ungesunde Kultur. 95% Luft befeuchteten Inkubator: Neuronal Kultur kann für 2-3 Wochen bei 35 ° C in 5% CO 2 gehalten werden.
Calcium Phosphat (Ca-P) Transfektion ist eine sehr sanfte Transfektionsverfahren geeignet für empfindliche neuronale Kultur. Es erfordert jedoch extreme Präzision und Vorsicht hohe Transfektionseffizienz in Neuronen zu erzielen. Vorratslösungen müssen bei 4 ° C gelagert werden, und gemischt, um 2x BBS-Puffer am Tag der Transfektion zu machen. Präzise pH-Einstellung ist der Schlüssel zu reproduzierbar erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Die 2,5 M CaCl 2 -Lösung sollte auch frisch am Tag der Transfektion durchgeführt werden. Alle Puffer müssen gefiltert werden. Darüber hinaus frische DNA-Plasmide mit hoher Reinheit und Qualität zu verbessern, die Ergebnisse. Die besten Ergebnisse erzielen, kann man frische DNA Mini-prepped erhalten von nicht bewachsen Escherichia coli - Kultur (~ 12 Stunden bei 37 ° C im Schüttelinkubator). Nachdem alle Puffer bereit sind, bringen die Lösungen in der Kultur Haube Gewebe und für die Transfektion vorzubereiten. Unter Verwendung eines Vortex bei einer niedrigen Geschwindigkeit, agitieren die Transfektionseffizienz Lösung unter Mischen. Sofort im die gemischte Lösung auf die neuronale culture, und bringen die Kulturschale zurück in den Inkubator. Stoppen Sie die Transfektion nach 45 min-1 h, und fügen Sie für die kontinuierliche Inkubation zur Kultur zurück, um den ursprünglichen Wachstumsmedien. Die transfizierten Neuronen von 6 Stunden nach der Transfektion sichtbar gemacht werden , beendet wird (Abbildung 3). In Gegenwart von Cmn in den Kulturmedien wird PIRK exprimiert und PIRK-exprimierenden Neuronen sind grün-fluoreszierendes aufgrund der mCitrine Protein fusioniert an den C-Terminus von PIRK (Abbildung 3D). PIRK-exprimierenden Neuronen haben normale basal Physiologie und sie sind in der Lage Abfeuern Aktionspotentialen als Reaktion auf injizierte Ströme (Abbildung 4). Jedoch ist diese Reihe von Aktionspotentialen sofort mit einem kurzen Lichtimpuls an die Zelle (4A) leuchtete unterdrückt. Wenn 0,5 mM BaCl 2, ein Kir2.1 spezifischer Inhibitor, dem Bad zugesetzt wird, wird die neuronale Feuern wieder aufgenommen , dann, was darauf hinweist , dass die vorherige Unterdrückung durch die l auf die Aktivierung des Kir2.1 zurückzuführenight (4B). Untransfizierten Kontroll Neuronen reagieren nicht auf das Licht oder Ba 2+ (4C, D).
Um PIRK in vivo, hochreinen und konzentrierte DNA - Plasmide (2-5 ug / ul) exprimieren sollten darauf vorbereitet sein. Spezifische Plasmide in diesen Experimenten verwendet werden , in 5A gezeigt. Zusätzlich zu der orthogonalen tRNA Leu CUA / CmnRS Paar und dem Ziel Kir2.1-TAG - Gen, ein Gen kodierend grün fluoreszierendes Protein mit einer Mutation TAG (GFP-TAG) ist auch co-elektroporiert als fluoreszierender Reporter. Der Nachweis von GFP - Fluoreszenz würde die erfolgreiche Lieferung aller drei Plasmide zeigen, da TAG Unterdrückung in GFP würde die tRNA Leu CUA beide erfordern und die CmnRS; CMN Einbau in GFP-TAG würde Cmn Einbau in Kir2.1-Tagas vorschlagen gut, da beide Gene in der gleichen Zelle sind. Die drei Genkonstrukte sind alle injected in den lateralen Ventrikel von Mausembryonen auf E14.5 (5B, links). Nach der Elektroporation, kehren die Embryonen in die Bauchhöhle die Embryonen zu ermöglichen Entwicklung fortzusetzen. Zwei Tage später injizieren etwa 2-5 & mgr; l Cmn-Ala (500 mM) zu dem elektroporierten Seite oder auf beiden Seiten der lateralen Ventrikel, in gleicher Weise wie DNA - Injektion (5B, mittleres Feld). Auch hier geben die Embryonen in die Bauchhöhle für eine kontinuierliche Entwicklung. Die Embryonen können sich auf E17.5 für die Bildgebung oder elektro Assays geerntet werden. Wie erwartet, nur mit Cmn-Ala-Injektion werden grün fluoreszierende Zellen in der Maus Neocortex beobachtet. Die Zellen mit den beiden roten und grünen Fluoreszenz hätte Cmn in Kir2.1-TAG eingebaut PIRK Kanäle (6A) zu machen. Whole-cell recording aus dem embryonalen neokortikalen Scheibe wird in ähnlicher Weise durchgeführt, wie es auf die neuronale Kultur durchgeführt wird. Die grünen und roten Fluoreszenz-Neuronen haben keine nach innen gerichteten Strom an negative Haltepotential, aber ein kurzer Lichtimpuls aktiviert schnell die nach innen gerichteten Strom (6B). Der Strom wird durch Zugabe von Ba 2+ vollständig blockiert, was bestätigt , dass es durch PIRK erzeugt wird.
Abbildung 1: PIRK Expressionsplasmid Satz für Neuron Kultur Scheme exemplarischen Plasmid - Design für PIRK Expression in neuronalen Kultur zeigt.. Top-Plasmid kodiert für Kir2.1-Gen (grau) mit einer einzigen Aminosäure-Mutation in C169-Website unter Cytomegalovirus (CMV) Promotor. C169 ist mit dem TAG-Amber-Stopcodon mutiert, wobei die Uaa Cmn eingebaut werden würde. Kir2.1-Gen wird durch mCitrine Gen (grün) gefolgt. mCitrine ist mit dem C-Terminus des Kir2.1-Gens fusioniert PIRK exprimierenden Zellen sichtbar zu machen. Bottom-Plasmid kodiert CmnRS (pink), CMN spezifische Synthetase, angetrieben durch die Maus Phosphoglyceratkinase-1 (mPGK) Promotor. tRNA
Abbildung 2: Ratten - Hippocampus primären neuronalen Kultur Exemplarische Bilder gesunden Ratten - Hippocampus neuronale Kulturen.. (A) A DIC Bild neuronaler Kultur von 10 Tagen in vitro (DIV). Neurone reifen, wie sie Dendriten und Axone verzweigen. Mikroglia-Zellen (kleine und runde Zellen ohne Prozesse) koexistieren, aber nicht überwältigen die Kultur. (B) Eine vergrößerte DIC Bild von gesunden kultivierten Neuronen. Eine gesunde Neuron zeigt plump Zellkörper (Soma) und ausgeprägte Dendriten / Axone. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 3: PIRK Expression in kultivierten primären Neuronen DIC und Fluoreszenzbilder von Ratten - Hippokampus - Neuronen in vitro kultiviert und transfiziert mit Genkonstrukte in Figur 1 für PIRK Ausdruck dargestellt. Wenn Cmn nicht in der Kultur nach der Transfektion (A und B) hinzugefügt wird , wird keine grüne Fluoreszenz von den Neuronen nachgewiesen. In voller Länge PIRK-mCitrine Proteine in Gegenwart von Cmn (1 mM) im Wachstumsmedium, transfizierten Neuronen sind in der Lage zum Ausdruck zu bringen, so dass grüne Fluoreszenz (C und D) zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abb . 4: Die Lichtaktivierung von PIRK unterdrückt von Ratten - Hippocampus - Neuronen feuern (A) Ein einzelner Lichtimpuls unterdrückt Aktivität des Hippocampus exprimiert PIRK. Repräsentative Spannungs Spuren werden kontinuierlich in Strom-Clamp aufgezeichnet. Aktionspotential das Brennen von 20 pA Stromeinspeisung (I-Schritt) hervorgerufen. Belichtung (385 nm, 40 mW / cm 2, 1 sec; mit Pfeil angedeutet) , schnell und vollständig unterdrückt neuronale Feuern. Gebrannt wird mit extrazellulären 500 mM BaCl 2, wieder hergestellt , die Kir2.1 Kanäle selektiv hemmt. (B) Ultraviolett (UV) Beleuchtung (385 nm, 40 mW / cm 2, 6 sec; mit gelben Feld angezeigt wird ) , ändert nichts an Erregbarkeit der Kontrolle, nicht transfizierten Neuronen. Aktionspotential das Brennen von 50 pA Stromeinspeisung (I-Schritt) hervorgerufen. (C und D) Weder UV - Beleuchtung oder BaCl 2 (500 mM) wirkt Erregbarkeit Steuer Neuronen. Aktion potential wird von 50 pA Stromeinspeisung (I-Schritt) hervorgerufen.
Abbildung 5: Verfahren zur PIRK Expression in der Maus Neokortex in vivo. (A) PIRK Expressionsplasmid gesetzt. Top Plasmid: das Plasmid für CmnRS durch den CAG-Promotor und mCherry über interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) angetrieben. mCherry Fluoreszenz würde die erfolgreiche Expression von CmnRS überprüfen. Mittel Plasmid: das Plasmid für Kir2.1 - Gen gekoppelt mit drei Kopien von tRNA Leu CUA, die orthogonale tRNA für die CMN Einbau 21. Bottom - Plasmid: das Plasmid für GFP_Y182 TAG. Das Gen für GFP mit einem Amber - Stopcodon bei der permissiven Tyr182 Website (GFP_Y182 TAG) entwickelt , um erfolgreiche Integration von Cmn visualisieren Websites TAG 21. (B) Cartoon shoFlügel ein experimentelles Verfahren für PIRK Expression in vivo. Genkonstrukte für PIRK Ausdruck in die Maus Neokortex (E14.5) injiziert und durch Elektroporation in utero (linkes Bild). Zwei Tage später wird Cmn-Ala an den Ventrikel in der elektroporierten Seite oder auf beiden Seiten der zerebralen Hemisphären (Mitte) injiziert. Slice-Bildgebung und elektro Test kann auf E17.5-E18.5 (rechts) durchgeführt werden.
Abbildung 6: PIRK Expression in der Maus Neokortex und Lichtaktivierung. (A) Fluoreszenzbilder von embryonalen Maus - kortikalen Neuronen den Einbau von Cmn in GFP und Kir2.1 Proteine in vivo zeigt. Die drei Genkonstrukte in 5A sind in utero elektroporiert. mCherry Fluoreszenz zeigt die erfolgreiche Expression von CMN spezifischen synthetase Gen, CmnRS. GFP - Fluoreszenz ist nur mit Cmn-Ala - Injektion (unten), was anzeigt , Cmn Inkorporation in GFP TAG und wahrscheinlich Cmn Inkorporation in Kir2.1 TAG detektiert. So, grüne und rote Fluoreszenz zeigt die erfolgreiche Expression aller drei Plasmide und der CMN Einbau. (B) IV Plot von Strömen von Mäusen neokortikalen Neuronen zeigt lichtabhängige Aktivierung von PIRK aufgezeichnet. Zwei Tage nach der Genkonstrukte in 5A wurden elektroporiert, Cmn-Ala wurde in utero injiziert; 12-48 Stunden nach Cmn-Ala-Injektion, neokortikalen akuten Scheiben wurden aus den Embryonen hergestellt. PIRK-exprimierenden Neuronen in den Scheiben, sowohl rote und grüne Fluoreszenz detektiert werden vor (schwarz) aufgezeichnet und nach (blau) Belichtung (385 nm, 8 mW / cm 2, 10 sec für gesättigte Exposition). BaCl 2 (500 mM) wird zu PIRK spezifische Ströme nach Photoaktivierung (orange) zu überprüfen.
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Discussion
Um eine effektive Photomodulations erreichen, ist der erster wichtiger Schritt, um zu entscheiden, wo das Licht ansprechende Uaa in dem Zielprotein zu integrieren. Strukturelle und funktionelle Informationen des Zielproteins ist sehr hilfreich, um die Auswahl von Kandidaten Seiten zu führen. Zugleich würde der Zweck der Lichtregulierung bestimmen, welche Seite am besten geeignet ist. Nach der Auswahl von Kandidaten - Websites, empfehlen wir die Standorte in Säugetierzelllinien wie die menschliche embryonale Nieren (HEK - Zellen) für eine einfachere Kultur und Manipulation zu testen, bevor zu primären Neuronen und in vivo fortfahren. Um eine Site für Kir2.1 Photoaktivierungs, mehrere Standorte entlang der Pore von Kir2.1 identifizieren wurden in HEK-Zellen zunächst getestet. C169 von Kir2.1 wurde optimal gefunden, weil die Kir2.1 Porengröße in dem C169 groß genug befindet, ist Cmn Seitenketten, aber klein genug, um für die CMN Seitenketten Ionendurchgang zu blockieren aufzunehmen. Wenn Cmn bei C169 in Kir2.1 aufgenommen wurde in HEK-Zellen exprimiert, ter resultierenden mutierten Kir2.1 inaktiv war, wurde aber nach kurzer pule von Licht aktiviert und bestätigt erfolgreiche PIRK Entwicklung 21.
Effiziente Expression der orthogonale tRNA - Synthetase und ist kritisch hohe Uaa Einbaueffizienz in Zellen zu erhalten und in vivo. Die orthogonale Synthetase-Gen effizient II-Promotor und poly-A-Signale unter Verwendung von Polymerase häufig in Säugerzellen und Neuronen verwendet exprimiert. Zur Expression der orthogonalen tRNA, einem speziellen Typ-3 - Polymerase III - Promotor, wie der Promotor H1 hier zusammen mit einer 3'-flankierenden Sequenz verwendet werden benötigt , wie zuvor beschrieben 18,20. Für in - vivo - Studien haben wir festgestellt , dass drei Kopien der tRNA - Expressionskassette Cmn Einlagerungsleistung erhöhte sich im Vergleich zu einer Kopie (5A). In einer anderen Studie , in Säugetierzellen, die Anzahl der tRNA - Expressionskassette Erhöhung erhöht auch Uaa Einlagerungsleistung 30. Therefore, schlagen wir vor, die Optimierung der Anzahl der tRNA-Expressionskassetten für verschiedene UAAs, Zellen und Zielproteine bei Uaa Einbaueffizienz verbessert werden muss. Die Bioverfügbarkeit von UAAs in Zellen und in vivo ist ein weiterer entscheidender Faktor für Uaa Einbau. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Veresterung von UAAs erhöht ihre Aufnahme in Säugetierzellen 31 gezeigt, und dass die Herstellung von UAAs in dem Dipeptid Form erhöht Uaa Aufnahme in die Zellen in Caenorhabditis elegans 32. Wir fanden , dass direkt Cmn zu neuronalen Kulturmedien Einspeisen ausreichend ist für Cmn Inkorporation in Kir2.1 in kultivierten primären Neuronen exprimiert, aber nicht ausreichend für die Einarbeitung in das Gehirn der Maus in vivo 21. Daher wurde das Dipeptid Cmn-Ala synthetisiert und in das Gehirn der Maus injiziert. Oligopeptid - Transporter PEPT2 in Nagetier Gehirn 33, stark exprimiert , die den Transport des Dipeptid in Neuronen erleichtern können. Die internalisiert dipeptide würde durch zelluläre Peptidasen hydrolysiert werden, um die Uaa Cmn zur Einarbeitung zu erhalten. Tatsächlich mit dieser Optimierung erzielten wir effiziente Cmn Einbau in neuronale Proteine an mehreren Regionen des embryonalen Mäusegehirn, einschließlich Neocortex, Thalamus und Hypothalamus 21.
Erfolgreiche PIRK Expression in Neuronen hängt stark von der Herstellung von gesunden neuronalen Kultur. Jeder Schritt in dem Protokoll sollte in einer präzisen und sorgfältigen Art und Weise durchgeführt werden. Nach Kultur Vorbereitung, ist es am besten, die Kultur in den Inkubator ohne Störung aufrecht zu erhalten. Öffnung und der Inkubator Tür zu schließen, sowie die Kulturschale kann zu untergraben die Qualität der Kultur summieren sich in und aus dem Inkubator bewegt. Untere Inkubatortemperatur (35 ° C statt 37 ° C) hilft Exzitotoxizität reduzieren. Auf eine ähnliche Notiz, sollte Ca-P-Transfektion mit besonders vorsichtig erfolgen. Herstellung von 2x BBS-Puffer ist ein kritischer Schritt. Es ist eine gute Idee, caliBråte den optimalen pH-Wert für 2x BBS-Puffer zwischen pH 6,90-7,15, da neue DNA-Konstrukte oder Preps Transfektion Bedingungen ändern könnte. Der Puffer pH kann mit Präzision auf die Ziffern 0,01 eingestellt werden, wenn sie konsistente Ergebnisse zu erzielen hilft. Vor der Transfektion wird das Wachstumsmedium neuronaler Kultur mit frischem ersetzt. Es ist entscheidend, den ursprünglichen Wachstumsmedien zu speichern, und fügen Sie die Kultur nach der Transfektion den ursprünglichen Zustand wiederherzustellen zurück. Aufrechterhaltung neuron Kultur in frischem Medium nach der Transfektion würde stören Neuronen aus erholt, da es aus Neuronen Schlüsselmoleküle für die Zellproliferation, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren freigesetzt fehlt.
Für Lichtaktivierung von PIRK in kultivierten Zellen und Gewebeschnitten, brauchen richtige Lichtquelle und Liefermethode bestimmt werden. CMN absorbiert Lang- und Mittelwelle UV-Licht (280-400 nm). Jedoch Belichtung mit UV-Licht zu ergänzen, insbesondere für kürzere Wellenlänge UV-Licht, wäre schädlich für die Zellen. Am same Zeit könnte weit rotes Licht die Probe stören die Zellen erwärmen. Daher ist eine LED mit einer einzigen Wellenlänge Emission am besten für PIRK Aktivierung. Für die CMN Photolyse, eine LED mit Emission von 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) ausgewählt wurde. Die LED wird von außen in der Nähe des Mikroskops montiert, und eine optische Faser verwendet wird, Licht mit dem Neuron in Fokus genau zu liefern. Für reproduzierbare Datenerfassung wird die optische Faser 1 cm entfernt in einem Winkel von 45 ° von dem Neuron im Fokus einzurichten. Lichtleistung an der Probe gemessen wurde , 40 mW / cm 2. Es ist auch die LED-Leistung empfohlen, die Verwendung eines optischen Leistungsmesser in regelmäßigen Abständen überprüfen.
Wir zeigen , dass in utero Elektroporation ist eine effektive Technik , um genetisch UAAs in vivo einzubringen. In utero Elektroporation von Plasmid - DNA in die embryonale Maus Neocortex , wie beschrieben durchgeführt wird , 34 vorher, mit geringfügigen Modifikationen. Um auszudrücken PIRK Proteine in neonatal Gehirn der Maus, zwei chirurgische Eingriffe erforderlich sind (5B). Der erste Schritt ist Genkonstrukte für PIRK Expression durch Elektroporation gefolgt einzuspritzen. Zwei Tage später wurde die zweite Gehirn Einspritzung durchgeführt Cmn-Ala zu liefern. Es wäre Praxis erfordern proficiently Operationen durchführen, ohne die Tiere zu viel zu belasten. Nach jeder Operation sollten die Tiere nach und während der Erholung in regelmäßigen Abständen überprüft betrachtet werden. Eine ausreichende und rechtzeitige Verfügbarkeit von Cmn im Gehirn ist für die richtige PIRK Ausdruck von wesentlicher Bedeutung. 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) wird in der Regel zu einem embryonalen Gehirn injiziert. Manchmal hilft es, Cmn-Ala im Ventrikel sowohl auf der Elektroporation und der gegenüberliegenden Halbkugel, da Cmn-Ala von der gegenüberliegenden Seite zu der Seite elektroporiert für längere Cmn Versorgung würde diffundieren zu injizieren. Unter Berücksichtigung allgemeiner Nützlichkeit von in utero Elektroporation, könnte diese Technik angewendet werden , nicht nur auf neokortikalen Neuronen , sondern auch auf Neuronenin anderen Hirnregionen wie Striatum, Dienzephalon und Cerebellum, wenn Elektroporation / Injektionsstelle für jede Region angepasst wird. Embryonale / Neugeborenen-Gehirne sind viel weicher als erwachsenen Gehirn, so wäre es schwierig, akute Scheiben Experimente für die Elektro zu bekommen. Agarose Einbettung hilft, die embryonalen Hirnstruktur für Vibratom Schneiden stabilisieren. Obwohl mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose Temperaturschock zu Hirngewebe minimiert, Vorsicht ist geboten, wenn Agarose über kalte Gehirn geschmolzen Ausgießen. Die Wirkung von Temperaturschock auf das Gewebe aus Agarose Einbettung war während der ganzen Zelle Aufzeichnungs unnoticeable.
Genetisch kodierend photoresponsive UAAs in kultivierten Neuronen und in vivo, veranschaulicht durch PIRK hier wird eine optogenetische Technik leisten verschiedene neuronale Proteinaktivitäten mit Licht in ihrer natürlichen Umgebung zu steuern. Das aktuelle Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren PIRK Expression und Aktivierung Experimente i auszuführenn neuronale Kultur in vitro und in Nagetier Gehirn in vivo, die die erste erfolgreiche Entwicklung des Uaa Systems zur Verwendung in Säugetier Gehirne. Es hat das Potenzial der Forschung vieler natürlicher Proteine zu profitieren, sowie deren Auswirkungen in Krankheiten. Beispielsweise α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren und N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) -Rezeptoren haben ähnliche Strukturen mit Transmembran- Kir2.1 Kanälen. Es wäre daher möglich PIRK Methodik zu diesen Liganden-gesteuerte Ionenkanäle anzuwenden. Außerdem könnte PIRK Technik auch 35,36 die Pathophysiologie der Kir2.1 verwandten genetischen Krankheiten, wie Andersen-Syndrom und Herz kurze QT Syndrom ansprechen verwendet werden. Zusätzlich zu "Block-and-release" Cys über CMN mehrere Aminosäuren wie Tyrosin, Serin, Lysin, Glutamat, Aspartat und Glycin wurden mit verschiedenen Gruppen durch Licht 37 in Käfigen gehalten worden. Somit können ähnliche Strategien nützend auf photo regulieren diese Aminosäuren in Neuronen in vitro und in vivo. Darüber hinaus können reversible optische Kontrolle mit azobenzolhaltigen UAAs erreicht werden, und solche UAAs jetzt genetisch in E. codiert wurden , coli und Säugerzellen 38,39.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine allgemeine Methode, um die Aktivität neuronaler Proteine in ihrer nativen Einstellungen mit Licht zu steuern. Im Vergleich zu anderen optogenetische Methoden, bei denen Opsin-Familie und andere lichtempfindliche Proteine oder Domänen verwendet dieses Verfahren genetisch lichtempfindlichen UAAs und Änderungen codiert nur einen einzigen Rest. Daher sollte es minimale Interferenz mit der Funktion, den Handel und die Lokalisation des Zielproteins untersucht haben. Hohe Website-Selektivität kann auch mit diesen genetisch kodierten lichtreaktions UAAs erreicht werden, um mehr zu schaffen Flexibilität und Spezifität für die detaillierte molekulare Untersuchung. Dieses Protokoll liefert auch die erste comprehensive, einfach zu befolgende Verfahren , wie man erfolgreich UAAs in Proteine in Neuronen in vitro und in vivo einzubringen. Optische Kontrolle der allgemeinen Proteine über genetisch kodierte UAAs in Neuronen in vitro und in vivo hat ein großes Potenzial sowohl grundlegende und translationale Wissenschaft zu profitieren, und das Protokoll würde helfen , seine Anwendung zu fördern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 | |
| Dissecting Knife - Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 | |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 | |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 | |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | ||
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
References
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