Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optisk Kontroll av en neuronal Protein Ved hjelp av en genetisk kodet Unaturlig Amino Acid i nevroner

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

Sammenlignet med vanlig elektrisk stimulering, photostimulation gir større tidsmessig og romlig oppløsning med minimum forstyrrelse til den fysiologiske system av prøver. Siden demonstrasjonen for å bruke lasere for å stimulere nevroner i 1971 en, har mange kreative måter blitt oppfunnet for å eksogent kontrollere neuronal aktivitet med lys. Optisk frigivelse av photocaged agonister har lenge vært brukt til å studere fysiologiske responsen av den neuronale nett til ligander 2,3,4. Denne teknikk har begrenset spesifisitet på grunn av diffusjon av bur agonister. Genetisk spesifisitet oppnås ved ectopically uttrykker lyssensitive opsin kanaler og pumper 5,6,7, og det har blitt brukt til å modulere utvalgte nevrale nettverk i ulike modellorganismer. Men det ville være vanskelig å anvende denne metoden til optisk kontrollere ulike andre nevrale proteiner, siden pode photoresponsiveness fra opsin proteiner til andre proteiner would krever intens teknikk som kan endre de naturlige egenskapene til proteinet under studien. Kjemisk tethering en eksogen lysfølsomme ligand til et protein har vist en annen måte å kontrollere funksjonaliteten til kanalproteiner 8,9,10. Liganden er presentert eller trukket tilbake fra bindingssetet av proteinet ved fotoisomerisering av azobenzen del. -Deling kjemi begrenser anvendelsen hovedsakelig til den ekstracellulære siden av membranproteiner, med unntak av den intracellulære side og intracellulære proteiner.

Fotoreager Uaas, etter å ha blitt innlemmet i proteiner, gir en generell strategi for å manipulere proteiner med lys. I tidlig innsats, tRNAs kjemisk acylert med photocaged Uaas ble microinjected inn Xenopus oocytter å innlemme Uaas til membranreseptorer og ionekanaler 11, som har avansert forståelse av deres struktur-funksjon relasjoner 12,13,14.Denne mikroinjeksjon tilnærmingen er i hovedsak begrenset til store oocytter. Genetisk inkorporering av en UAA forbigår teknisk utfordrende tRNA acylering og mikroinjeksjon ved hjelp av en ortogonal tRNA / syntetase paret, som inkorporerer UAA gjennom endogent protein oversettelse i levende celler 15,16,17,18. UAA innlemmelse i nevronale proteiner har blitt demonstrert i primær nevroner og nevrale stamceller 19,20. Mer nylig har fotoreager UAA blitt genetisk inkorporert i en neuronal protein i pattedyrhjernen in vivo for første gang 21. Disse fremskritt gjør det mulig å studere nevrale proteiner med Uaas i sitt eget mobilnettet miljø.

Innad he kaliumkanal Kir2.1 er en sterk likeretter som passerer K + strømmer lettere inn i enn ut av cellen, og det er avgjørende i regulering av fysiologiske prosesser, inkludert celleeksiterbarhet, vaskulær tone, hjertefrekvens, renal salt flyt og insulin slipper 22. Overekspresjon av Kir2.1 hyperpolarizes membranpotensialet av målet nervecellen, som blir mindre opphisset 23,24. Å optisk kontrollere Kir2.1 i sin opprinnelige celler, Kang et al. Genetisk innarbeidet en foto-responsive UAA inn Kir2.1 uttrykt i pattedyrceller, nevroner og embryonale mus hjerner 21. En kort lyspuls var i stand til å omdanne UAA til en naturlig aminosyre Cys, og dermed aktivisere målet Kir2.1 protein. Når dette bildet-induserbar innvendig he kalium (Pirk) kanal protein ble uttrykt i rotte hippocampus primære nevroner, det undertrykte nevronal utløsning i respons til lys aktivering. I tillegg ble pilken kanal uttrykt i embryonale muse neocortex, og den lys-aktivert pilken strøm i kortikale neuroner ble målt. Den vellykkede gjennomføringen av UAA teknologi in vivo i pattedyrhjernen åpner døren til optisk kontrollere nevrale proteineri sitt opprinnelige miljø, noe som vil gjøre det mulig optisk disseksjon av nevrale prosesser og mekanismer på molekylært nivå.

I denne protokollen beskriver vi prosedyrer for genetisk innblanding av Uaas inn i primære nevroner i kultur og i embryonale mus hjernen in vivo. Den fotoreager UAA Cmn og Kir2.1 brukes til å illustrere prosessen. Metoder for å vurdere vellykket UAA innlemmelse og optisk kontroll av neuronal protein aktivitet er gitt. Denne protokollen gir en klar guide til genetisk kodende Uaas i nerveceller og in vivo, og for å regulere optisk neuronal protein funksjon via et fotoreagerende UAA. Vi forventer at denne protokollen for å lette vedtakelsen av in vivo UAA teknologi for nevrovitenskap og optogenetic biologiske studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer i denne studien ble utført ved hjelp av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjente protokoller for dyr håndtering ved Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.

1. UAA innbygging i Kir2.1 og Expression av den resulterende Pirk i Primær Neuronal Culture

  1. DNA Construction
    1. Velg et målområde for Kir2.1 for UAA innlemmelse. Utnytte tidligere kunnskap og informasjon om struktur og funksjon av Kir2.1, slik at den valgte området med fotoreager UAA innarbeidet gjør optisk modulering av Kir2.1 funksjon 21.
    2. Konstruer en rekombinant DNA-koding Kir2.1 gen med det valgte området mutert til TAG rav stoppkodon. Bruk standard kloningsteknikker 25 å klone Kir2.1-TAG DNA inn i en pattedyr uttrykk plasmid.
    3. Clone tRNA / syntetase gener som er spesifikke for UAA og innlemme UAA svar påTAG stoppkodon inn i et annet pattedyr uttrykk plasmid 21.
      Merk: For optimal UAA innlemmelse, kan forskjellige arrangører og kombinasjoner av genet kassetter (for tRNA, syntetase, og Kir2.1) testes i forskjellige plasmider.
    4. Oppnå høy kvalitet plasmid DNA ved hjelp miniprepp eller maxiprep kommersielle kits i henhold til produsentens protokoll. Rundt 1,9 til 260/280-forholdet er optimal for det rensede DNA. Når det er nødvendig, utføre en agarosegel elektroforese for å kontrollere renheten av det preparerte DNA 25. Supercoil plasmid DNA med høy renhet er best for nevronale transfeksjon.
  2. Kultur Rat hippocampus Primær Nerveceller
    1. Sted dekkglass (sirkler, 12 mm i diameter) i 24-brønners plater, en dekk på hver brønn, og belegge hver brønn med 250 ul av 0,5 mg / ml poly-D-lysin (i 100 mM boratbuffer: 1,24 g borsyre syre og 1,90 g natriumtetraborat i 400 ml avionisert destillert H2O eller DDH 2
    2. På dagen for disseksjon, samle neonatale hoder fra postnatal rotteunger (1-4 postnatal dag) etter bedøvelse dem med isofluran, og decapitating. Anesthetize valpene i et anesthetization kammer som inneholder isofluran (2-4%). Vent til de mister bevisstheten og ikke klarer å svare på taktile stimuli og å knipe av potene.
    3. Ved hjelp av standard teknikk 26, dissekere Hippocampi fra hjernen i varm (~ 37 ° C) saltoppløsning (10 mM HEPES og 20 mM D-glukose tilsatt i Hanks balanserte saltoppløsning), og samle hippocampi i et konisk rør med 4,5 ml varmt saltvann .
    4. Legg 500 mL av 2,5% trypsin i hippocampi (0,25% sluttkonsentrasjon trypsin), og inkuber i 10 minutter i et vannbad ved 37 ° C.
    5. Skyll vev med saltvann (3 x 10 ml) og triturer.
    6. Gjenopprette dissosiert nevroner i 1 ml warm vekstmedier som inneholder Minimum Essential Medium (MEM) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 21,2 mM D-glukose, 2 mM L-glutamin, 2% B-27, og 0,1% serum extender.
      Merk: Legg L-glutamin og B-27 på dagen for disseksjon for å forberede fersk vekstmedier.
    7. Telle neuronene med et hemocytometer, og plate dem på dekkglass i 24-brønners plater ved 1,0-1,5 x 10 5 celle / brønn tetthet med 500 pl vekstmedium etter filtrert gjennom et 40 um nylonnett.
    8. Inkuber den neuronale kulturen ved 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft fuktet inkubator i 2-3 uker. For best resultat, unngå å forstyrre kulturen så mye som mulig under inkubasjon.
  3. Kalsiumfosfat (Ca-P) Transfeksjon av Primary neuronal kultur
    1. Gjør stamløsninger og oppbevar ved 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hydroksy-etyl] -2-aminoetansulfonsyre) buffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); steril DDH 2 O; steril 1 N NaOH.
    2. På dagen for transfeksjon, lage fersk 2,5 M CaCl 2 løsning i DDH 2 O og sterilt filter med 0,22 mikrometer filter. Gjøre fersk 2x BES-bufret saltoppløsning (BBS) buffer inneholdende 50 mM BES, 1,5 mM Na-HPO 2 til 4, og 280 mM NaCl ved pH 7,00 (juster pH med NaOH) og sterilfilter med 0,22 um filter.
      Merk: Beregn mengden av CaCl2-løsning og BBS buffer, avhengig av antall dekk som skal transfekteres. Også se på 1.3.4.
    3. Sett på kultur vekstmedier med 500 mL frisk forvarmet transfeksjon vekstmedier. (Transfeksjon media kan gjøres med MEM pluss 21,2 mM D-glukose).
      Merk: Ikke kast den gamle media.
    4. Beregne mengden av DDH 2 O og forberede for å legge til for å gjøre den transfeksjon oppløsning (33 ul pr hvert dekkglass) som inneholdt 1,65 pl CaCl2, 0,7 ug DNA, og 16,5 &# 181; l 2x BBS.
    5. Forbered transfeksjon løsning umiddelbart før du legger den til kulturen. For å forberede seg, først kombinere CaCl 2 og DDH 2 O mens sakte omrøring av røret. Fortsett å omrøre og tilsett langsomt DNA i oppløsning. Til slutt, legg 2x BBS buffer dråpevis under omrøring.
    6. Tilsett umiddelbart 30 ul av transfeksjon løsning til hver dekkglass av neuronal kultur.
    7. Rock kulturen fatet et par ganger for å blande løsningen og inkuberes ved 35 ° C i en 5% CO 2: 95% luft fuktet inkubator i 45 min-1 time. Etter nerveceller blir inkubert med transfeksjon løsning, ville meget fine Ca-P-utfellinger danne et lag som dekker nerveceller.
    8. Sett på transfeksjon media med 500 ul forvarmet vaskebuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na2 HPO 4, 10 mM glukose ved pH 7,3, sterilt filtrert med 0,22 um filter) og inkuber ved 356, C i en 5% CO2: 95% luft fuktet inkubator i 15-20 min. Ca-P utfellinger ville forsvinne etter at vasketrinnet.
    9. Bytt vaskebufferen med 500 mL fersk vekstmedier. Igjen, erstatte vekstmedier med den lagrede opprinnelige mediet.
    10. Legg UAA Cmn (ferdigblandet i 50 ul varm vekstmedier) til kultur for å nå 1 mM sluttkonsentrasjon.
    11. Inkuber den transfekterte kultur ved 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft fuktet inkubator i 12-48 timer før analyser.
  4. Hele Cell Opptak med lysaktivering
    1. Forbered ekstra / intracellulære løsninger. Den intracellulære oppløsningen inneholder 135 mM kaliumglukonat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP, og 0,3 mM Li 2 GTP ved pH 7,4. Det ekstracellulære opptak løsning inneholder 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 5 mM glukose og 10 mM HEPES ved pH 7,4.
    2. Installer en lysdiode (LED) med utslipp av 385 nm ved mikroskopet på riggen for å levere lys til navet fra 1 cm unna i en 45 ° vinkel. Sjekk strøm av LED med en lys kraft meter.
  5. Trekk patch pipetter fra glasselektroder ved hjelp av en kommersiell mikropipette avtrekker for å ha 3-6 Megohm pipette motstand. Følg produsentens instruksjoner for å sette opp mikropipette avtrekker.
    1. For å teste pipette motstand, først fylle pipetten med intracellulære løsning og plassere den på elektrodeholderen. Dypp pipetten i et 35 mm kulturskål fylt med ekstracellulære løsningen som er lagt på mikroskopet platform. Fordyp jordelektrode i formen for å fullføre en krets.
    2. Slå på forsterkeren / digitaliserer og starte en datainnsamling programvare. Monitor pipette motstand med en membran testprotokoll.
  6. Ta ut en dekkglass av nervecellen kultur fra inkubatoren og skyll en gang i den ekstracellulære løsningen. Ved hjelp av vakuum fett, hold nede dekkglass i midten av en 35 mm kulturskål fylt med fersk ekstracellulære løsningen.
  7. Plasser dekkglass / fatet på elektromikroskop plattformen.
  8. Ved hjelp av standard patch klemmeteknikker, lappe et nevron med mCitrine fluorescens 27. Record neuronal aktivitet ved hjelp strømtang (I-klemme) -metoden. Først justere hvilepotensialet til rundt -72 mV ved å injisere en liten strøm. Deretter injisere et skritt strøm (10-200 Pa) for å indusere kontinuerlig avfyring (5-15 Hz) av aksjonspotensialer.
  9. Manuelt, eller ved hjelp av datainnsamling programvare, blinke en puls (en syndgle puls på 100 ms -1 sek varighet) av LED lys til nervecellen under opptak, og se om aksjonspotensialer er berørt.
  10. Tilsett 0,5 mM bacl to til badet og verifisere om aksjonspotensialer blir gjenvunnet.

2. UAA innbygging i Kir2.1 og Expression av den resulterende Pirk i Mouse Embryonic Brain In Vivo

  1. DNA Construction
    1. Utforme den plasmid-DNA på samme måte som i trinn 1.1. For in vivo uttrykk, bruk en sterk promoter som CAG (kylling beta-aktin promoter med CMV enhancer).
    2. Rens DNA med en endotoksin-fri maxiprep kommersielt sett i henhold til produsentens protokoll. Utfør fenol-kloroform ekstraksjon fulgt av etanolfelling 25 til å tilegne seg ekstremt høy kvalitet DNA (kondensert til 2-5 ug / ul).
  2. I Utero Electroporation til Mouse Embryonic neocortex
    Merk: Den grunnleggende Technique for in utero electroporation har blitt beskrevet tidligere 28.
    1. Anesthetize en tidsbestemt gravid mus på embryonale dag 14,5 (E14.5) med natrium pentobarbital (intraperitoneal injeksjon, 50 mikrogram per gram kroppsvekt) eller isofluran (innånding, 2-4%). Overvåke anestesidybden ved å kontrollere tap av bevissthet og ingen respons på taktile stimuli og å knipe av potene.
    2. Lag et lite snitt på abdominal midtlinjen. Forsiktig utsette livmor horn med pinsett og fingertuppene.
    3. Injiser omtrent 1 pl DNA-oppløsning (2-5 ug / ul av hvert plasmid, avhengig av konstruksjonen) inn i den laterale ventrikkel i hvert kull med et glass pipette inn gjennom livmorveggen. I de fleste tilfeller er omtrent 60-80% av de totale embryoer injisert.
    4. Electroporate embryoene med en electroporator (33-35 V, 50 ms varighet, 950 ms intervall, 4-8 pulser).
    5. Returner livmor horn til bukhulen forsiktig med forsteinsopp og fingertuppene. Suturer muskel veggen og deretter huden med kirurgisk sutur for å tillate embryoene å fortsette utviklingen.
  3. UAA Mikroinjeksjon
    1. Lag et lite snitt i buken midtlinjen igjen på E16.5, og forsiktig utsett livmor horn med pinsett og fingertuppene.
    2. Injiser omtrent 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) til det elektroporert side eller begge sider av den laterale ventrikkel med et glass pipette inn gjennom livmorveggen. For å øke Cmn biotilgjengelighet, bruk dipeptide Cmn-Ala (Cmn-alanine) for å levere Cmn in vivo 21.
    3. Igjen, tilbake livmor horn til bukhulen forsiktig med pinsett og fingertuppene. Suturer muskel veggen og deretter huden med kirurgisk sutur for å tillate embryoene å fortsette utviklingen.
  4. Skaff Akutt Brain Slices
    1. Lag 1 L kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) inneholdende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl 2PO 4, 26,2 mM NaHCO3 og 11 mM glukose ved pH 7,3.
    2. Ta 200 ml ACSF og raskt fryse ved -80 ° C i 20-30 min. Boble resten av ACSF med 5% CO2: 95% O 2 gass ved romtemperatur.
    3. Forbered og sterilisere kirurgi for å høste hjerner fra embryoer. Også utarbeide en bøtte med is.
    4. Gjøre ~ 100 ml 4% lavt smeltepunkt agarose oppløsning i en kolbe ved oppvarming i en mikrobølgeovn. Avkjøles oppløsningen i ca 5 min før det begynner å stivne.
    5. Avlive musen 12-24 timer etter Cmn-Ala injeksjon av CO 2 overdose. Gjør store snitt på mageområdet, og dissekere ut electroporated / microinjected embryoer fra livmor med fine saks og pinsett.
    6. Harvests hjerner fra embryoene med fin saks og pinsett.
    7. Plasser hver hjernen på en 10 cm kultur parabolen plassert på isen bøtte. Del to halvkuler med en skarp kniv, og plasser hverhalvkule på fatet med midsagittal plan berøre bunnen av fatet. Raskt hell over agarose løsningen over hjernen (rundt 500 mL per halvkule).
    8. Ved hjelp av en skarp kniv, firkantet kutt agarose rundt en hjerne til å lage en hjerne-embedded agarose blokken.
    9. Ved hjelp av vev klebemiddel, lim ned den midsagittal plane overflate av agarose blokken på et feste for vibratome. Fyll vibratome kammer med pre-kjølt ACSF og kutte 200 mikrometer sagittal hjerneskiver.
    10. Inkuber akutte skiver i ACSF supplert med 3 mM myo-Inositol, 0,4 mM askorbinsyre, og 2 mM natriumpyruvat ved 33 ° C i 42 min mens bobling med 5% CO2: 95% O 2 gass.
    11. Etter 42 min, slå av ovnen og fortsette å ruge skivene ved romtemperatur med bobler. Begynn hel-celle patch opptak i minst 15 minutter etter å ha slått av varmeapparatet.
  5. Hele Cell Opptak med lysaktivering
    1. Klargjør Intracellular oppløsning inneholdende 130 mM kaliumglukonat, 4 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na to ATP, 10 mM natriumkreatinfosfat, og 0,1 mM Na 3 GTP ved pH 7,3 justert med KOH.
    2. Trekk patch pipetter fra glasselektroder ved hjelp av en kommersiell mikropipette avtrekker for å ha 3-6 Megohm pipette motstand.
    3. Sett opp stykket elektrofysiologi rigg for hel-celle patch klem- og superfuse innspillingen kammer med ACSF på 2 ml / min hastighet med en perfusjon pumpe. Juster kammertemperatur til rundt 33 ° C.
      Merk: slice elektrofysiologi Riggen er utstyrt med en perfusjon kammer, et vann nedsenking objektiv og en temperaturregulator. Også GFP filter (eksitasjon: 480/30 nm, emisjon: 535/40 nm) og mCherry filteret (eksitasjon:: 580/20 nm emisjon 675/130 nm) som kreves.
      1. Installer en LED med utslipp av 385 nm ved mikroskopet på riggen for å levere lys til navet fra 1 cm unna i en 45 °vinkel. Sjekk strøm av LED med en lys kraft meter.
    4. Nøye plukke opp en hjerne skive med et glass pipette og plass i perfusjon kammeret. Hold nede skive med en harpe.
    5. Lappe et nevron med mCherry / GFP fluorescens fra neokortikale region 27. Record Pirk aktivitet ved hjelp spenning klemme (V-klemme) -metoden. Først holder membranpotensiale på -60 mV. Deretter rekord strømmer til faste negative membranpotensialer (-100 mV) eller spenning ramper (-100 mV til 40 mV). Spesielt overvåke Kir2.1 spesifikke innover strømmer på -100 mV.
    6. Manuelt, eller ved hjelp av datainnsamling programvare, blinke en puls (en enkelt puls på 100 ms -1 sek varighet) av LED lys til nervecellen under opptak, og se om Pirk proteiner er aktivert. Når Pirk er aktivert, vil innover strømmer på -100 mV øke betydelig.
    7. Tilsett 0,5 mM bacl to til badet og verifisere om Pirk inaktiveres igjen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å genetisk innlemme en UAA inn et protein i nerveceller, er det første viktige skrittet å utforme passende genkonstruksjoner å levere og uttrykke gener effektivt i nerveceller. Det finnes tre genetiske komponenter for UAA innlemmelse: (1) målgenet med TAG rav stoppkodonet innført ved det valgte stedet for UAA inkorporering (2) en ortogonal tRNA til å gjenkjenne den muterte TAG stoppkodon, og (3) en ortogonal aminoacyl -tRNA syntetase å lade UAA på ortogonale tRNA. Hver komponent må være drevet av passende promoter. Disse tre genkassetter kan inkluderes i en plasmid eller separeres i flere plasmider. Å uttrykke Pirk i nerveceller, er foto-reaktive UAA Cmn innlemmet i Kir2.1 hjelp av ortogonale tRNA Leu CUA / CmnRS (Cmn-tRNA syntetase) pair utviklet seg til å være spesifikk for Cmn 21,29. Rester Cys169 av Kir2.1 genet er mutert til TAG rav stoppkodon (Kir2.1-TAG), og de ​​fluorescerende protein mCitrine er fusjonert til C-terminusen av Kir2.1 å visualisere pilken ekspresjon i neuronal kultur (figur 1).

Innhenting av god kvalitet neuronal kultur er en forutsetning for vellykket Pirk eksperimenter. Postnatal dag 1-4 Sprague Dawley rotteunger er vanligvis brukt for neuronal kultur forberedelse, men rotte embryoer blir også hyppig brukt. Når sådd ut på dekkglass i 24-brønners plater ved 1,0-1,5 x 10 5 celle / brønn tetthet, bør man se godt separerte friske nerveceller med ikke for mye mikroglia eller annet avfall (figur 2A). Sunn nevroner har omfattende prosesser og cellelegemer (soma) er lubben (figur 2B). Utpreget synlig suborganelle struktur er vanligvis et tegn på usunn kultur. Neuronal kulturen kan opprettholdes i 2-3 uker ved 35 ° C i 5% CO2: 95% luft fuktet inkubator.

Calcium fosfat (Ca-P) transfeksjon er en svært skånsom transfeksjon metode egnet for sensitiv neuronal kultur. Men det krever ekstrem presisjon og forsiktighet for å oppnå høy transfeksjon effektivitet i nerveceller. Lagerløsninger må være lagret ved 4 ° C, og blandet for å lage 2x BBS bufferen på dagen for transfeksjon. Presis justering av pH er nøkkelen til reproduserbart få gode resultater. Den 2,5 M CaCl2-løsning bør også bli gjort frisk på dagen for transfeksjon. Alle buffere må filtreres. Videre friske DNA-plasmider med høy renhet og kvalitet forbedre resultatene. For best resultat, kan man få ferske DNA mini-preparert fra ikke overgrodd Escherichia coli kultur (~ 12 timer ved 37 ° C i risteinkubator). Etter at alle bufferne er klare, ta løsningene i vevskultur hette og forberede transfeksjon. Ved hjelp av en virvel ved en lav hastighet, agitere transfeksjon oppløsningen mens det ble blandet. Umiddelbart legge den blandede oppløsningen til nevronale cuLTURE, og bringe kulturen rett tilbake til inkubatoren. Stopp transfeksjon etter 45 min-1 time, og legg den opprinnelige vekstmedier tilbake til kultur for kontinuerlig inkubasjon. De transfekterte nevroner kan visualiseres fra 6 timer etter transfeksjon er avsluttet (figur 3). I nærvær av Cmn i kulturmediet, blir pilken uttrykt og pilken-uttrykkende nevroner er grønt-fluorescerende på grunn av mCitrine protein fusjonert til C-terminalen i pilken (figur 3D). Pilken-uttrykkende nevroner har normal basal fysiologi og de ​​er i stand til å avfyre ​​aksjonspotensialer i respons til injiserte strømmer (figur 4). Imidlertid er denne serien av aksjonspotensialer trykkes umiddelbart med en kort lyspuls lyste til cellen (figur 4A). Når 0,5 mM bacl 2, en Kir2.1 spesifikk inhibitor, tilsettes til badet, blir neuronal avfyring deretter gjenopptatt, noe som indikerer at den foregående undertrykkelse var på grunn av aktivering av Kir2.1 av light (figur 4B). Utransfekterte kontroll nevroner ikke svare på lyset eller Ba 2+ (figur 4C, D).

Å uttrykke Pirk in vivo bør svært rene og konsentrerte DNA plasmider (2-5 mikrogram / ​​mikroliter) være forberedt. Spesifikke plasmider anvendt i disse eksperimentene er vist i figur 5A. I tillegg til den ortogonale tRNA Leu CUA / CmnRS par og målet Kir2.1-TAG gen, et gen som koder grønt fluorescerende protein med en TAG-mutasjon (GFP-TAG) er også co-elektroporert som et fluorescerende reporter. Påvisning av GFP fluorescens indikerer vellykket levering av alle tre plasmider, siden TAG undertrykkelse i GFP vil kreve både tRNA Leu CUA og CmnRS; Cmn innlemmelse i GFP-TAG foreslår Cmn innlemmelse i Kir2.1-TAGas godt, fordi begge gener er tilstede i samme celle. De tre genkonstruksjoner er alle injected i den laterale ventrikkel museembryoer på E14.5 (figur 5B, venstre panel). Etter elektroporering tilbake embryoene til bukhulen å tillate embryoene å fortsette utviklingen. To dager senere injiserer omtrent 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) til det elektroporert side eller begge sider av den laterale ventrikkel, på tilsvarende måte som DNA-injeksjon (figur 5B, midtre panel). Igjen, tilbake embryoene til bukhulen for kontinuerlig utvikling. Embryoene kan høstes på E17.5 for avbildning eller elektrofysiologiske undersøkelser. Som forventet, bare med Cmn-Ala-injeksjon, blir grønne fluorescente celler observert i mus neocortex. Celler med både rød og grønn fluorescens burde ha Cmn innlemmet i Kir2.1-TAG å gjøre Pirk kanaler (Figur 6A). Hel-celle-opptak fra den embryoniske neokortikale skive er gjort på samme måte som det er gjort på neuronal kultur. De grønne og røde fluorescerende nevroner har ingen innover strøm på negative holder potensial, men en kort lyspuls aktiverer hurtig den innoverstrøm (figur 6B). Strømmen blir fullstendig blokkert ved tilsetning av Ba 2+, noe som bekrefter at det er generert av pilken.

Figur 1
Figur 1: Pirk uttrykk plasmid sett for nevron kultur Scheme viser eksemplarisk plasmid design for Pirk uttrykk i neuronal kultur.. Top plasmid koder Kir2.1 genet (grå) med en enkelt aminosyre mutasjon i C169 side under cytomegalovirus (CMV) promoter. C169 er mutert til TAG rav stoppkodon, hvor UAA Cmn vil bli innarbeidet. Kir2.1 genet blir etterfulgt av mCitrine gen (grønn). mCitrine er fusjonert til C-terminalen av Kir2.1 genet for å visualisere pilken uttrykkende celler. Bottom plasmid koder CmnRS (rosa), den Cmn bestemt syntetase, drevet av musen fosfoglyceratkinase-en (mPGK) promoter. tRNA > Leu CUA (blå), den ortogonale tRNA 21, kommer også til uttrykk i det samme plasmid drevet av H1-promoteren, men i en motsatt retning.

Figur 2
Figur 2: Rat hippocampus primære neuronal kultur Eksemplarisk bilder som viser sunn rotte hippocampus nevronale kulturer.. (A) En DIC bilde av neuronal kultur på 10 dager in vitro (DIV). Nerveceller modne som de armen ut dendritter og aksoner. Microglia celler (små og runde celler uten prosesser) eksistere, men ikke overvelde kulturen. (B) En forstørret DIC bilde av sunne dyrkede nerveceller. En sunn nevron viser lubben cellen kroppen (soma) og uttales dendritter / aksoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3:. Pirk uttrykk i dyrkede primære nevroner DIC og fluorescens bilder av rotte hippocampus nerveceller dyrket in vitro og transfektert med genkonstruksjoner avbildet i figur 1 for Pirk uttrykk. Når Cmn ikke blir tilsatt i kulturen etter transfeksjon (A og B), er det ikke grønn fluorescens detektert fra neuronene. I nærvær av Cmn (1 mm) i vekstmedier, transfekterte nevroner er i stand til å uttrykke full lengde Pirk-mCitrine proteiner, og dermed viser grønn fluorescens (C og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

.jpg "/>
Fig. 4: Lys aktivering av pilken undertrykker avfyring fra rotte-hippocampus-neuroner (A) En enkelt lyspuls undertrykker aktiviteten av det hippocampale nervecellen uttrykker pilken. Representative spenning spor registreres fortløpende i dagens-klemme. Aksjonspotensial avfyring er fremkalt ved 20 pA strøm injeksjon (I-trinn). Lyseksponering (385 nm, 40 mW / cm 2, 1 sek, indikert med pil) raskt og fullstendig undertrykker nevronal utløsning. Firing er restaurert med ekstracellulære 500 mM bacl 2, som selektivt hemmer Kir2.1 kanaler. (B) Ultrafiolett (UV) lys (385 nm, 40 mW / cm 2, 6 sekunder; merket med gul boks) endrer ikke oppstemthet av kontroll, utransfekterte nerveceller. Aksjonspotensial avfyring er fremkalt ved 50 pA strøm injeksjon (I-trinn). (C og D) Verken UV-belysning eller bacl 2 (500 mM) påvirker eksitabilitet av kontroll neuroner. handling potential er fremkalt ved 50 pA strøm injeksjon (I-trinn).

Figur 5
Figur 5: Prosedyrer for Pirk uttrykk i mus neocortex in vivo. (A) pilken ekspresjonsplasmid angitt. Top plasmid: plasmidet for CmnRS drevet av CAG promoter og mCherry via intern ribosomet oppføring hotellet (IRES). mCherry fluorescens ville bekrefte vellykket uttrykk for CmnRS. Midt plasmid: plasmidet for Kir2.1 genet kombinert med tre eksemplarer av tRNA Leu CUA, den ortogonale tRNA for Cmn inkorporering 21. Bottom plasmid: plasmidet for GFP_Y182 TAG. Genet for GFP er konstruert med et gult stoppkodon på givende Tyr182 nettstedet (GFP_Y182 TAG) for å visualisere vellykket inkorporering av Cmn til TAG områder 21. (B) Cartoon shovinge en eksperimentell prosedyre for pilken ekspresjon in vivo. Genkonstruksjoner for Pirk uttrykk blir injisert i mus neocortex (E14.5) og electroporated i utero (venstre panel). To dager senere, er Cmn-Ala injisert til ventrikkelen i electroporated side eller begge sider av cerebrale hemisfærer (midten panel). Slice bildebehandling og elektrofysiologisk analyse kan utføres på E17.5-E18.5 (høyre panel).

Figur 6
Figur 6: Pirk uttrykk i mus neocortex og lys aktivering. (A) Fluorescens bilder av mus embryonale kortikale nevroner som viser inkorporering av Cmn til GFP og Kir2.1 proteiner in vivo. De tre genkonstruksjoner i figur 5A er electroporated i livmoren. mCherry fluorescens demonstrerer vellykket uttrykk for Cmn bestemt synthetase genet, CmnRS. GFP fluorescens oppdages bare med Cmn-Ala injeksjon (nederst), noe som indikerer Cmn innlemmelse i GFP TAG og sannsynligvis Cmn innlemmelse i Kir2.1 TAG. Således angir grønn og rød fluorescens vellykket ekspresjon av alle tre plasmider og Cmn inkorporering. (B) IV tomt på strøm er tatt opp fra mus neokortikale nevroner som viser lys-avhengig aktivering av Pirk. To dager etter genkonstruksjoner i figur 5A ble electroporated ble Cmn-Ala injisert i livmoren; 12-48 timer etter Cmn-Ala-injeksjon, ble neokortikale akutte skiver forberedt fra embryoer. Pilken-uttrykkende nevroner i skivene, som detekteres av både rød og grønn fluorescens blir registrert før (svart) og etter (blå) lyseksponering (385 nm, 8 mW / cm 2, 10 sek for mettet eksponering). Bacl 2 (500 mM) ble tilsatt for å verifisere pilken-spesifikk strømmer etter fotoaktivering (oransje).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å oppnå effektiv foto-modulasjon, er det viktig første skritt for å bestemme hvor du skal innlemme fotoreager UAA i målet protein. Strukturell og funksjonell informasjon av målproteinet er meget nyttig for å lede valget av kandidatwebområder. På samme tid, ville den hensikt å lette regulering bestemme hvilken side som er mest egnet. Når du har valgt kandidat nettsteder, anbefaler vi å teste nettsteder i pattedyrcellelinjer som humane embryonale nyre (HEK) celler for enklere kultur og manipulasjon, før du går videre til primære nevroner og in vivo. For å identifisere et nettsted for Kir2.1 fotoaktivering, har flere steder langs pore av Kir2.1 vært utgangspunktet testet i HEK celler. C169 av Kir2.1 ble funnet optimal, fordi Kir2.1 porestørrelsen hvor C169 bor er stor nok til å romme Cmn sidekjeder, men liten nok for Cmn sidekjeder å blokkere ionisk passasje. Når Cmn ble innlemmet på C169 i Kir2.1 uttrykt i HEK celler, than dermed gi mutant Kir2.1 var inaktiv, men ble aktivert ved en kort pule av lys, bekrefter vellykket Pirk utvikling 21.

Effektiv ekspresjon av den ortogonale tRNA-syntetase og er kritisk for å oppnå høy effektivitet UAA inkorporering i celler og in vivo. Den ortogonale syntetase-genet blir effektivt uttrykt ved hjelp av polymerase II-promotoren og poly-A-signaler som ofte brukes i pattedyrceller og nerveceller. For ekspresjon av den ortogonale tRNA, en spesiell type-3-polymerase III promoter, slik som H1-promoteren som brukes her, sammen med en 3'-flankerende sekvens er nødvendig slik som beskrevet tidligere 18,20. For in vivo studier, fant vi at tre eksemplarer av tRNA ekspresjonskassetten økt Cmn inkorporering effektivitet sammenlignet med en kopi (figur 5A). I en annen studie i pattedyrceller, øke antall tRNA ekspresjonskassetten også øket UAA inkorporasjonseffektivitet 30. therefore, foreslår vi å optimalisere antall tRNA uttrykk kassetter for ulike Uaas, celler og target proteiner når UAA inkorporasjonseffektivitet trenger forbedring. Biotilgjengeligheten av Uaas i celler og in vivo er en annen viktig faktor for UAA innlemmelse. Tidligere studier har vist at forestring av Uaas øker deres opptak i pattedyrceller 31, og at utarbeidelse av Uaas i dipeptide skjemaet øker UAA opptak i celler i Caenorhabditis elegans 32. Vi fant at direkte mating Cmn til neuronal vekstmedier er tilstrekkelig for Cmn inkorporering i Kir2.1 uttrykt i dyrkede primære neuroner, men utilstrekkelig for inkorporering i musehjerne in vivo 21. Derfor ble dipeptidet Cmn-Ala syntetisert og injisert i mus hjernen. Oligopeptide transporter PEPT2 er sterkt uttrykt i gnager hjerner 33, som kan legge til rette for transport av dipeptid i nerveceller. Den internalisert DIPEptide ville bli hydrolysert av cellulære peptidases å gi UAA Cmn for innlemmelse. Faktisk, med denne optimaliseringen oppnådde vi effektiv Cmn innlemmelse i nevronale proteiner på flere områder av embryonale mus hjernen, inkludert neocortex, thalamus og hypothalamus 21.

Vellykket Pirk uttrykk i nevroner avhenger sterkt av utarbeidelse av sunn neuronal kultur. Hvert trinn i protokollen skal utføres på en presis og grundig måte. Etter kultur preparat, er det best å holde kulturen i kuvøsen uten forstyrrelse. Åpning og lukking av inkubator døren, så vel som å flytte kulturen fatet inn og ut av inkubatoren, kan legge opp til å undergrave kvaliteten på kultur. Lavere temperatur inkubator (35 ° C istedenfor 37 ° C) bidrar til å redusere eksitotoksisitet. På samme beskjed, bør Ca-P transfeksjon gjøres med ekstra varsomhet. Fremstilling av 2x BBS buffer er et kritisk trinn. Det er en god idé til CaliBråte den optimale pH for 2x BBS buffer mellom pH 6,90-7,15, siden nye DNA-konstruksjoner eller forbereder kunne endre transfeksjon forhold. Den buffer pH kan justeres med presisjon til 0,01 sifre hvis det er lettere å oppnå konsistente resultater. Før transfeksjon, blir vekstmediet av neuronal kultur erstattet med friskt en. Det er avgjørende for å redde den opprinnelige vekstmedier, og legger tilbake til kulturen etter transfeksjon å gjenopprette den opprinnelige tilstanden. Opprettholdelse neuron kultur i friskt medium etter transfeksjon ville forstyrre neuroner fra utvinne, ettersom den mangler viktige molekyler for celleproliferasjon så som vekstfaktorer frigjort fra nerveceller.

For lett aktivering av pilken i dyrkede celler og vev stykker, passende lyskilde og leveringsmåte må bestemmes. Cmn absorberer lange og mellombølge UV lys (280-400 nm). Men forlenget eksponering for UV-lys, særlig for kortere bølgelengde UV-lys, ville være skadelig for cellene. På same tid, kan langt rødt lys varme opp prøven perturbere cellene. Derfor er en LED med en utslipps enkelt-bølgelengde er best for pilken aktivering. For Cmn fotolyse, en LED med utslipp av 385 nm (~ 40 mW, Prizmatix) ble valgt. Lysdioden er utvendig montert nær mikroskop, og en optisk fiber blir brukt til å levere lys nøyaktig til nervecellen i fokus. For reproduserbar datainnsamling, er den optiske fiber satt opp 1 cm unna i en 45 ° vinkel fra nervecellen i fokus. Lys kraft på prøven ble målt 40 mW / cm 2. Det er også anbefalt å regelmessig sjekke LED ytelsen ved hjelp av en optisk strømmåleren.

Vi viser at in utero electroporation er en effektiv teknikk for å inkorporere genetisk Uaas in vivo. I utero elektroporering av plasmid-DNA inn i mus embryonale neocortex utføres som beskrevet tidligere 34, med mindre modifikasjoner. For å uttrykke Pirk proteiner i neonatal mus hjerner, blir to operasjoner som kreves (figur 5B). Det første trinnet er å injisere genkonstruksjoner for Pirk uttrykk etterfulgt av elektroporering. To dager senere, den andre hjernen injeksjon utføres for å levere Cmn-Ala. Det ville kreve praksis å kyndig utføre operasjoner uten å stresse dyrene for mye. Etter hver operasjon, bør dyrene ivaretatt og sjekket med jevne mellomrom gjennom hele utvinning. Tilstrekkelig og rettidig tilgjengelighet av Cmn i hjernen er avgjørende for riktig Pirk uttrykk. 2-5 ul av Cmn-Ala (500 mM) blir vanligvis injisert i en embryonal hjernen. Noen ganger, hjelper det å injisere Cmn-Ala i ventrikkelen på både elektroporert og den motsatte halvkule, ettersom Cmn-Ala fra den motsatte side vil diffundere til den elektroporert side for utvidet Cmn tilførsel. Tatt i betraktning den generelle anvendeligheten av in utero elektroporering, kan denne teknikken bli anvendt ikke bare for å neokortikale neuroner, men også til neuroneri andre områder av hjernen som striatum, diencephalon, og lillehjernen, når electroporation / injeksjonsstedet er justert for hver region. Embryonale / neonatale hjerner er mye mykere enn voksne hjerner, så det ville være vanskelig å få akutte skiver for elektrofysiologiske eksperimenter. Agarose embedding bidrar til å stabil embryonale hjernens struktur for vibratome skjæring. Selv lavt smeltepunkt agarose minimerer temperatur sjokk for hjernen vev, en utvise forsiktighet når helle smeltet agarose løpet kalde hjerner. Virkningen av temperatursjokk til vevet fra agarose innebygging var usynlig i løpet av hele celle-opptak.

Genetisk koding fotoreager Uaas i dyrkede nerveceller og in vivo, eksemplifisert ved Pirk her, vil gi en optogenetic teknikk for å kontrollere ulike nevronale protein aktiviteter med lys i sitt opprinnelige miljø. Den nåværende protokollen presenterer en trinn-for-trinn prosedyre for å utføre Pirk uttrykk og aktivisering eksperimenter jegn neuronal kultur in vitro og in gnager hjerne in vivo, som representerer den første vellykkede utvikling av UAA system for bruk i pattedyr hjerner. Det har potensial til å dra undersøkelser av mange naturlige proteiner, så vel som deres innblanding i sykdommer. For eksempel, α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre (AMPA) reseptorer og N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptorer dele lignende transmembran-strukturer med Kir2.1 kanaler. Det vil derfor være mulig å anvende pilken metodikk for disse ligand-gated ionekanaler. Videre pilken teknikken kan også benyttes for å adressere patofysiologien til Kir2.1 relaterte genetiske sykdommer, så som Andersens syndrom og hjerte kort QT-syndrom 35,36. I tillegg til "blokk-og-release" Cys via CMN, flere aminosyrer så som tyrosin, serin, lysin, glutamat, aspartat, glysin og har vært bur med forskjellige photoreleasable grupper 37. Således kan lignende strategier være brukend til foto regulere disse aminosyrer i nerveceller in vitro og in vivo. Videre kan reversibel optisk kontroll oppnås med azobenzen-inneholdende Uaas, og slike Uaas har nå blitt genetisk kodet i E. coli og pattedyrceller 38,39.

Oppsummert presenterer denne protokollen en generell metode for å kontrollere aktiviteten til nerve proteiner i hjem innstillinger med lys. I forhold til andre optogenetic metoder som involverer opsin-familien og andre lysfølsomme proteiner eller domener, bruker denne metoden genetisk kodet lysfølsomme Uaas og endringer bare én rest. Derfor bør den ha minimal forstyrrelse for funksjonen, trafficking og lokalisering av målet protein under studien. Høy sete-selektivitet kan også oppnås med disse genetisk kodet lys-responsive Uaas for å gi større fleksibilitet og spesifisitet for detaljert molekylær undersøkelse. Denne protokollen gir også den første comprehensive, lett å følge prosedyren hvordan du lykkes innlemme Uaas til proteiner i nerveceller in vitro og in vivo. Optisk kontroll av generelle proteinene via genetisk kodet Uaas i nerveceller in vitro og in vivo har et stort potensial til å dra både grunnforskning og translasjonsforskning vitenskap, og denne protokollen vil bidra til å fremme sin søknad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Tags

Neuroscience unaturlig aminosyre genetiske kode rav undertrykkelse ion-kanal optogenetics lys-aktivering optisk kontroll photocage nervecellen neuronal aktivitet hjerne
Optisk Kontroll av en neuronal Protein Ved hjelp av en genetisk kodet Unaturlig Amino Acid i nevroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. … More

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter