Summary
例として、マウスABCトランスポーターBcrp1（ABCG2）を用いて、 イン・シリコプロトコルは、マウス組織において発現される遺伝子に代替プロモーターの使用を検出するために、レポーターアッセイを用いて同定された代替的なプロモーターの機能性を評価するために提示されています。
Abstract
通常非翻訳 - - 第一のエキソンの異なる組織における遺伝子発現は、しばしば、ユニークでmRNAの合成をもたらす代替的なプロモーターによって制御されます。 E1U、E1A、E1B、およびE1C：Bcrp1（ABCG2）、ABCトランスポーター乳癌耐性タンパク質（BCRP、ABCG2）のマウスオルソログは、生産対応する4つの代替最初のエクソンによって指定された少なくとも4つの代替のプロモーターを持っています。本明細書において、 インシリコプロトコルはBcrp1ための別のプロモーターの使用を予測するために提示されています。さらに、レポーターアッセイ法は、代替プロモーターのためのレポーター構築物を生成するために上流に同定されている代替の第一エキソンの推定プロモーターの機能性を決定するために記載されています。
Introduction
もっとヒト遺伝子の半分以上が、代替プロモーター1により調節されます。各代替プロモーターは、他の代替的なプロモーターのものと異なっていてもよい調節要素を含むことができます。つの組織に利用されるプロモーター（複数可）は、別の組織で使用されるものと異なってもよいです。例えば、所定のシグナル伝達経路の活性化はつの組織において利用遺伝子のための代替のプロモーターを誘発する、まだに影響を及ぼさない、または別の組織に利用されるのと同じ遺伝子についての別個の代替プロモーターを抑制することができる可能性があります。
Bcrp1遺伝子の発現は、別のプロモーターにより支配されます。 Bcrp1は、ヒト乳癌耐性タンパク質（BCRP）遺伝子のマウスオルソログです。 BCRPは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、正式に指定さABCG2 2、3です。頂端細胞膜タンパク質として、BCRP / Bcrp1機能は、天然および生体異物基質の広範囲を流出します
初期の研究では、正常および新生物細胞におけるBCRP発現の調節を理解するために、BCRP mRNAの5 'cDNA末端の迅速増幅（5'-RACE）分析は、その正確な転写開始部位13を決定しました。だけでなく、見られる複数の転写開始部位がありました。また、BCRPで未翻訳である第一エクソン、の3つの代替の形態があったが発生しました。これらの代替最初のエクソン - 指定のE1a、E1bを、E1Cは - 人間の種々の組織において異なって発現させました。二つの追加の第1エクソン変異体は、BCRP 13の第2エクソンを用いてヒトESTデータベースのBLAST検索で発見されました。 4試合は、上流E1uと命名したエクソン2から第一エキソン> 70キロバイトを明らかにしました。 4その他の試合ではE1- 13と命名した完全に第一エクソンを欠いていたBCRPのmRNAを、明らかにしました。 代替リーダーエクソンの存在は、代替的なプロモーターの使用14の現れであると考えられます。
マウスでは、Bcrp1の4代替最初のエキソンは異なるマウス組織におけるBCRP 1転写を支配する代替プロモーターに対応することができることが記載されています。これらのエキソン/プロモーターはE1U、E1A、E1BとE1Cを指定し、約70、58、15、および上流Bcrp1エクソン2 5、15から5キロバイトに位置しています。 E1A mRNAのアイソフォームはムリンで支配的であることが見出されましたE E1Bアイソフォームは、骨髄5、15マウス腸、胎児肝臓細胞、および赤血球前駆細胞において発現されたのに対し、造血幹細胞、心臓、肺、脾臓、および脳。上流E1Bからのプロモーターが、ホスホサイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質（P-CREB）とその代替に固有のCREB応答要素によって、少なくとも部分的に調節、マウス腸内Bcrp1転写を支配する主要な代替プロモーターであることが示されましたBcrp1プロモーター16。 E1CのmRNAアイソフォームは主として成体マウスの肝臓および腎臓5で表されます。 E1Uアイソフォームは、それが優勢なアイソフォームは5発現しているマウスの精巣を除き、試験したほとんどの組織では検出不能です。 （それは後期精子細胞4を保護することができる輸精内皮、中）体細胞（内皮タイトジャンクション、管周囲筋様細胞、およびセルトリ細胞）と生殖細胞の両方で発見されたBcrp1は、ラットの精巣で発現しました。 REGイオンは、上流E1Uからステロイド合成因子1（SF-1）5のための機能的応答要素が含まれています。 Bcrp1 mRNAおよびタンパク質は、著しくマウスセルトリ細胞におけるBcrp1発現はSF-1 5によって制御されることを示唆し、セルトリ細胞特異的SF-1ノックアウトマウスの精巣で低減されます。
プロトコルは、インシリコ Bcrp1の代替最初のエクソンを検出し、識別された代替最初のエクソンから上流の推定プロモーターのためのルシフェラーゼ・レポーターアッセイを確立するために、詳細な方法を提示しました。
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Protocol
マウスESTデータベースのBLAST解析を用いたBcrp1の代替第一エキソンのインシリコ予測では 1
注：このプロトコルは、自分を確認するためにゲノム配列に一致するEST配列を整列する方法を次にBcrp1の2エクソン配列類似性とのESTのためのマウス発現配列タグ（EST）データベースを検索する方法を説明します（翻訳開始部位を含む）と、 Bcrp1エクソン2の5 '末端にマウスBcrp1遺伝子相対的な位置。
- Ensemblのゲノムブラウザ17の検索窓へのmRNA参照配列のID（NM_011920.3）を入力することにより、マウスのBcrp1エクソン2のシーケンスを取得し、をクリックして「GO。」次の画面で、完全長配列（16エクソンが含まれている）を選択します。
- 次の画面（「トランスクリプトベースの表示」）では、「16エキソン」を選択します。これは、Bcrp1のすべてのエクソンの配列を含む画面が表示されます。 Bcrp1のエクソン2は、5」をお読みます9;。-AAAGGC ... TATCAA-3 '」は、得られた結果は、参照18に示したものと同様となります。
- 「ダウンロードシーケンス」オプションをクリックします。次の画面では、FASTA形式を選択して、[]をクリックし、「プレビュー」。次の画面で、クリップボードにエクソン2のプレビューシーケンスをコピーします。
- 国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイト20上のBLASTのホームページ19に移動します。
- 「マウス」ゲノムを選択します。クエリボックスに、クリップボードからエクソン2配列を貼り付けます。
- データベースのドロップダウンから "のEST」を選択し、最適化「高度に類似した配列、"とし、選択した「BLAST」を実行時間は数分かかります。 BLASTの実行が完了すると、「結果」ページが表示されます。
- 「結果」ページの「説明」小見出しの下で、「ALL、 "その後"ダウンロード、 "その後" FASTA（完全を選択「ドロップダウンリストで、次に選択し、「シーケンス）続行 ".txtファイルが表示されます;。オープンでクリップボードにファイル全体をコピーする.txtファイルは、マウスBcrp1のエクソン2と高い配列類似性を有するすべてのESTの配列を含みます。しかしないBcrp1遺伝子にエクソン2に関連してそれらの位置。
注：2015年4月15日に行われた分析は、Bcrp1エクソン2と整合し、これらを表1に記載されている14マウスのESTを同定しました。
- Bcrp1遺伝子に2エキソンの5 'であるEST配列の位置を特定します。マウスBcrp1遺伝子は染色体6コンティグNC_000072.6（：372099104 GI）に位置しています。
- 「専門ブラスト」小見出しBLASTのホームページでは、選択して "BLAST（bl2seq）を使用して、2つ（またはそれ以上）の配列を整列させます。」
- クエリボックスにクリップボードからテキストファイルを貼り付けて、対象配列ボックスに372099104を入力します。プログラムの下で、「非常に類似した配列 "のために最適化選択、および実行BLAST。
- 結果ウィンドウが表示されたら、「線形」ウィンドウで、「グラフィックス」をクリックしてグラフィカルにアライメントを表示します。左右の矢印を使用し、Bcrp1 / ABCG2との配列アラインメントに集中するズーム。
- 配列アラインメントを保存：「説明」ボックスに「ALL」を選択し、「ダウンロード」のドロップダウンの下で」、表（CSV）をヒット "を選択し、をクリックして「続けます」。このファイルには、Bcrp1エクソン2の配列アラインメントおよびマウス染色体6コンティグにおけるヌクレオチドの番号に対する相対Bcrp1 EXON2に配列類似性を有するすべてのEST配列のアラインメントが含まれています。各完全なEST配列は、Bcrp1エクソン2と重複する配列を含む2のエキソン領域5 'および3'にまたがる複数のアラインメントを生成することがあります。
- エクソン2の5 '末端の位置は第6染色体コンティグに58655638をヌクレオチド配列に対応するように、としてこれを指定しますその後、1、および58655638に各ESTの5 'の部分配列の位置を計算します。 14のESTの結果を表1に示します。
注：潜在的な最初のエクソンとして（ すなわち 、負の塩基値を持つ）1の5 'にあるEST配列を解析するように注意してください。例えば、 表1（AI647825及びAI664571）に示すBcrp1エクソン2と整合ESTの二つに残りの配列は、エクソン2には'3でした。
2.評価Bcrp1の代替プロモーター機能
- レポーターのデザインはBcrp1 E1U、E1A、E1BとE1C促進のために構築します
- ESTデータベースの検索から得られたE1Uの配列を用いて、+1としてE1Uの最初の5 'ヌクレオチドを指します。
- 細菌人工染色体（BAC）の上流Bcrp1 / ABCG2遺伝子配列との配列を少なくとも100キロバイト含まれているマウス染色体6のクローンを得ますBcrp1 / ABCG2遺伝子（材料および機器のリストを参照してください）。
- このようなルシフェラーゼレポータープラスミドをpGL3-Basicのような適切なレポーターベクターを特定します。
- レポーターベクター中の複数のクローニング部位を決定します。 KpnI、SacIで、Mlu1、NheI部位をSmaI、XhoIを、BglIIおよびHindIIIでは、5 'から3'方向のpGL3-Basicベクターのマルチクローニングサイト内の制限エンドヌクレアーゼ部位です。
注：消化部位の配列は、制限酵素を生産する企業の商品カタログから入手可能です。 - このようなDNA5などのソフトウェアプログラムを使用してE1UエクソンとE1Uの2キロバイトの5 '領域内のすべての消化部位を特定します。 E1Uまたは2キロバイト上流地域で発見されていないのpGL3-Basicのマルチクローニングサイト内の少なくとも2つの消化部位を特定します。
注意：そのインサート・ウィルを保証するために、逆方向プライマーのために選択された1の上流にあるフォワードプライマーのためのマルチクローニングサイトの制限部位を選択してくださいlは適切な方向にあります。
- 前方に準備し、（材料および装置のリストを参照してください）商業遺伝子/プライマー合成サービスまたはプライマーの選択ソフトウェアを使用して、選択したpGL3-基本的なマルチクローニングサイトの制限エンドヌクレアーゼ部位のための配列を含むPCR用リバースプライマー。 E1UシーケンスとE1U配列内リバースプライマーから〜2キロバイト上流に位置するフォワードプライマーを選択します。著者で使用されるプライマー「前作はフォワードプライマーでSacI部位、およびリバースプライマーでNheI部位を組み込み、最初の5と64に約-1906からゲノム領域を増幅した」として指定されたE1Uのヌクレオチド+ 1（上記ステップ2.1.1を参照）、および参照16に設けられています。
- PCRは0.01 BACμgの1に、これらのプライマーを用いてE1Uゲノム領域を増幅し、PCRマスターミックスはで変性した高忠実度のTaqポリメラーゼを（材料および機器のリストを参照してください）を含みます使用したプライマーの融解特性に基づいて、30秒間95℃、その後35〜40 72℃（2分）での伸長によるPCRのサイクル、アニーリングおよび融解温度。
注：高忠実度Taqポリメラーゼの使用は、高いGC含量を有する配列決定プロモーター領域のために不可欠です。そのようなテンプレートとしてBACとして大きなゲノムDNA断片を用いる場合には、ゲノムDNAの二次構造は、それが困難なPCRプライマーが結合するために作ることができます。この問題が発生した場合、長いゲノムDNA鋳型は、PCR反応の前に超音波処理することによって穏やかに剪断された場合に、より良好なPCR結果を得ることができます。 - 0.8％TAEアガロースゲル電気泳動を使用して、1kbのDNAラダーと比較することにより、増幅されたPCR産物の長さを確認します。
- PCRは0.01 BACμgの1に、これらのプライマーを用いてE1Uゲノム領域を増幅し、PCRマスターミックスはで変性した高忠実度のTaqポリメラーゼを（材料および機器のリストを参照してください）を含みます使用したプライマーの融解特性に基づいて、30秒間95℃、その後35〜40 72℃（2分）での伸長によるPCRのサイクル、アニーリングおよび融解温度。
- 得られたPCR産物とのpGL3-Basicベクターを消化、制限を使用すると、前方に導入された制限消化部位に対して特異的なエンドヌクレアーゼおよびインごとにリバースプライマー制限消化酵素で供給tructions。
- キットのプロトコール21以下、（材料および機器のリストを参照してください）商業SVジェルを使用して消化反応やPCRクリーンアップシステムキットを精製します。
- アガロースゲル電気泳動を使用して未切断ベクターに対してそれを比較することにより、ベクターの消化および線形化を確認し、その後切断し、消化したベクターDNAバンドを精製します。 （材料および機器のリストを参照してください）精製したPCR産物およびUV分析法を用いて精製したベクターの濃度を測定します。
- キットのプロトコール21以下、（材料および機器のリストを参照してください）商業SVジェルを使用して消化反応やPCRクリーンアップシステムキットを精製します。
- 精製し、制限酵素を連結することによりE1Uレポーター構築物を準備したPCR産物とのpGL3-Basicのホタルルシフェラーゼレポーターベクター消化（レポーターアッセイキットに含まれているが、材料および装置のリストを参照してください）インサートで：11、21および31のベクトル比を、これによりE1U rを生成し、キットの指示書22に従って「T4 DNAリガーゼ迅速ライゲーションキット」を用いてpGL3-E1Uという名前eporter構築物。
- （材料および機器のリストを参照してください）クローンTAクローニングキットの指示に従ってたpGL3-E1Uを展開する細菌を形質転換するためのpGL3-E1Uプラスミドを使用してください。
- 配列分析により、インサートの向きと忠実度を確認してください。
- 記者がE1U用と同様の方法論を用いてE1A、E1BとE1Cのために構築する準備をします。セクション2.1.5.2のように配列決定によるインサートの忠実度を確認してください。
注：E1Aのプロモーターの挿入は、E1BとE1Cは、約-1875 / + 10、-1847 / + 60、およびE1A、E1Bの（1として指定された）最初の5 'ヌクレオチドへ-1904 / + 83の相対的でなければなりませんまたはそれぞれE1C、。
- レポーターアッセイ法
注：レポーターアッセイの一般的な戦略：遺伝子の推定プロモーター（5 '上流領域）」reporteが含まれている空の「レポーター」、ベクターのマルチクローニングサイトに挿入され、多重クローニング部位の下流R遺伝子」（ 例えば 、ホタルルシフェラーゼ）。ベクターは、次いで、目的の遺伝子を発現する真核細胞にトランスフェクトされる。活性化する必要があり、これらの細胞中の目的の遺伝子の発現を促進するトランス作用因子トランスフェクトされたレポーターベクター中のプロモーター、容易に発光アッセイを用いて定量することができるホタルルシフェラーゼの発現を引き起こします。- レポーターアッセイのために使用する適切な細胞株を選択します。
注：E1U代替プロモーターレポーター構築物の活性を評価するために、それがE1Uプロモーターの制御下にBcrp1発現する細胞への構築物トランスフェクトすることが必要です。 TM4マウスのセルトリ細胞株は、（材料および機器のリストを参照してください）Bcrp1タンパク質とBcrp1のmRNA E1Uを含むだけでなく、E1A、E1B、およびE1C 5を表現します 。陰性対照として、Bcrp1タンパク質またはmRNAを発現しない細胞株を使用することを検討してください。 - TM4 CEの文化1で200,000細胞/ウェルの初期密度で24ウェルプレート中でLLS：1ハムF12培地の混合物1.2グラム/ Lの重炭酸ナトリウムとのダルベッコ改変イーグル培地、15mMのHEPESは、5％のウマ血清を2.5％補充しました以前5に記載のように、37°C、5％CO 2で、ウシ胎児血清、ペニシリン（100 IU / mlで）、およびストレプトマイシン（100μg/ mlの）、。
- 六時間培養中の細胞を配置した後、空のpGL3-basicベクター0.2μgの持つまたは-1906 / + 64 E1Uまたは-1875 / + 10 E1Aまたは-1847 / + 60 E1Bを含むのpGL3ベクター0.2μgので細胞をトランスフェクトまたは-1904 / + 83 E1C BCRP 1削除は、市販のDNAトランスフェクションキット及び製造業者のプロトコル23を使用して、内部対照としてのpRL-TK（ ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター）の4 ngのと一緒に構築（材料および機器のリストを参照してください） 。
- トランスフェクションの30時間、culturから増殖培地を除去edは、細胞をトランスフェクトしました。 200μlのPBSで細胞を1回洗浄し、洗浄液を除去します。
- ホタル測定し、 ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコール24に従って市販のキットを使用して。
- 内部（ ウミシイタケルシフェラーゼ）の制御によって分割ホタルルシフェラーゼ活性の比として、各チューブのための活性を発現。全体的な結果は、通常、1の値が与えられ、空のpGL3ベーシックベクターでトランスフェクトした細胞のそれに各レポーター構築物の相対活性として表現されます。
- レポーターアッセイのために使用する適切な細胞株を選択します。
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Representative Results
リーダーエクソンの分析によって、マウス精巣における BCRP 1 代替プロモーターの使用率 の同定
NCBIでのESTデータベースは、議定書1に記載されている手順を使用して（2015年4月）をプローブしたときに、ESTは、ゲノム内での位置と一緒に、1 mRNAは、表1に示されているBCRPにおけるエクソン2の5 '末端に隣接していたことがわかっBCRP 1 mRNA中に2エキソンに隣接しているC57BL / 6Jマウス精巣由来のエクソン2つのESTの開始までのDNAの相対E1U（ 表1）に対応する、70キロバイト上流エクソン2からのゲノムDNA中の配列を持っています。同様に、E1A、E1B、およびE1Cに対応するESTが検出されました。注目すべきはE1Cに対応する2個のESTはまたE1Cの5 '末端にスプライスされたE1Bが含まれていることです。これらの予測最初のエクソンの場所でマウス染色体6上のBcrp1エキソン2に関しては、 図1に示されています。
BCRP 1 代替プロモーター機能 の評価
E1U、E1Aに対応する典型的なルシフェラーゼアッセイの結果は、TM4マウスセルトリ細胞（セクション2.2を参照）にトランスフェクトE1BとE1Cプロモーター-ルシフェラーゼレポーター構築物は 、 図2Aに示されています。
以前の研究では、SF-1応答エレメントはE1Uプロモーター5にあることが予測されました。この推定上のSF-1応答エレメントをマウス精巣におけるBcrp1転写の調節に関与している場合、E1Uプロモーターレポーター構築物におけるその応答エレメント（前紙5で説明したように）その変異は、その構築物によって生成されるルシフェラーゼ活性を低下させますトランスフェクトされた場合TM4細胞。典型的な実験の結果を、 図2Bに示されています。突然変異した構築物はあっても（前の用紙5に記載されている）、SF-1の強制発現と細胞内で、空のpGL3-basicベクターに匹敵する活性を有する、非突然変異した構築物より低いルシフェラーゼ活性を示しています。 SF-1の強制発現は、非突然変異した構築物の活性を増大させるではなく、その突然変異した1の。
図 1。マウスの染色体6.これらのアライメントは4月に行わのdbEST BLAST検索で同定されたとBcrp1エクソン2の配列同一性を有するESTのゲノムアラインメントの図は 、2015年4つの異なるアラインメントは、代替第一エクソンE1U、E1AをBcrp1に対応し、発見されましたE1B、およびE1C。この図は、以前の出版物5から再生されます。 
図 2。 （A）Bcrp1プロモーターE1U、E1A、E1B、およびBALB / cのセルトリ細胞由来TM4細胞におけるE1Cのためのレポーターアッセイ。データは、セクションに示す2データを記載した方法を用いて、 ウミシイタケルシフェラーゼのそれに対して標準化ホタルルシフェラーゼの発光として表され、平均と異なる日に行わ3回の異なる実験の標準偏差です。アスタリスクは、T検定（P <0.01）を使用して、空のpGL3ベクター対照からの有意差を示します。この図は、以前の出版物5から再生される。Bcrp1 E1U再におけるSF-1応答エレメントの変異の（B）の影響をポーターは、ルシフェラーゼ活性に構築します。 Bcrp1の記者が示さSF-1.データの強制発現で（SF-1トランスフェクト）及び（ベクタートランスフェクト）することなく、TM4細胞にトランスフェクトした推定されるSF-1結合領域（変異したまたは未変異）で構築平均であります3つの異なる実験の、異なる日に行われ、エラーバーは標準偏差を表します。各実験について、個々のアッセイは二重に行きました。 トンの検定（Pを<使用して構築（B）は E1Uプロモーターと比較して統計的に有意な差を示し、同図において、（A）は、 トンの検定を使用して、空のベクターのpGL3コントロール（P <0.05）との有意差を示し0.05）。この図は、以前の出版物5から再生されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表 1。Bcrp1 25 -28の第二エクソンの配列に対するマウスESTデータベースのBlast検索。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
提示された方法および代表的な結果の大部分は2013年5に出版された「マウス精巣におけるB CRP1の転写は上流のステロイド合成因子-1によって調節される新規の第一エキソン（E1U）、のプロモーターによって制御されている」と題された前作に記載されていますここで示されている代表的な結果に加えて、前の紙は、5'-RACE PCRおよびRT-PCR法を用いた代替的な第一エクソンの利用の推定値を提供しました。また、上流E1Uからのプロモーターにおける推定SF-1応答エレメントのインシリコ識別が達成された、とクロマチン免疫沈降（チップ）アッセイは、SF-1が推定されるSF-1応答エレメントに結合することを実証しました。機能的研究は、マウスのセルトリ細胞において、BCRP 1転写がE1UプロモーターにおけるSF-1応答エレメントを介して、SF-1によって制御されることを明らかにしました。これらの機能の研究は、TRAによりTM4細胞におけるSF-1のアップレギュレーションを含まnsfectionまたはBCRP 1 E1U mRNAの発現増強をもたらしたヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット）の使用、およびレポーターアッセイにおけるBCRP 1タンパク質の増加だけでなく、BCRP 1 E1Uプロモーターの活性による。最後に、これらの研究は、成人セルトリ細胞特異的SF-1ノックアウトマウス由来の精巣で、BCRP 1 E1U mRNAの表現は、総BCRP 1の mRNA、およびBcrp1タンパク質が著しく5減少したという証拠を提供しました。同じ作業はまた、腎臓、肝臓、精巣、脳、心臓、肺、筋肉、および脾臓5を含むマウス組織、種々のBcrp1のmRNAアイソフォームの発現パターンを報告しました。
モデルとしてBCRP 1の組織特異的調節を使用して- -ここに記載されているプロトコルは、その差を決定するために、任意の遺伝子の転写複雑さを解明するために容易な実験的なフレームワークを提供します様々な組織または細胞のサブタイプで表現。使用するソフトウェアやデータベースを収容する様々なウェブサイトが変更になる可能性があるためインシリコ評価に記載されたプロトコルの手順から得られた結果は、時間依存する可能性があることを強調しなければなりません。ここで提示インシリコ方法は、ESTデータセット内のすべてのヒト遺伝子の約18％は、代替のプロモーターを使用していると推定以前に29を 、報告されているようにESTデータベース（のdbEST）を検索する使用しています。 「オリゴキャッピング」方法を使用して、多くのヒト組織からのcDNAの180万5 '末端配列を産生するために - - 他の研究者がいるためのdbESTは、代替最初のエクソンを過小評価することができる検索ヒト遺伝子と推定の推定転写開始部位を同定することができました研究人間のRefSeq遺伝子の52％は、おそらく、代替プロモーター1により調節されました。興味深いことに、後者の研究者らは、ほとんどだった精巣および脳推定される代替のプロモーターを利用した組織。さらに、それらは、シグナル伝達経路に関連するタンパク質をコードする遺伝子は、組織特異的プロモーターの代替1を採用する可能性が高いことがわかりました。上記の欠点にもかかわらず、のdbESTは、最小限の労力で複数の組織における特定の遺伝子のための5 'UTRの使用状況の大まかな概要を説明し分析します。
dbEST分析は、代替第一エクソンの使用で容易な一見を提供していますが、我々は非常に調査中の組織または細胞株で最初のエクソンの使用状況を確認するために、cDNA末端（5'-RACE）分析の5 '迅速増幅を行うことをお勧めします。市販のキットには、メーカーが提供する詳細かつ簡単な手順（材料および機器のリストを参照してください）で、5'-RACEのために利用可能です。多少時間がかかりますが、5'-RACEの研究では、実際の存在の見積りだけでなく、代替最初の元のシーケンスを提供します関心のmRNA中のアドオン。さらに、複数の転写開始部位の存在は、13を検出することができます。十分な表現を確実にするために、少なくとも15〜25個のクローンの配列決定が必要とされます。シークエンシングの前に、5 'RACE産物からベクター配列を汚染除去することが不可欠です。これを行わない場合は、BLAST分析は、マウスゲノムとの配列アラインメントを検出するために完全に失敗する可能性があります。最初のエクソンの使用が確立されると、5'-RACEの知見は、別の第一エキソンのために後続の定量的RT-PCRアッセイを検証するために使用することができます。一般的には、著者の前作は、5'RACEによって回収最初のエキソンのmRNAクローンの割合と同じ組織または細胞株5から与えられた代替第一エクソンのために回収したPCR産物の割合との間に良好な相関関係があることがわかりました。さらに、良好な相関が代替Bcrp1プロモーターのためのルシフェラーゼプロモーター構築の活動の間に発見されましたndは、特定の細胞株5で対応する代替第一エクソンの発現。
器官全体が使用されている場合、組織特異的選択的プロモーターの使用のための検索では、1が見つかりました。代替のプロモーター/最初のエクソンは、このようなためなど腺要素、血管、間質、として臓器の組織の不均一性を反映することに注意する必要があります例では、精巣は体細胞（ライディッヒ、セルトリ、筋様、および内皮）細胞および胚（一倍体）細胞、ならびに血管系のミックスです。組織特異的な第一のエキソンの発現を探索するために、器官から特定の組織を分離するために必要であろう。
他の方法は、別のプロモーターの使用および規制を識別するために報告されています。しかしながら、これらは、製造、大量のデータを分析することが可能なコンピューティング次世代配列決定およびバイオインフォマティクスを必要とします。これらの方法は、全体transcriptosomeシーケンシング（RNAの配列）、およびチップ-seqのを含みますこのようなプロモーター30に優先的に結合H3K4me3と、としてヒストン。これらの方法は焦点は、いくつかの特定の遺伝子および組織の発現にあるときに、 デノボ実行するために高価になることができますが、既存のデータマイニングは、より実用的なアプローチであってもよいです。
ここに提示プロモーター活性を評価するためのアッセイは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流のマルチプルクローニング領域を含むpGL3-ベーシックベクターを用います。プロモーター活性は、簡単に（材料および機器のリストを参照してください）商業ルミノメーターで発光を測定することにより、補因子および発光基質を添加した後、定量化されたホタルルシフェラーゼの産生によって測定されます。関連pGL4ベクターは、安定にトランスフェクトされた細胞の産生を可能にする、選択マーカー（ 例えば 、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン）を含有させることができます。本論文では与えられたプロトコルは、一過性トランスフェクションを利用します。 promotのための一般的に、レポーターアッセイER活性は、細胞数およびトランスフェクションの効率の変動を制御するために、構成的にウミシイタケ （シーパンジー）ルシフェラーゼ（PRL-TK）を発現するベクターで同時トランスフェクションを使用して行われています。所定の遺伝子のためのプロモーターアッセイを確立する上で重要なステップは、目的の遺伝子は、レポーター構築物でトランスフェクトされた細胞系で発現されていることを確認することです。代替的なプロモーターの使用が存在するとき第二に、トランスフェクトされた細胞株中で発現さ代替の第一エキソンに対応するプロモーター構築物を使用することが重要です。例えば、単にE1Bプロモーターの制御下で、Bcrp1発現する細胞にトランスフェクトされるE1Uのプロモーター構築物のための発光を確認することを期待しないでください。あるいはまた、ネガティブコントロールとして、レポーターのトランスフェクションは、目的の遺伝子またはmRNAのアイソフォームは、ホタルルシフェラーゼのNO産生をもたらすはずで発現しない細胞株への構築物。
C言語代替プロモーターの使用のonsequencesは同じタンパク質、異なるN末端 を有するタンパク質の産生、または異なるタンパク質29の産生の産生を含みます。 Bcrp1 / BCRPの場合には、複数（組織または細胞型特異的）プロモーターが、同じタンパク質の産生を制御します。同様のパターンは、CYP19（アロマターゼ）遺伝子29、31のために存在します。ここで紹介するプロトコルは、1組織または細胞株に関心のあるタンパク質の転写制御の複雑なメカニズムを解読するために使用できる基本的な手順を提供します。
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Disclosures
ダグラスD.ロスとメリーランド大学、ボルチモアは、人間のBCRPに特許権を保持します。
Acknowledgments
この作品は、退役軍人省からダグラスD.ロスへとアリフ・フセインにメリットレビュー賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
