Summary
Med mus ABC-transport Bcrp1 (ABCG2) som ett exempel, in silico-protokoll presenteras för att upptäcka alternativa promotor användning i gener som uttrycks i mus vävnader, och att utvärdera funktionaliteten av de alternativa promotorer identifieras med hjälp av reporteranalyser.
Abstract
Genuttryck i olika vävnader ofta styrs av alternativa promotorer som resulterar i syntesen av mRNA med unika - vanligtvis oöversatta - första exonerna. Bcrp1 (ABCG2), den murina ortologen av ABC-transport Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), har åtminstone fyra alternativa promotorer som betecknas med motsvarande fyra alternativa första exoner produceras: E1U, E1A, E1B och E1C. Häri in silico protokoll presenteras för att förutsäga alternativ promotor användning för Bcrp1. Vidare är reporteranalysförfaranden beskrivs för att producera reporterkonstruktioner för alternativa promotorer och för att bestämma funktionaliteten av förmodade promotorer uppströms om de alternativa första exonerna som identifieras.
Introduction
Mer än hälften av mänskliga gener regleras av alternativa promotorer 1. Varje alternativ promotor kan innehålla regulatoriska element som kan skilja sig från dem i andra alternativa promotorer. Promotorn (er) utnyttjas i en vävnad kan skilja sig från dem som används i en annan vävnad. Till exempel, är det möjligt att aktivering av en viss signalväg kan utlösa den alternativa promotorn för en gen som utnyttjas i en vävnad, men har ingen effekt på eller undertrycka ett separat alternativ promotor för samma gen som utnyttjas i en annan vävnad.
Expression av Bcrp1 genen regleras av alternativa promotorer. Bcrp1 är den murina ortologen av den mänskliga bröstcancerresistensprotein (BCRP) genen. BCRP är en ATP-bindande kassett (ABC) transportör, formellt utsedda ABCG2 2, 3. Som en apikala plasmamembranprotein, till BCRP / Bcrp1 funktioner utflödet ett brett utbud av naturliga och xenobiotiska substrat
I början av arbetet med att förstå regleringen av BCRP uttryck i normala och neoplastiska celler, 5 'snabb förstärkning av cDNA-ändar (5'-RACE) analys av BCRP-mRNA för att bestämma dess exakta transkriptionsstartsätet 13. Inte bara fanns flera transkriptionsstartställen har hittats; också stött var tre alternativa former av det första exonet, som i BCRP är oöversatt. Dessa alternativa första exoner - Speciellt E1a, E1b, E1C - uttrycktes på olika sätt i en mängd av mänskliga vävnader. Ytterligare två första exon varianter upptäcktes i en BLAST-sökning av den mänskliga EST-databasen med hjälp av andra exon av BCRP 13. Fyra matcher avslöjade en första exonet> 70 kb uppströms från exon 2 som betecknades E1u; fyra andra matcher visade BCRP mRNA som saknade en första exon helt, vilket betecknades E1- 13. Närvaron av alternativa ledar exoner anses vara en manifestation av alternativ promotoranvändning 14.
Hos möss, fyra alternativa första exonerna i Bcrp1 beskrivs som kan motsvara alternativa promotorer som styr BCRP en transkription i olika mus vävnader; dessa exoner / promotorer betecknas E1U, E1A, E1B och E1C, och är belägna ca 70, 58, 15, och 5 kb uppströms från Bcrp1 exon 2 5, 15. E1A mRNA isoform befanns vara dominerande i Murine hematopoetiska stamceller, hjärta, lunga, mjälte och hjärna, medan E1B isoformen uttrycktes i mus tarmen, fetala leverceller, och erytroida prekursorceller i benmärg 5, 15. Promotorn uppströms från E1B visades vara den huvudsakliga alternativa promotorn styr Bcrp1 transkription i mus tarmen, regleras åtminstone delvis, genom fosfo-cyklisk-AMP-svarselement-bindande protein (p-CREB) och ett CREB responselement som är unik för att alternativa Bcrp1 promotorn 16. Den E1C mRNA isoform huvudsakligen uttrycks i vuxen mus lever och njure 5. Den E1U isoformen är omöjligt att spåra i de flesta vävnader testades med undantag för mus testiklar, där det är den dominerande isoform uttryckt 5. Bcrp1 uttryckt i rått testiklarna finns i både somatiska (endotelceller tight junctions, peritubulära myoid celler och Sertoliceller) och könsceller (i sädeskanalens endotel, där det kan skydda slutskedet spermatider 4). region uppströms från E1U innehåller en funktionell respons element för steroidogena faktor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA och protein markant reducerad i testiklarna av Sertoli cellspecifika SF-1 knockoutmöss, vilket tyder på att Bcrp1 uttryck i murina Sertoliceller styrs av SF-1 5.
De protokoll som presenteras i detalj metoder för att upptäcka alternativa första exonerna i Bcrp1 in silico, och att upprätta luciferas baserade reporter analyser för förmodade promotorer uppströms från de alternativa första exonerna identifierats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. elektroniskt förutsägande av alternativa första exonema i Bcrp1 Använda BLAST Analys av mus EST databas
Obs: Detta protokoll beskriver hur man söker musen expressed sequence tag (EST) databasen för EST med sekvenslikhet med exon 2 av Bcrp1 (som innehåller translationsstartstället) och sedan hur man kan anpassa matchande EST-sekvenser till genomsekvenser för att fastställa deras läge i mus Bcrp1 genen i förhållande till 5'-änden av Bcrp1 exon 2.
- Erhålla sekvensen för mus Bcrp1 exon 2 genom att mata mRNA referenssekvensen ID (NM_011920.3) i sökfönstret i Ensembl Genome Browser 17, klicka på "GO". I nästa skärm, välj en fullängdssekvensen (innehåller 16 exoner):
- I nästa skärm ( "avskrift baserad Display"), välj "16 exoner." Detta visar en skärm som innehåller sekvensen för alla exoner i Bcrp1. Exon 2 av Bcrp1 kommer att läsa "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "De erhållna resultaten kommer att vara liknande de som visas i 18 referens..
- Klicka på "Download sekvens" alternativet. I nästa skärm väljer FASTA format, och klicka sedan på "Preview". I nästa skärm, kopiera Förhands sekvensen av exon 2 i klippbordet.
- Navigera till BLAST hemsida 19 på National Center for Biotechnology Information (NCBI) hemsida 20.
- Välj "mus" genomet. Klistra in exon 2-sekvensen från klippbordet i sökrutan.
- Välj "EST" från databasen rullgardins, optimera för "mycket liknande sekvenser" och välj sedan "BLAST". Körtid tar några minuter. När BLAST körningen är klar kommer "Resultat" sidan visas.
- Under "beskrivning" underrubrik av "Resultat" sidan, välj "ALL" och sedan "Download" och sedan "FASTA (komplettsekvens) "i rullgardinsmenyn och välj sedan" Fortsätt "En .txt-fil visas,. öppna och kopiera hela filen till Urklipp Den .txt-fil innehåller sekvenser av alla EST med hög sekvenslikhet med musen Bcrp1 exon2. men inte deras position i förhållande till exon 2 i Bcrp1 genen.
Obs: En analys den 15 april 2015 för 14 murina EST som i linje med Bcrp1 exon 2. Dessa visas i tabell 1.
- Identifiera läget för den EST-sekvens som är 5 'till exon 2 i Bcrp1 genen. Musen Bcrp1 genen är belägen i kromosomen 6 contig NC_000072.6 (GI: 372099104).
- På BLAST hemsida under "Specialized Blast" underrubrik, välj "Justera två (eller fler) sekvenser med hjälp av BLAST (bl2seq)."
- Klistra in textfilen från klippbordet i frågerutan och ange 372099104 i ämnet sekvensen rutan. Optimera för "mycket liknande sekvenser" enligt programmetval, och kör BLAST.
- När resultatfönstret visas, visa anpassningar grafiskt genom att klicka på "Grafik" i "Poly" fönstret. Använd höger och vänster pilarna och zooma för att fokusera på Bcrp1 / ABCG2 och sekvensuppställningar.
- Spara sekvensuppställningar: välj "ALL" i "Beskrivning" rutan, sedan under "download" dropdown välj "Hit tabell (CSV)" och klicka sedan på "fortsätta." Denna fil innehåller sekvensuppställningen av Bcrp1 exon 2 och anpassning av alla EST-sekvenserna med sekvenslikhet till Bcrp1 Exon2 förhållande till numreringen av nukleotiderna i mus kromosom 6 contig. Varje fullständig EST-sekvensen kan generera flera inpassningar som spänner över regioner 5 'och 3' till exon 2 inkluderande sekvenserna som överlappar med Bcrp1 exon 2.
- Som positionen för 5'-änden av exon 2 kommer att motsvara till nukleotid 58655638 i kromosomen 6 contig, beteckna detta som1, och sedan beräkna positionen för de partiella sekvenserna av varje EST 5 'till 58.655.638. Resultaten för de 14 EST-sekvenser ges i tabell 1.
Obs: Var noga med att analysera EST-sekvenser som är 5 'till en (dvs. ha en negativ nukleotid värde) som potentiella första exoner. Till exempel, i två av de EST: er som är inriktade med Bcrp1 exon 2 som visas i tabell 1 (AI647825 och AI664571) den kvarvarande sekvensen var 3 'till exon 2.
2. Utvärdering av Bcrp1 Alternative promotorfunktion
- Utformning av reporter konstruktioner för Bcrp1 E1U, E1A, E1B och E1C promotorer
- Använda sekvensen av E1U erhållits från att söka EST-databasen, utse de första 5 'nukleotid av E1U som en.
- Skaffa en bakteriell artificiell kromosom (BAC) klon av mus kromosom 6 som innehåller Bcrp1 / ABCG2 gensekvens och sekvensen åtminstone 100 kb uppströmsBcrp1 / ABCG2 gen (se lista över material och utrustning).
- Identifiera en lämplig reportervektor, såsom luciferas reporterplasmid pGL3-Basic.
- Fastställa de multipla kloningsställena i reportervektor. Kpnl, SacI, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, Bglll och Hindlll är de restriktionsendonukleasställen i det multipla kloningsstället av pGL3-Basic vektor, i 5 'till 3'-orientering.
Notera: Sekvensen för rötnings platser är tillgänglig från produktkataloger med företag som producerar de restriktionsenzymer. - Identifiera alla uppslutnings platser i E1U exon och 2 kb region 5 'om E1U användning av mjukvaruprogram såsom DNA5. Identifiera åtminstone två rötnings platser i pGL3-Basic multipelt kloningsställe som inte återfinns i E1U eller 2 kb uppströms region.
Obs: Var noga med att välja ett multipelt kloningsställe restriktionsställe för den framåtriktade primern som är uppströms om en som valts för den omvända primern för att säkerställa att insatsen Will vara i rätt orientering.
- Förbered framåt och bakåt primers för PCR som innehåller sekvenser för de valda pGL3-basic multipelt kloningsställe restriktionsendonukleasställen som använder kommersiella gen / primer syntes tjänster eller primer urval programvara (se lista över material och utrustning). Välja ett framåtriktad primer belägen ~ 2 kb uppströms från E1U sekvensen och en omvänd primer inom E1U sekvensen. De primrar som användes i författarnas tidigare arbete inkorporerade ett Sacl-ställe i den framåtriktade primern, och en Nhel-stället i den omvända primern, och amplifierades den genomiska regionen från cirka -1.906-64 med den första 5 'nukleotid av E1U anges som + 1 (se steg 2.1.1 ovan), och finns i referens 16.
- PCR förstärka E1U genomregion med användning av dessa primers, 0,01 till 1 ug av BAC, och PCR Master Mix innehåller hifi-Taq-polymeras (se lista över material och utrustning) med denaturering vid95 ° C under 30 sekunder, därefter 35 till 40 cykler av PCR, med förlängning vid 72 ° C (2 min), och glödgning och smälttemperaturer som grundar sig på smältegenskaperna hos de primrar som används.
Obs: Användningen av hifi-Taq-polymeras är viktigt för sekvensepromotorregioner som har hög GC-halt. Vid användning av stora genomiska DNA-fragment såsom en BAC som mall, kan den sekundära strukturen av det genomiska DNA: t gör det svårt för PCR-primrar för att binda. Om detta problem uppstår, kan bättre PCR-resultat erhållas om den långa genom-DNA-mall skjuvas försiktigt genom sonikering innan PCR-reaktionen. - Kontrollera längden av den amplifierade PCR-produkten genom att jämföra mot en 1 kb DNA-stege med användning av 0,8% TAE agarosgelelektrofores.
- PCR förstärka E1U genomregion med användning av dessa primers, 0,01 till 1 ug av BAC, och PCR Master Mix innehåller hifi-Taq-polymeras (se lista över material och utrustning) med denaturering vid95 ° C under 30 sekunder, därefter 35 till 40 cykler av PCR, med förlängning vid 72 ° C (2 min), och glödgning och smälttemperaturer som grundar sig på smältegenskaperna hos de primrar som används.
- Digerera PCR-produkten erhålles, och pGL3-Basic vektor, med användning av restriktionsendonukleaser som är specifika för de restriktionsdigereringsställen som införts i de framåtriktade och bakåtriktade primrar som per instructions levereras med restriktionsklyvning enzymer.
- Rena matsmältningen reaktioner som använder kommersiella SV Gel och PCR Clean-Up Systems kit (se lista över material och utrustning), efter satsen protokoll 21.
- Kontrollera matsmältningen och linearisering av vektorn genom att jämföra den mot den oklippta vektorn med användning av agarosgelelektrofores, sedan klippa och rena den digererade vektor-DNA-bandet. Mäta koncentrationen av det renade PCR-produkten och det renade vektorn med hjälp av UV-spektrometri (se lista över material och utrustning).
- Rena matsmältningen reaktioner som använder kommersiella SV Gel och PCR Clean-Up Systems kit (se lista över material och utrustning), efter satsen protokoll 21.
- Förbered E1U reporterkonstruktionen genom ligering av renade, digerrestriktionsenzym PCR-produkt och pGL3-Basic eldflugeluciferas reportervektor (som ingår i reportertestsats, se lista över material och utrustning) på insatsen: vektor förhållanden av 11, 21 och 31, med "T4 DNA-ligas snabb ligeringskit" enligt kit instruktioner 22, varigenom den E1U reporter konstruktion benämndes pGL3-E1U.
- Använd pGL3-E1U plasmid för att transformera bakterier klonalt expandera pGL3-E1U följande instruktioner i TA-kloningskit (se lista över material och utrustning).
- Bekräfta orienteringen och trohet av insatsen genom sekvensanalys.
- Förbered reporter konstruktioner för E1A, E1B och E1C med liknande metodologi som för E1U. Bekräfta trohet insatserna genom sekvensering som i avsnitt 2.1.5.2.
Notera: De promotor skär för E1A, E1B och E1C bör vara ungefär -1875 / + 10, -1847 / + 60, och -1904 / + 83 förhållande till den första 5 'nukleotid (betecknad som en) av E1A, E1B, eller E1C, respektive.
- Reporteranalysförfaranden
Notera: Allmän strategi för reporter analyser: den förmodade promotor (5 'uppströms region) av en gen sätts in i det multipla kloningsstället av en tom "reporter" vektor som innehåller en "reporter genen "(t.ex. eldflugeluciferas) nedströms från det multipla kloningsstället. Vektorn transfekteras sedan in i eukaryota celler som uttrycker genen av intresse. De transverkande faktorer som främjar uttryck av den intressanta genen i dessa celler bör aktivera promotor i den transfekterade reportervektor, vilket orsakar uttryck av eldflugeluciferas, som lätt kan kvantifieras med en luminescens-analys.- Välja lämplig cellinje som ska användas för reporteranalys.
Notera: För att utvärdera aktiviteten av E1U alternativa promotorreporterkonstruktion, är det nödvändigt att transfektera att konstruktion in i celler som uttrycker Bcrp1 under kontroll av E1U promotorn. Den TM4 murina Sertolicellen linje (se lista över material och utrustning) uttrycker Bcrp1 protein och Bcrp1 mRNA innehållande E1U, liksom E1A, E1B, och E1C 5. Som en negativ kontroll, överväga att använda en cellinje som inte uttrycker Bcrp1 protein eller mRNA. - Kultur TM4 cells i 24-brunnsplattor vid en initial densitet på 200.000 celler / brunn i en 1: 1 blandning av Hams F12-medium och Dulbeccos modifierade Eagles medium med 1,2 g / L natriumbikarbonat, 15 mM HEPES supplementerat med 5% hästserum, 2,5% fetalt bovinserum, penicillin (100 lU / ml) och streptomycin (100 | ig / ml), vid 37 ° C, 5% CO2, såsom beskrivits tidigare 5.
- Sex timmar efter placering av celler i odling, transfektera cellerna med 0,2 mikrogram av tomma pGL3-basvektor eller med 0,2 pg av pGL3 vektor innehållande -1906 / + 64 E1U eller -1875 / + 10 E1A eller -1847 / + 60 E1B eller -1904 / + 83 E1C BCRP en radering konstruera tillsammans med 4 ng pRL-TK (en Renilla luciferas-uttryckande vektor) som intern kontroll, med hjälp av en kommersiell DNA-transfektion kit och tillverkarens protokoll 23 (se lista över material och utrustning) .
- 30 timmar efter transfektion, ta bort tillväxtmediet från cultured transfekterade celler. Tvätta cellerna en gång med 200 pl PBS, sedan ta bort tvättlösningen.
- Mäta firefly och Renilla-luciferas-aktivitet med användning av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll 24.
- Uttrycka aktiviteten för varje rör som förhållandet eldfluga luciferasaktivitet dividerat med den inre (Renilla-luciferas) kontroll; övergripande resultaten uttrycks vanligen som aktiviteten hos varje reporter konstruera förhållande till den för celler transfekterade med den tomma pGL3 grundläggande vektor, som ges ett värde av 1.
- Välja lämplig cellinje som ska användas för reporteranalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifiering av BCRP en alternativ promotor utnyttjandet i mus testikel genom analys av ledar exoner
När EST databas på NCBI undersöktes (April 2015) med hjälp av stegen i protokoll 1, EST funnit att var sammanhängande med 5'-änden av exon 2 i BCRP 1-mRNA visas i tabell 1, tillsammans med deras position i genomisk DNA i förhållande till starten av exon 2. En EST härledd från C57BL / 6J-mus testiklar som är belägen intill exon 2 i BCRP 1 mRNA har sekvenser i genomiskt DNA 70 kb uppströms från exon 2, motsvarande E1U (tabell 1). På samma sätt var EST motsvarande E1A, E1B och E1C detekteras. Att notera är att de två EST motsvarande E1C innehöll också E1B skarvade till 5 'änden av E1C. Placeringen av dessa förutsagda första exoner iförhållande till Bcrp1 exon 2 på muskromosom 6 visas i figur 1.
Utvärdering av BCRP ett alternativ promotorfunktionen
Typiska luciferas analysresultat motsvarande E1U, E1A är E1B och E1C promotor-luciferas reporterkonstruktioner transfekterade in TM4 murina Sertoliceller (se avsnitt 2.2) som visas i figur 2A.
I tidigare arbete, var en SF-1-svarselement förutsagda att vara i E1U promotorn 5. Om detta förmodade SF-1-svarselement är involverad i regleringen av Bcrp1 transkription i mus testikel, kommer då mutation (såsom beskrivs i en tidigare uppsats 5) i nämnda svarselement i E1U promotorreporterkonstruktion reducera luciferasaktiviteten som producerats av den konstruktionen när den transfekteras in iTM4-celler. Resultaten av ett typiskt experiment visas i figur 2B. Den muterade konstruktionen visar lägre luciferasaktivitet än FN-muterad konstruktion, med aktivitet jämförbar med den hos den tomma pGL3-basvektor, även i celler med påtvingad uttryck av SF-1 (som beskrivs i ett tidigare papper 5). Påtvingad uttryck av SF-1 ökar aktiviteten hos FN-muterad konstruktion, men inte av den muterade en.
Figur 1. Diagram över den genomiska anpassningen av EST med sekvensidentitet med Bcrp1 exon 2 med mus kromosom 6. Dessa anpassningar identifierades i en dbEST BLAST-sökning utförs i april, var 2015. Fyra olika inriktningar hittades, vilket motsvarar Bcrp1 alternativa första exonerna E1U, E1A, E1B, och E1C. Denna siffra reproduceras från en tidigare publikation 5. 
Figur 2. (A) Reporter analys för Bcrp1 promotorer E1U, E1A, E1B, och E1C i BALB / c Sertoli-cellerna TM4-celler. Data uttrycks som luminiscens av luciferas från eldfluga normaliserad till den hos Renilla luciferas, med hjälp av metoder som beskrivs i avsnitt 2. De redovisade siffrorna är medelvärdet och standardavvikelsen för tre olika experiment, gjort på olika dagar. Asterisken indikerar en signifikant skillnad från den tomma pGL3 smittospridare hjälp av t-test (P <0,01). Denna siffra reproduceras från en tidigare publikation 5. (B) Effekter av mutation av SF-1 responselement i Bcrp1 E1U reporter bygga på luciferasaktivitet. Bcrp1 reporter konstruktioner med den förmodade SF-1-bindande region (muterad eller un-muterad) transfekterades in i TM4-celler med (SF-1 transfekterade) och utan (vektor transfekteras) den påtvingade uttrycket av SF-1.Den data visas är medelvärdet 3 olika experiment, gjort på olika dagar; att felstaplarna representerar standardavvikelser. För varje experiment ades individuella analyser gjordes i duplikat. I figuren, (A) betecknar en signifikant skillnad från den tomma vektorn pGL3-kontroll (P <0,05) med användning av t-test, (B) betecknar en statistiskt signifikant skillnad jämfört med E1U promotorkonstruktionen med användning av t-test (P < 0,05). Denna siffra reproduceras från en tidigare publikation 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Blast söka mus EST databasen mot sekvensen av den andra exon av Bcrp1 25 -28. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Majoriteten av de metoder och representativa resultat som presenteras beskrivs i tidigare verk med titeln "B crp1 transkription i mus testiklar styrs av en promotor uppströms om en ny första exon (E1U) regleras av steroidogena faktor-1", som publicerades i 2013 5 . Utöver de representativa resultat avbildas här, tidigare Latrin uppskattningar av alternativ första exon utnyttjandet med hjälp av 5'-RACE-PCR och RT-PCR-metodik. Vidare in silico identifiering av en förmodad SF-1 responselement i promotorn uppströms från E1U genomfördes, och kromatin immunoprecipitation (chip) analyser visade att SF-1 bunden till den förmodade SF-1 responselement. Funktionella studier visade att i murina Sertoliceller är BCRP en transkription kontrollerad av SF-1 via SF-1 responselement i E1U promotorn. Dessa funktionella studier ingår uppreglering av SF-1 i TM4-celler genom transfection eller genom användning av en histondeacetylasinhibitor (vorinostat), vilket resulterade i ökad expression av BCRP en E1U mRNA, och en ökning av BCRP ett protein såväl som aktiviteten av BCRP en E1U promotor i en reporteranalys. Slutligen, dessa studier visade att i testiklarna från vuxna Sertoli-cellspecifika SF-1 knockoutmöss, uttryck för BCRP en E1U mRNA, total BCRP ett mRNA, och Bcrp1 protein markant minskade 5. Samma arbete rapporterade också av uttrycksmönstret för Bcrp1 mRNA-isoformer i en mängd olika murina vävnader inklusive njure, lever, testikel, hjärna, hjärta, lunga, muskel och mjälte 5.
De protokoll som beskrivs här - med hjälp av vävnadsspecifika regleringen av BCRP en som modell - ger en enkel experimentell ram för att riva upp transkriptions komplexiteten hos varje gen för att bestämma dess differentiellauttryck i olika vävnader eller cellulära undertyper. Det måste understrykas att resultaten från protokollsteg som beskrivits för in silico utvärderingar kan vara tidsberoende, eftersom de olika webbplatser som inrymmer programmet och databaser som används kan komma att ändras. In silico metoder som presenteras här utnyttjar söka EST-databasen (dbEST) som tidigare 29 rapporterats, där det uppskattas att cirka 18% av alla mänskliga gener i EST dataset använda alternativa promotorer. Söka i dbEST kan underskatta alternativa första exoner, eftersom andra forskare - med hjälp av en "oligo-kapsling" metod för att producera 1,8 miljoner 5'-end sekvenser av cDNA från många humana vävnader - kunde identifiera förmodade transkriptionsstartställena för mänskliga gener och uppskattning att 52% av de humana RefSeq generna undersökta möjligen regleras av alternativa promotorer 1. Intressant nog fann den senare studien attvävnader som utnyttjade förmodade alternativa promotorer mest var testiklarna och hjärnan; Dessutom fann de att gener som kodar för proteiner besläktade med signaltransduktionsvägar var mer benägna att anställa vävnadsspecifika alternativa promotorer 1. Trots de nämnda nackdelarna, analyserar dbEST ge en grov översikt av 5 'UTR Användning för en speciell gen i flera vävnader med minimal ansträngning.
Även dbEST analys ger en enkel inblick i alternativa första exon användning, rekommenderar vi att utföra 5 'snabb förstärkning av cDNA-ändar (5'-RACE) analys för att kontrollera första exon användning i en vävnad eller cellinje under utredning. Kommersiella kit finns tillgängliga för 5'-RACE, med detaljerade och enkla förfaranden som föreskrivs av tillverkaren (se lista över material och utrustning). Även om något tidskrävande, 5'-RACE studier ger faktiska beräkningar av närvaron samt sekvensen av alternativa första exons i mRNA av intresse; Vidare kan närvaron av multipla transkriptionsstartställena även detekteras 13. För att tillförsäkra tillräcklig representation, krävs sekvensering av åtminstone 15 till 25 kloner. Före sekvensering, är det viktigt att ta bort kontaminerande vektorsekvenser från 5 'RACE produkter. Om detta inte görs, kan BLAST analys misslyckas fullständigt att detektera en sekvensinpassning med musgenomet. När första exon användning är etablerad, kan 5'-RACE resultaten användas för att validera efterföljande kvantitativa RT-PCR-analyser för alternativa första exoner. I allmänhet fann författarna tidigare arbete som det finns god korrelation mellan andelen första exon mRNA kloner utvunna från 5 'RACE och andelen av PCR-produkt återvinnas för en given alternativ första exon från samma vävnad eller cellinje 5. Dessutom var bra korrelation mellan verksamhet luciferas promotorkonstruktioner för alternativa Bcrp1 promotorer ennd uttrycket av den motsvarande alternativa första exon i en speciell cellinje 5.
I sökandet efter vävnadsspecifika alternativ promotor användning, om hela organ används, måste man vara medveten om att de alternativa promotorer / första exoner funna kommer att återspegla vävnad heterogenitet organ såsom körtel element, blodkärl, stroma, etc. För exempelvis är den testikel en blandning av somatisk (Leydig, Sertoli, myoid, och endotel-celler) och germinala (haploida) celler, såväl som vaskulatur. Att sondera för vävnadsspecifik första exonet uttryck, kommer det att vara nödvändigt att isolera specifika vävnader från organen.
Andra metoder har rapporterats för att identifiera alternativa promotoranvändning och reglering; men dessa kräver nästa generations sekvensering och bioinformatik beräkna det möjligt att analysera den stora mängd data som produceras. Dessa metoder innefattar hela transcriptosome sekvensering (RNA punkter), och Chip-punkter avhistoner som H3K4me3, som företrädesvis binder till initiativtagare 30. Även om dessa metoder kan vara dyrt att utföra de-novo, när fokus är på uttryck av ett fåtal specifika gener och vävnader, kan utvinning av befintliga data vara en mer praktisk inriktning.
Analyserna för att uppskatta promotoraktivitet presenteras här anställa pGL3-basvektor, vilken innehåller en multipel kloningsregion uppströms från luciferasgenen från eldfluga. Promotoraktivitet mäts genom produktion av eldflugeluciferas, som lätt kvantifieras, efter tillsats av kofaktorer och en självlysande substrat, genom mätning av luminiscens i en kommersiell luminometer (se lista över material och utrustning). Den relaterade pGL4 vektor kan göras för att innehålla selekterbara markörer (t.ex. neomycin, hygromycin, puromycin), vilket möjliggör produktion av stabilt transfekterade celler. De protokoll som anges i detta dokument utnyttjar transient transfektion. Typiskt, reporter analyser för Promoter verksamhet görs med samtransfektion med en vektor som konstitutivt uttrycker Renilla (havs Pansy) luciferas (pRL-TK), för att kontrollera för variationer i cellantal och effektivitet transfektion. Ett kritiskt steg i upprättandet av en promotor analys för en given gen är att vara säker på att genen av intresse uttrycks i cellinjen som transfekteras med reporterkonstruktionen. Det andra, när alternativa promotoranvändning är närvarande, är det viktigt att använda promotorkonstruktionen som motsvarar den alternativa första exonen uttrycks i cellinjen transfekteras. Till exempel, inte förvänta sig att se luminiscens för E1U promotorkonstruktionen som transfekteras in i celler som uttrycker Bcrp1 enbart under kontroll av den E1B promotorn. Alternativt, som en negativ kontroll, transfektion av reportern-konstruktionen i en cellinje som inte uttrycker genen eller mRNA-isoformen av intresse bör resultera i ingen produktion av eldflugeluciferas.
consequences alternativa promotoranvändning omfattar produktion av samma protein, produktion av proteiner med olika N-terminaler, eller produktion av olika proteiner 29. I fallet med Bcrp1 / BCRP, flertal styra (vävnads- eller cell typspecifika) promotorer produktionen av samma protein. Ett liknande mönster finns för CYP19 (aromatas) gen 29, 31. De protokoll som presenteras här ger de grundläggande stegen en kan använda för att dechiffrera i en vävnad eller cellinje de komplexa mekanismerna för transkriptionskontroll av ett protein av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Douglas D. Ross och University of Maryland, Baltimore hålla patenträttigheter för människors BCRP.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Merit Review Awards till Douglas D. Ross och till Arif Hussain från Department of Veterans 'Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
