Summary
De muizen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als voorbeeld, in-silico protocollen worden alternatieve promoter gebruik detecteren genen tot expressie gebracht in muizenweefsels en de functionaliteit van de alternatieve promotors geïdentificeerd onder toepassing reporter assays te evalueren.
Abstract
Genexpressie in verschillende weefsels wordt vaak gecontroleerd door alternatieve promotors die resulteren in de synthese van mRNA met unieke - meestal onvertaald - eerste exons. Bcrp1 (ABCG2), de muizen ortholoog van de ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), heeft ten minste vier alternatieve promoters die door de bijbehorende vier alternatieve eerste exons geproduceerd worden aangeduid: E1U, E1A, E1B en E1C. Hierin, in-silico protocollen worden alternatieve promoter gebruik voorspellen Bcrp1. Verder zijn reporter assay werkwijzen beschreven reporter constructen alternatieve promotors te produceren en de functionaliteit van putatieve promotors stroomopwaarts van de eerste alternatieve exons die geïdentificeerd bepalen.
Introduction
Meer dan de helft van de menselijke genen worden gereguleerd door alternatieve promoters 1. Elke alternatieve promoter kan regulerende elementen die verschillen van die in andere alternatieve promoters kunnen zijn. De promoter (s) toegepast in een weefsel kan verschillen van die welke in een ander weefsel. Zo is het mogelijk dat activatie van een bepaalde signaalweg alternatieve promotor voor een gen gebruikt in een weefsel kan veroorzaken, maar hebben geen effect op of onderdrukken een aparte alternatieve promotor voor hetzelfde gen dat wordt gebruikt in een ander weefsel.
Expressie van het Bcrp1 gen wordt beheerst door alternatieve promotors. Bcrp1 is de muizen ortholoog van het menselijk Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) gen. BCRP is een ATP-bindende cassette (ABC) transporter, formeel aangewezen ABCG2 2, 3. Als apicale plasmamembraan eiwit BCRP / Bcrp1 functies uiteenlopende natuurlijke en xenobiotische substraten uitstromen
In vroege werk de regeling van BCRP expressie in normale en neoplastische cellen te begrijpen, 5 'snelle amplificatie van cDNA-uiteinden (5'-RACE) analyse van BCRP mRNA werd uitgevoerd om de precieze transcriptionele startplaats 13 bepalen. Niet alleen waren meerdere transcriptie startplaatsen gevonden; ook ondervonden werden drie verschillende vormen van het eerste exon, die BCRP is onvertaald. Deze alternatieve eerste exons - aangewezen E1a, E1b, E1C - zijn verschillend tot expressie gebracht in diverse menselijke weefsels. Twee extra eerste exon varianten werden ontdekt in een BLAST-onderzoek van de menselijke EST-gegevensbank met het tweede exon van BCRP 13. Vier wedstrijden onthulde een eerste exon> 70 kb stroomopwaarts van exon 2 die zijn aangewezen E1u; vier andere wedstrijden bleek BCRP mRNA dat een eerste exon geheel ontbrak, die werden aangeduid N1- 13. De aanwezigheid van alternatieve exons leader wordt beschouwd als een manifestatie van alternatieve promoter gebruik 14 zijn.
Bij muizen, worden vier alternatieve eerste exons van Bcrp1 beschreven die kunnen overeenkomen met alternatieve promotors die bepalen Bcrp 1 transcriptie in verschillende muis weefsels; deze exons / promotoren zijn aangewezen E1U, E1A, E1B en E1C en zijn zich ongeveer 70, 58, 15 en 5 kb stroomopwaarts van exon 2 Bcrp1 5, 15. De E1A mRNA isovorm werd gevonden overheersende in Murin te zijne hematopoietische stamcellen, hart, long, milt en hersenen, terwijl de E1B isovorm muizendarm, foetale levercellen en erythroïde voorlopercellen werd tot expressie gebracht in beenmerg 5, 15. De promoter stroomopwaarts van E1B bleek de belangrijkste alternatieve promoter betreffende Bcrp1 transcriptie in muizendarm zijn gereguleerd althans gedeeltelijk, door fosfo-cyclisch-AMP respons element bindend eiwit (p-CREB) en een CREB responselement uniek dat alternatieve Bcrp1 promotor 16. De E1C mRNA isovorm wordt voornamelijk tot expressie gebracht in volwassen muizen lever en nieren 5. De E1U isovorm niet detecteerbaar in de meeste geteste behalve muizen testis, waar de overheersende isovorm tot expressie 5 weefsels. Bcrp1 uitgedrukt in rat testes is te vinden in zowel somatische (endotheel krappe kruispunten, peritubulaire myoid cellen en Sertoli-cellen) en kiemcellen (in de seminiferous endotheel, waar het kan beschermen laat stadium spermatiden 4). de region stroomopwaarts van E1U bevat een functionele respons element voor steroïdogene factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA en eiwit aanzienlijk verminderd in de testes van Sertoli celspecifieke SF-1 knockout muizen, wat suggereert dat Bcrp1 expressie in muis Sertoli cellen wordt gecontroleerd door SF-1 5.
De protocollen detail gepresenteerd methoden alternatieve eerste exons van Bcrp1 detecteren in-silico, en luciferase-gebaseerde reporter assays voor putatieve promotors vast stroomopwaarts van de eerste alternatieve exons geïdentificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In Silico Voorspelling van Alternative Eerste Exons van Bcrp1 Met behulp van BLAST analyse van de Muis EST Database
Let op: Dit protocol beschrijft hoe u de muis expressed sequence tag (EST) databank voor EST's met sequentie-overeenkomst met exon 2 van Bcrp1 (die bevat de translationele startplaats) te zoeken en vervolgens hoe de matching EST-sequenties af te stemmen op genomische sequenties vast te stellen hun locatie in de muis Bcrp1 gen ten opzichte van het 5'-uiteinde van exon 2 Bcrp1.
- Het verkrijgen van de sequentie voor muis Bcrp1 exon 2 door het invoeren van het mRNA referentie sequentie ID (NM_011920.3) in het zoekvenster van de Ensembl Genome Browser 17, klik op "GO". In het volgende scherm selecteert u een sequentie van volledige lengte (bevat 16 exons):
- In het volgende scherm ( "-Afschrift based display"), selecteer "16 Exons." Dit zal een scherm met de volgorde van alle exons van Bcrp1 weer te geven. Exon 2 van Bcrp1 zal lezen "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 '' De verkregen resultaten zijn vergelijkbaar met die getoond in referentie 18 zijn..
- Klik op de optie 'Download sequentie ". In het volgende scherm kiest u de FASTA formaat, en klik vervolgens op "Preview". In het volgende scherm, kopieert u de preview sequentie van exon 2 naar het klembord.
- Navigeer naar de BLAST homepage 19 op het National Center for Biotechnology Information (NCBI) website 20.
- Selecteer "Muis" genoom. Plak de exon 2-sequentie van het klembord in het zoekvak.
- Selecteer 'EST's "uit de database dropdown, optimaliseren voor" zeer vergelijkbare sequenties, "en kies dan" BLAST. " Run tijd zal een paar minuten duren. Wanneer de BLAST run is voltooid, wordt de "Results" pagina verschijnen.
- Onder de "Beschrijvingen" onderverdeling van de "Results" pagina, selecteer "ALL" en vervolgens op "Download" en vervolgens "FASTA (compleetvolgorde) "in het dropdown-menu en kies dan" Continue "Een .txt bestand wordt weergegeven,. openen en kopieer het gehele bestand naar het klembord De .txt bestand bevat de sequenties van alle EST's met een hoge sequentie-overeenkomst met de muis Bcrp1 exon2. maar hun positie ten opzichte van exon 2 in het Bcrp1 gen.
Opmerking: Een analyse uitgevoerd op 15 april 2015 geïdentificeerd 14 murine EST's die afgestemd Bcrp1 exon 2. Deze zijn in Tabel 1 opgesomd.
- Identificeer de locatie van de EST sequentie die 5 'tot exon 2 in het Bcrp1 gen. De muis Bcrp1 gen is gelokaliseerd in het chromosoom 6 contig NC_000072.6 (GI: 372.099.104).
- Op de BLAST homepage onder de "Specialized Blast" onderverdeling, selecteer "Lijn twee (of meer) sequenties met behulp van BLAST (bl2seq)."
- Plak de tekst bestand van het klembord in de zoekbalk en voer 372099104 in het vak onderwerp volgorde. Optimaliseren voor "zeer vergelijkbare sequenties" in het kader van het programmaselectie en voer BLAST.
- Zodra het venster resultaten verschijnt, bekijk de rooilijnen grafisch door te klikken op "Graphics" in het venster "Groeperingen". Gebruik de linker en rechter pijlen en zoom om zich te concentreren op Bcrp1 / ABCG2 en de volgorde uitlijning.
- Sla de volgorde uitlijningen: selecteer "ALL" in het vak "Beschrijvingen", dan onder de "download" dropdown selecteer "Hit tabel (CSV)," en klik vervolgens op "voort te zetten." Dit bestand bevat de sequentie uitlijning van Bcrp1 exon 2 en de uitlijning van de EST-sequenties met sequentieovereenkomst Bcrp1 exon2 opzichte van de nummering van de nucleotiden in de muis chromosoom 6 contig. Elke volledige EST-sequentie uitlijningen kunnen meerdere spanning regio 5 'en 3' genereren met exon 2 inclusief de sequenties overlapt Bcrp1 exon 2.
- De positie van het 5'-uiteinde van exon 2 komt overeen met nucleotide 58.655.638 in het chromosoom 6 contig, wijzen deze als1, en vervolgens het berekenen van de positie van de partiële sequenties van elk EST 5 'tot 58.655.638. De resultaten van de 14 EST's zijn vermeld in tabel 1.
Opmerking: Wees voorzichtig om EST-sequenties die 5 'to 1 (dat wil zeggen, hebben een negatieve nucleotide-waarde) als mogelijke eerste exons analyseren. Bijvoorbeeld in twee van de EST's die afgestemd Bcrp1 exon 2 in tabel 1 (AI647825 en AI664571) de resterende sequentie 3 'tot exon 2.
2. Evaluatie van Bcrp1 Alternative Promoter Functie
- Het ontwerp van de reporter constructen voor Bcrp1 E1U, E1A, E1B en E1C promotors
- Met de sequentie van E1U verkregen uit het doorzoeken van de EST gegevensbank, wijzen de eerste 5 'nucleotide van E1U als 1.
- Verkrijgen van een bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) kloon van muis chromosoom 6 dat de Bcrp1 / ABCG2 gensequentie en de sequentie ten minste 100 kb stroomopwaarts van de bevatBcrp1 / ABCG2 gen (zie lijst van materialen en apparatuur).
- Identificeer een geschikte reporter vector zoals luciferase reporter plasmide pGL3-Basic.
- Bepaal de meervoudige kloneringsplaatsen in de reporter vector. Kpnl, Sacl, Mlu1, NheI, Smal, XhoI, BglII en HindIII de restrictie endonuclease plaatsen in de meervoudige kloneringsplaats van de vector pGL3-Basic, in de 5 'tot 3' oriëntatie.
Opmerking: De sequentie van het digestieplaatsen is verkrijgbaar product catalogi van bedrijven die de restrictie-enzymen. - Identificeer alle spijsvertering sites in de E1U exon en de 2 kb regio 5 'van E1U gebruik van software programma's zoals DFNA5. Identificeer ten minste twee digestieplaatsen in de pGL3-Basic meervoudige kloneringsplaats die niet zijn gevonden in E1U of 2 kb stroomopwaartse gebied.
Opmerking: Zorg ervoor dat een meervoudige kloneringsplaats restrictieplaats voor de voorwaartse primer die stroomopwaarts van de gekozen omgekeerde primer kiezen zodat het inzetstuk will in de juiste oriëntatie.
- Bereid voorwaartse en achterwaartse primers voor PCR die sequenties voor de geselecteerde pGL3-basic meervoudige kloneringsplaats restrictie-endonucleaseplaatsen gebruik van commerciële gen / primer synthese diensten of primer selectie software (zie lijst van materialen en apparatuur) bevatten. Selecteer een voorwaartse primer gelegen ~ 2 kb stroomopwaarts van de E1U sequentie en een reverse primer binnen de sequentie E1U. De primers gebruikt in de auteurs eerdere werk opgenomen van een SacI-plaats in de voorwaartse primer, en een Nhel-plaats in de omgekeerde primer, en versterkt de genomische regio van ongeveer -1.906-64 met de eerste 5 'nucleotide van E1U opgegeven als + 1 (zie stap 2.1.1 hierboven), en worden gegeven in referentie 16.
- PCR versterken de E1U genomische regio met behulp van deze primers, 0,01 tot 1 ug van het BAC, en PCR Master Mix die high-fidelity Taq polymerase (zie de lijst van materialen en apparatuur) met denaturerende op95 ° C gedurende 30 seconden, vervolgens 35 tot 40 cycli van PCR, met verlenging bij 72 ° C (2 min) en annealing en smelttemperaturen basis van de smelteigenschappen van de gebruikte primers.
Opmerking: Het gebruik van high-fidelity Taq polymerasen essentieel voor sequencing promotergebieden die hoge GC inhoud. Bij gebruik van grote genomische DNA-fragmenten zoals een BAC als de matrijs, kan de secundaire structuur van het genomische DNA moeilijk voor PCR primers binden maken. Als dit probleem zich voordoet, kan beter PCR resultaten worden verkregen als de lange genomische DNA matrijs zachtjes afgeschoven door sonicatie voor de PCR-reactie. - Controleer de lengte van het geamplificeerde PCR-product door vergelijking met een 1 kb DNA ladder bij 0,8% TAE agarose gelelektroforese.
- PCR versterken de E1U genomische regio met behulp van deze primers, 0,01 tot 1 ug van het BAC, en PCR Master Mix die high-fidelity Taq polymerase (zie de lijst van materialen en apparatuur) met denaturerende op95 ° C gedurende 30 seconden, vervolgens 35 tot 40 cycli van PCR, met verlenging bij 72 ° C (2 min) en annealing en smelttemperaturen basis van de smelteigenschappen van de gebruikte primers.
- Digest het verkregen PCR-product en de pGL3-Basic vector, met de restrictie-endonucleasen specifiek voor de restrictiedigestie plaatsen geïntroduceerd in de voorwaartse en achterwaartse primers volgens instructions met de restrictie verteringsenzymen geleverd.
- Zuiver het spijsvertering reacties met behulp van commerciële SV Gel en PCR Clean-Up Systems kit (zie de lijst van materialen en apparatuur), naar aanleiding van de kit protocol 21.
- Verifiëren spijsvertering en linearisatie van de vector een vergelijking tegen de ongesneden vector middels agarosegelelektroforese knip en zuiveren gedigereerde vector-DNA band. Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product en het gezuiverde vector met behulp van UV-spectrometrie (zie lijst van materialen en apparatuur).
- Zuiver het spijsvertering reacties met behulp van commerciële SV Gel en PCR Clean-Up Systems kit (zie de lijst van materialen en apparatuur), naar aanleiding van de kit protocol 21.
- Bereid de E1U reporter construct door ligatie van het gezuiverde, restrictie-enzym geknipte PCR product en pGL3-Basic vuurvlieg luciferase reporter vector (in de verslaggever testkit, zie Lijst van materialen en apparatuur) op insert: vector verhoudingen van 11, 21 en 31, met "T4 DNA ligase snel ligation kit" kit volgens de instructies 22, om daardoor de E1U reporter construct, genaamd pGL3-E1U.
- Gebruik de pGL3-E1U plasmide om bacteriën te transformeren naar klonaal uitbreiden pGL3-E1U volgens de instructies in de TA-klonen kit (zie de lijst van materialen en apparatuur).
- Bevestig de oriëntatie en de trouw van het inzetstuk door sequentie-analyse.
- Bereid reporter constructen voor E1A, E1B en E1C toepassing van soortgelijke methodologie voor E1U. Bevestig de trouw van de inserts door sequentiebepaling zoals in paragraaf 2.1.5.2.
Opmerking: De promoter inzetstukken voor E1A, E1B en E1C moet ongeveer -1875 / + 10, -1847 / + 60 en -1904 / + 83 ten opzichte van de eerste 5 'nucleotide (aangeduid als 1) van E1A, E1B, of E1C, respectievelijk.
- Reporter testmethoden
Opmerking: Algemene strategie reporter assays: de vermeende promotor (5 'stroomopwaartse gebied) van een gen wordt in de meervoudige kloneringsplaats van een lege "reporter" vector die een "reporte bevat ingevoegdr-gen "(bijvoorbeeld vuurvlieg luciférase) stroomafwaarts van de meervoudige kloneringsplaats. Vervolgens wordt de vector getransfecteerd in eukaryotische cellen die het gen van belang tot expressie. De trans-werkende factoren die expressie van het gen van belang in deze cellen te bevorderen moet activeren promoter in getransfecteerde reporter vector, waardoor expressie van vuurvlieg luciferase, die gemakkelijk kan worden gekwantificeerd met een luminescentie assay.- Selecteer de geschikte cellijn gebruiken voor de reporter assay.
Opmerking: Om de activiteit van de E1U alternatieve promotor reporter construct evalueren, is het nodig dat transfecteren construct in cellen die Bcrp1 expressie onder controle van de promoter E1U. De TM4 muizen Sertoli cellijn (zie lijst van materialen en apparatuur) drukt Bcrp1 eiwit en Bcrp1 mRNA bevatten E1U, evenals E1A, E1B en E1C 5. Als een negatieve controle, overweeg dan het gebruik van een cellijn die niet Bcrp1 eiwit of mRNA expressie brengt. - Cultuur van de TM4 cells in 24-wells platen bij een initiële dichtheid van 200.000 cellen / putje in een 1: 1 mengsel van Ham's F12 medium en gemodificeerd Eagle's medium Dulbecco's met 1,2 g / L natriumbicarbonaat, 15 mM HEPES aangevuld met 5% paardenserum, 2,5% foetaal runderserum, penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml) bij 37 ° C, 5% CO2, 5 zoals eerder beschreven.
- Zes uur na het plaatsen van de cellen in kweek te transfecteren de cellen met 0,2 pg pGL3-basic lege vector of met 0,2 ug pGL3 vector die het -1906 / + 64 E1U of -1875 / + 10 E1A of -1847 / + 60 E1B of -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 deletieconstruct samen met 4 ng pRL-TK (een Renilla-luciferase tot expressie vector) als interne controle, met behulp van een commerciële DNA-transfectie kit en protocol van de fabrikant 23 (zie lijst van materialen en apparatuur) .
- 30 uur na transfectie, verwijder de groeimedia van de Cultured getransfecteerde cellen. Was de cellen eenmaal met 200 pi PBS, verwijder vervolgens de wasoplossing.
- Meet vuurvlieg en Renilla luciferase-activiteit met behulp van een commerciële kit volgens de protocollen van de fabrikant 24.
- Drukken de activiteit voor elke buis als de verhouding van vuurvlieg luciferase activiteit gedeeld door de interne (Renilla luciférase) controle; algemene resultaten worden gewoonlijk uitgedrukt als de activiteit van elke reporter construct opzichte van dat van cellen die met de lege vector pGL3 basis, waarbij een waarde van 1 wordt gegeven.
- Selecteer de geschikte cellijn gebruiken voor de reporter assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificatie van Bcrp 1 alternatieve promotor gebruik in de muis testis door analyse van leider exons
Wanneer de EST gegevensbank bij NCBI werd geprobed (april 2015) met de stappen in Protocol 1, de EST gevonden dat grenst aan het 5 'uiteinde van exon 2 in Bcrp waren 1 mRNA worden weergegeven in Tabel 1, samen met hun positie in genomische DNA ten opzichte van de start van exon 2. Een EST afgeleid van C57BL / 6J muizen testis dat grenst aan exon 2 in Bcrp 1 mRNA sequenties in genomisch DNA 70 kb stroomopwaarts van exon 2, overeenkomend met E1U (tabel 1). Evenzo EST's corresponderen met E1A, E1B, E1C en werden gedetecteerd. Opmerkelijk is dat de twee ESTs overeenkomen met E1C bevatten ook E1B gelast aan het 5 'uiteinde van E1C. De locatie van deze eerste voorspelde exonsopzichte Bcrp1 exon 2 op muis chromosoom 6 is weergegeven in figuur 1.
Evaluatie van Bcrp 1 alternatieve promoter functie
Typische luciferasetest resultaten die overeenkomen met E1U, E1A, E1B en E1C promotor-luciferase reporter constructen getransfecteerd in TM4 muizen Sertoli cellen (zie paragraaf 2.2) zijn weergegeven in figuur 2A.
In eerder werk werd een SF-1 responselement voorspeld in de E1U 5 promoter. Als dit kandidaat SF-1 responselement is betrokken bij de regulatie van Bcrp1 transcriptie muis testis, dan mutatie (zoals beschreven in een vorige artikel 5) van genoemde responselement in de E1U promotor reporter construct de luciferase activiteit door dit construct verlagen wanneer getransfecteerd inTM4 cellen. Resultaten van een typisch experiment zijn weergegeven in figuur 2B. Het gemuteerde construct blijken lagere luciferaseactiviteit dan de niet-gemuteerde construct met activiteit vergelijkbaar met die van de lege vector pGL3-basic, zelfs in cellen met gedwongen expressie van SF-1 (in een vorige artikel 5 beschreven). Gedwongen expressie van SF-1 verhoogt de activiteit van de niet-gemuteerde construct, maar niet van het gemuteerde één.
Figuur 1. Diagram van de genomische aanpassing van EST met sequentie-overeenkomst met Bcrp1 exon 2 met muizen chromosoom 6. Deze groeperingen werden geïdentificeerd in een dbEST BLAST zoekopdracht uitgevoerd in april, werden in 2015 vier verschillende groeperingen gevonden, wat overeenkomt met alternatieve eerste exons E1U, E1A Bcrp1, E1B en E1C. Dit cijfer wordt gereproduceerd van een voorgaande publicatie 5. 
Figuur 2. (A) Reporter assay voor Bcrp1 initiatiefnemers E1U, E1A, E1B en E1C in BALB / c Sertoli cel afkomstige TM4 cellen. Gegevens worden uitgedrukt als de luminescentie van vuurvlieg luciferase genormaliseerd aan die van Renilla luciferase hand van de in hoofdstuk 2 beschreven getoonde gegevens zijn het gemiddelde en de standaardafwijking van drie experimenten uitgevoerd op verschillende dagen. Het sterretje geeft een significant verschil met de lege vector pGL3 controle onder toepassing van t-test (P <0,01). Dit cijfer wordt gereproduceerd van een eerdere publicatie 5. (B) Effect van mutatie van het SF-1 responselement in de Bcrp1 E1U reportier bouwen op luciferaseactiviteit. Bcrp1 reporter constructen met de vermeende SF-1-bindend gebied (gemuteerd of niet-gemuteerd) werden getransfecteerd in TM4 cellen met (SF-1 getransfecteerde) en zonder (vector getransfecteerd) de gedwongen expressie van SF-1.Het afgebeelde gegevens zijn het gemiddelde van 3 verschillende experimenten uitgevoerd op verschillende dagen; de fout balken geven standaarddeviaties. Voor elk experiment werden afzonderlijke assays in duplo uitgevoerd. In de figuur (A) geeft een significant verschil met de lege vector pGL3 controle (P <0,05) met de t-test; (B) betekent een significant verschil met de E1U promoterconstruct met de t-test (P < 0,05). Dit cijfer is overgenomen uit een eerdere publicatie 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Blast zoek naar de muis EST-database tegen de sequentie van de tweede exon van Bcrp1 25 -28. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste van de methoden en representatieve resultaten die zijn beschreven in eerdere werk getiteld "B CRP1 transcriptie in muizen testis wordt gecontroleerd door een promoter stroomopwaarts van een nieuwe eerste exon (E1U) gereguleerd door steroïdogene factor-1 ', die in 2013 5 gepubliceerd . Naast de representatieve resultaten hier weergegeven, de vorige Stortbak voor schattingen van alternatieve eerste exon gebruik middels 5'-RACE PCR en RT-PCR methode. Verder in-silico identificatie van een vermoedelijke SF-1 responselement in de promoter stroomopwaarts van E1U werd bereikt en chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays die SF-1 gebonden aan de vermeende SF-1 responselement. Functionele studies toonden dat muizen Sertoli cellen Bcrp 1 transcriptie wordt geregeld door SF-1 via het SF-1 responselement in de E1U promoter. Deze functionele studies omvatten opregulatie van SF-1 in TM4 cellen door transfection of door het gebruik van een histondeacetylase-inhibitor (Vorinostat), wat resulteerde in verhoogde expressie van Bcrp 1 E1U mRNA en verhoging van Bcrp 1 eiwit en activiteit van de Bcrp 1 E1U promoter in een reporter assay. Tot slot, deze studies aangetoond dat in de testes van volwassen Sertoli-cel specifieke SF-1 knockout muizen, de uitingen van Bcrp 1 E1U mRNA, totaal Bcrp 1 mRNA en Bcrp1 eiwit werden aanzienlijk verminderd 5. Hetzelfde werk ook gemeld de expressiepatronen van mRNA Bcrp1 isovormen in verschillende murine weefsels, zoals nier, lever, testis, hersenen, hart, longen, spieren en milt 5.
De hier beschreven protocollen - met behulp van weefsel-specifieke regulering van Bcrp 1 als een model - een gemakkelijke experimentele kader om de transcriptie complexiteit van elk gen te ontrafelen haar differentiële bepalenexpressie in verschillende weefsels of cellulaire subtypen. Benadrukt moet worden dat de resultaten van het protocol stappen beschreven voor in-silico evaluaties resultaten tijdsafhankelijke omdat de verschillende websites die de software en databases gebruikt kunnen worden gewijzigd huis kan zijn. De in-silico methodologie hier gepresenteerde maakt gebruik van het doorzoeken van de EST database (dbEST) zoals eerder 29 gemeld, die geschat dat ongeveer 18% van alle menselijke genen in de EST dataset in dienst alternatieve promotors. Zoeken op het dbEST kunnen alternatieve eerste exons onderschatten, omdat andere onderzoekers - met behulp van een "oligo-capping" methode om 1,8 miljoen 5'-uiteinde sequenties van cDNA's te produceren uit vele menselijke weefsels - waren in staat om vermeende transcriptie startplaatsen voor de menselijke genen en de raming te identificeren dat 52% van de menselijke RefSeq genen werden onderzocht eventueel gereguleerd door alternatieve promoters 1. Interessant is dat de laatste studie bleek dat deweefsels die vermeende alternatieve gebruikte promotors zijn de testis en hersenen; Bovendien vonden zij dat de genen die coderen voor eiwitten die verband houden met transductiepaden signaleren hadden meer kans om weefsel-specifieke alternatieve promotors 1 in dienst. Ondanks de genoemde nadelen, dbEST analyses ook een globaal overzicht van 5 'UTR gebruik van een bepaald gen in verschillende weefsels met minimale inspanning.
Hoewel dbEST analyse geeft een gemakkelijke blik op alternatieve eerste exon gebruik, raden we het uitvoeren van 5 'snelle amplificatie van cDNA-uiteinden (5'-RACE) analyse om eerste exon gebruik te controleren in een weefsel of cellijn in onderzoek. Commerciële kits zijn beschikbaar voor 5'-RACE, met gedetailleerde en duidelijke procedures die door de fabrikant (zie lijst van materialen en apparatuur). Hoewel een beetje tijdrovend, 5'-RACE studies werkelijke schattingen van de aanwezigheid en de sequentie van alternatieve eerste exons in het mRNA van belang; Bovendien, de aanwezigheid van meerdere transcriptie startplaatsen zijn ook aanwezig 13. Om voldoende representativiteit te verzekeren, is sequentiebepaling van minstens 15 tot 25 klonen vereist. Voordat sequencing, is het essentieel om verontreinigende vectorsequenties uit het 5 'RACE producten te verwijderen. Als dit niet gebeurt, kan BLAST analyse helemaal niet tot een sequence alignment met de muis genoom te detecteren. Zodra eerste exon gebruik is vastgesteld, kan de 5'-RACE conclusies worden gebruikt om verdere kwantitatieve RT-PCR testen voor alternatieve eerste exons valideren. In het algemeen eerder werk van de auteurs gevonden dat er een goede correlatie tussen het percentage eerste exon mRNA klonen teruggewonnen door 5 'RACE en het percentage PCR product teruggewonnen voor een gegeven alternatief eerste exon van hetzelfde weefsel of cellijn 5. Daarnaast werd een goede correlatie gevonden tussen de activiteiten van luciferase promoterconstructen alternatieve promoters Bcrp1 eennd de expressie van de corresponderende alternatieve eerste exon in een bepaalde cellijn 5.
In de zoektocht naar weefsel-specifieke alternatieve promotor gebruik, als hele organen worden gebruikt, moet men zich ervan bewust dat de alternatieve promotors / eerste exons vond het weefsel heterogeniteit van het orgel zal weerspiegelen zoals glandulaire elementen, bloedvaten, stroma, etc. bijvoorbeeld, de testis is een combinatie van somatische (Leydig Sertoli, myoid en endotheliale cellen) en germinale (haploïde cellen) en vaatstelsel. Sonderen voor weefselspecifieke expressie eerste exon, is het noodzakelijk om specifieke weefsels van de organen geïsoleerd.
Andere methoden zijn gemeld voor de identificatie van alternatieve promotor gebruik en regelgeving; maar deze vereisen nieuwe generatie sequencing en bioinformatica berekenen kan analyseren de grote hoeveelheid data geproduceerd. Deze methoden zijn heel transcriptosome sequencing (RNA volgende), en ChIP-seq vanhistonen zoals H3K4me3, die bij voorkeur bindt aan promotoren 30. Hoewel deze werkwijzen duur om de novo te voeren, wanneer de nadruk op de expressie van een aantal specifieke genen en weefsels kunnen worden, kunnen winning van bestaande gegevens een praktische aanpak.
De assays voor het schatten van promoteractiviteit die hier gebruik van de pGL3-basis vector, die een multipele kloneringsplaats bevat stroomopwaarts van het vuurvlieg luciferasegen. Promotor activiteit wordt gemeten door de productie van vuurvlieg luciferase, die gemakkelijk wordt gekwantificeerd, na toevoeging van co-factoren en een luminescente substraat, door het meten van luminescentie in een commerciële luminometer (zie lijst van materialen en apparatuur). De gerelateerde pGL4 vector kan worden gegeven aan selecteerbare merkers (bijvoorbeeld neomycine, hygromycine, puromycine) bevatten, maakt de productie van stabiel getransfecteerde cellen. De protocollen die in dit document gebruiken transiënte transfectie. Gewoonlijk reporter assays voor promER-activiteit worden gedaan met behulp van co-transfectie met een vector die constitutief tot expressie Renilla (Renilla reniformis) luciférase (pRL-TK), om te controleren voor variaties in het aantal cellen en de efficiëntie van transfectie. Een kritische stap voor de vaststelling van een promoter assay voor een bepaald gen om zeker dat het gen van belang tot expressie wordt gebracht in de cellijn die is getransfecteerd met de reporterconstruct. Ten tweede, als alternatief gebruik promoter aanwezig is, is het belangrijk om de promoter construct dat overeenkomt met de alternatieve eerste exon expressie in de cellijn getransfecteerd gebruiken. Bijvoorbeeld, verwacht niet dat luminescentie zien voor de E1U promotor construct dat wordt getransfecteerd in cellen die Bcrp1 uitdrukken uitsluitend onder de controle van de E1B promoter. Als alternatief, als een negatieve controle, transfectie van de reporter construct in een cellijn die niet tot expressie het gen of mRNA isovorm van belang moeten leiden tot geen productie van vuurvlieg luciferase.
de cEVOLGEN alternatieve promoter gebruik omvatten de productie van hetzelfde eiwit, de productie van eiwitten met verschillende N-termini, of de productie van verschillende eiwitten 29. Bij Bcrp1 / BCRP, verschillende (typespecifieke weefsel- of cel) promoters controle van de productie van hetzelfde eiwit. Eenzelfde patroon bestaat voor het CYP19 (aromatase) gen 29, 31. De protocollen die hier over een fundamentele stappen men kan gebruiken om ontcijferen in een weefsel of cellijn de complexe mechanismen van transcriptionele controle van een eiwit van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Douglas D. Ross en de Universiteit van Maryland, Baltimore houden patentrechten voor de menselijke BCRP.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling Awards Douglas D. Ross en Arif Hussain van het Department of Veterans 'Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
