Abstract
تشمل جميع الإجراءات الجيل المقبل من التسلسل (خ ع) فحوصات أجريت في مقاعد البدلاء المختبر ( "مقعد الرطب")، وبيانات التحليلات التي أجريت باستخدام المعلوماتية الحيوية خطوط الأنابيب ( "مقعد الجافة"). كلا العناصر ضرورية لتحقيق نتائج دقيقة وموثوق بها، والتي تعتبر بالغة الأهمية خاصة بالنسبة للمختبرات السريرية. وقد وجدت تقنيات خ ع تزايد استهداف صالح في تطبيقات علم الأورام للمساعدة في الأهداف الطب الدقة مسبقة، إلا أن الأساليب غالبا ما تنطوي على قطع ومتغير الرطب والجاف سير العمل مقاعد البدلاء، ومجموعات الكاشف غير منسقة. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا لتسلسل تحديا عينات السرطان مع لوحة 21-جين كمثال على نظام خ ع المستهدفة شامل. نظام يدمج وظيفية الكمي الحمض النووي والتأهيل، واحد أنبوب المضاعفة تخصيب PCR، وتنقية مكتبة والتطبيع باستخدام التحقق التحليلية، الكواشف واحد المصدر مع مجموعة المعلوماتية الحيوية مستقل.ونتيجة لذلك، يدعو دقيق البديل من منخفضة الجودة وكمية منخفضة الثابتة الفورمالين، (FFPE)، ويمكن أن يتحقق غرامة بالإبرة (FNA) خزعات الورم جزءا لا يتجزأ من البارافين. هذه الطريقة يمكن تقييم روتيني المتغيرات المرتبطة بالسرطان من المدخلات من 400 نسخة الحمض النووي amplifiable، وليس وحدات في تصميم لاستيعاب محتوى الجين الجديد. نوعين مختلفين من الضوابط المحددة من الناحية التحليلية، وتوفر ضمان الجودة وتساعد على الحفاظ على دقة الدعوة مع عينات سريريا ذات الصلة. أ "سمة" خطوة PCR مرنة ضمنت الفيديو محولات الخاصة بالنظام الأساسي ورموز مؤشر للسماح عينة المتوازية والتوافق مع الفوق المشترك أدوات خ ع. الأهم من ذلك أن البروتوكول هو تبسيط ويمكن أن تنتج 24 مكتبات تسلسل جاهزة في غضون يوم واحد. وأخيرا، فإن نهج يربط العمليات مقاعد البدلاء الرطب والجاف من خلال دمج نتائج الرقابة قبل التحليلية جودة العينة مباشرة إلى البديل الدعوة خوارزميات لتحسين طفرة دقة الكشف والتفريق سلبية كاذبة وindetermالمكالمات إلصدار. يستخدم هذا الأسلوب خ ع المستهدفة التقدم في كل من الجهاز العصبي والبرامج لتحقيق ارتفاع العمق، والتسلسل المضاعفة وتحليل حساسية عينات سرطان غير متجانسة لتطبيقات التشخيص.
Introduction
يعتمد الطب الدقة على الفردية من الخيارات التشخيصية والعلاجية للمرضى. وعد علاجات مصممة هو نتيجة مباشرة لتحسين فهم مسارات الأمراض التي يمكن أن تثري ربط التشخيص الجزيئي والعلاجات المستهدفة. على سبيل المثال، زاد استخدام العلاجات المستهدفة جزيئيا-من 11٪ إلى 46٪ 2003-2013 1، والأدوية المضادة للسرطان مثل vemurafenib وcrizotinib وادارة الاغذية والعقاقير تطهيرها مع الاختبارات التشخيصية رفيق. مع قدرته على استعادة بدقة، وفرة منخفضة أهداف تسلسل عبر مجموعات عينة المضاعفة للغاية، وقد برز جيل المقبل من التسلسل (خ ع) كوسيلة من وسائل الاختيار لتقييم الانحرافات الجينية المرتبطة بسرطان وتحديد الأهداف الجزيئية للطب الدقة.
وتشمل الخزعات السرطانية الصلبة الأكثر شيوعا لاختبار الجزيئي الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) وطموح غرامة إبرة (FNA) specimENS. هذه العينات محفوفة مع كمية منخفضة و / أو ذات جودة منخفضة الأحماض النووية التي تتحدى دقيقة خ ع التقييمات 2-5. وتعتمد أساليب NGS التجارية الحالية لتحليل هذه العينات على خليط من المواد الكيميائية المختلفة، والبروتوكولات، والمعلوماتية الأدوات التي تمثل أهدافا مؤثرة من التحسينات المستمرة. على سبيل المثال، حدثت تغييرات في كيمياء فحص و / أو البرامج كل 1-2 أشهر للالأكثر شيوعا-خ ع مجموعات المستهدفة 6. ويعكس هذا عدم الاستقرار وانعدام التناسق في بناء والتحقق من نظام خ ع موحد لأنواع العينات الصعبة، وخصوصا للاختبار السرطان، ويضع عبئا لا مبرر له على مختبرات لتطوير بروتوكولات متماسكة التي هي الأمثل من عينة إلى النتائج. في الواقع، أبرز الاستطلاع الأخير الذي حدث من المستخدمين خ ع و الصعوبات التي تواجه هذه التقنيات "التغير السريع"، جنبا إلى جنب مع متطلبات المنشأة، والمحتوى طبيا للتنفيذ والخبرة المعلوماتية الحيوية الراسخة، وsolidifiإد والإجراءات المتكاملة التي يمكن تنفيذها بسرعة، وتبسيط سير العمل والبروتوكولات مبسطة تسهل تدريب في موقع العمل (7). في هذه المقالة، يوصف نظام شامل لخ ع المستهدفة التي يعالج هذه الثغرات.
منهجية عرض يدمج جميع الخطوات الإجرائية من قبل التحليلية لمرحلة ما بعد التحليلية في مقاعد كلا الرطب والجاف لتحسين دقة وحساسية، وموثوقية القياس الكمي الهدف والكشف عن NGS من مواضع جين سرطان سريريا ذات الصلة. يبدأ هذا النهج مع الكمي من الحمض النووي "الوظيفي" 4 لتقييم نوعية الحمض النووي، وتوجيه المدخلات في خطوة تخصيب PCR، والحذر من دعوات إيجابية كاذبة التي يمكن أن تنشأ من استجواب النسخ قالب منخفضة جدا. ومتعدد واحد أنبوب PCR ثم يغني لمدة 46 مواضع في 21 جينات السرطان باستخدام فقط 400 نسخة الحمض النووي amplifiable، تليها إدراج تسلسل الخاصة بالنظام الأساسي للخ ع النقيبز أدوات التسلسل سطح المكتب المشترك. ويتم تنقية المكتبات باستخدام إجراء حبة المغناطيسي بسيطة وكميا مع رواية، خالية من معايرة QPCR الفحص. وثمة مجموعة المعلوماتية الحيوية مستقل، أبلغ من قبل عينة نتائج فحص الحمض النووي لمراقبة الجودة لتحسين أداء المكالمة، ويوفر تحليل التسلسل التالي خ ع. نقدم البيانات باستخدام هذا منهج النظم لخ ع المستهدفة للكشف عن الطفرات قاعدة الاستبدال، الإدراج / الحذف (indels)، ونسخ عدد المتغيرات (التنوعات في عدد النسخ) في ذات جودة منخفضة وورم كمية منخفضة الخزعات مثل FFPE وعينات FNA، وتشغيل ضوابط.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول يصف تجهيز وقت واحد من العينات باستخدام نظام MiSeq خ ع و لكن يمكن تكييفها للصك الشخصية الجينوم آلة (PGM). الحد الأدنى الموصى به للمساهمة الحمض النووي من 400 نسخة قالب amplifiable، وفحص قادر على انتاج 3،000x على الأقل تغطية متوسط لكل 96 عينة في خ ع المدى، ويعادل تغطية متعمقة لل24 عينة باستخدام PGM على شريحة 318. وتتطلب هذه الطريقة أيضا استخدام في الوقت الحقيقي PCR الصك.
1. الحمض النووي الكمي الوظيفي ومراقبة الجودة (QC)
- الكواشف ذوبان الجليد: 2X ميكس ماستر، التمهيدي التحقيق ميكس، تثبيط التمهيدي التحقيق ميكس، 6-كربوكسي-X-رودامين (ROX)، مخفف، وأربعة معايير منحنى معايرة الحمض النووي في الجينوم البشري (DNA قياسي (50 نانوغرام / ميكرولتر)، الحمض النووي قياسي (10 نانوغرام / ميكرولتر)، الحمض النووي قياسي (2 نانوغرام / ميكرولتر)، والحمض النووي قياسي (0.4 نانوغرام / ميكرولتر)) (الجدول 1). دوامة جميع الكواشف لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.الحفاظ على مزيج الرئيسي 2X على الجليد.
- إعداد كمية كافية من مزيج الرئيسي لعدد من العينات لفحصها وتشمل 10٪ أكثر حجم لتفادي النقص بسبب pipetting ل. تحضير مزيج الرئيسي في أنبوب microcentrifuge باستخدام أحجام التالية لكل عينة: 5 ميكرولتر 2X ميكس ماستر، 0.5 ميكرولتر التمهيدي التحقيق ميكس، 0.5 ميكرولتر تثبيط التمهيدي التحقيق ميكس، 0.05 ROX ميكرولتر و 2.95 مخفف ميكرولتر. دوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- إضافة مزيج الرئيسي 9 ميكرولتر في الآبار لوحة 96-جيدا.
- إضافة 1 ميكرولتر من المعايير الحمض النووي في نسختين لتوليد منحنى المعايرة. مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا 5 مرات.
- ضمان عينة الحمض النووي مختلطة جيدا قبل الاستعمال. إضافة نموذج 1 ميكرولتر من مزيج الرئيسي ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات.
- ختم لوحة، ودوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- وضع لوحة في نظام PCR. تعيين كل من الاتحاد الماليزي (الكمي وظيفي) ومركز فيينا الدولي (تثبيط وظيفي) كاشفات لكل عينة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أداء دورات PCR لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و 40 دورات (15 ثانية في 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية).
- تحليل البيانات QPCR عن طريق توليد مؤامرة الانحدار الخطي لكل من المعايير الحمض النووي مكررة باستخدام بروتوكولات البرمجيات.
- رسم دخول 10 من عدد نسخ الحمض النووي لكل معيار على محور س والمقابلة FAM C قيمة ف على المحور الصادي.
- تأكد من أن النتائج من سقوط حمض عينة النووي ضمن مجموعة ديناميكية من منحنى معايرة معايير الحمض النووي، ومن ثم حساب تركيز الحمض النووي غير معروف في "وظيفية" أو amplifiable عدد نسخة لكل ميكرولتر من موقف المقابلة على منحنى المعيار المرجعي. ويبين الشكل 1 أمثلة على منحنيات المعايرة التي مرت وفشلت. </ لى>
- تحديد ما إذا حدث التضخيم في كل رد فعل عن طريق التحقق من وجود amplicon الهدف غير البشرية في قناة مركز فيينا الدولي.
ملاحظة: كما تحكم إيجابية، والتحقيق ميكس تثبيط التمهيدي يحتوي الاشعال محددة لهدف خارجي غير البشرية والقالب المقابلة. وتثبيط التمهيدي التحقيق مزيج مكون من مزيج الرئيسي الذي يضاف إلى كل رد فعل، بما في ذلك مراقبة أي قالب (NTC). في حالة عدم وجود المانع، وينبغي دائما أن يتم الكشف عن المنتج PCR لهدف غير البشرية في قناة مركز فيينا الدولي. و"لم يتم كشفها" C س لعينة في القناة VIC يدل على وجود مثبطات PCR التي يمكن أن تستفيد من احقة تنظيف العينة قبل مزيد من المعالجة.
2. إعداد مكتبة: جين محددة (GS) PCR
- إعداد كمية كافية من مزيج الرئيسي لعدد من العينات لفحصها وتشمل 10٪ أكثر حجم لتفادي النقص بسبب pipettجي. تحضير مزيج الرئيسي GS PCR في أنبوب microcentrifuge باستخدام أحجام التالية لكل عينة: 5 ميكرولتر 2X التضخيم ميكس ماجستير (الجدول 1) و 1 ميكرولتر عموم السرطان التمهيدي لوحة (الجدول 1). مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا، دوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- قسامة 6 ميكرولتر GS PCR مزيج الرئيسي في آبار من لوحة 96-جيدا. إضافة 4 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي في الآبار الفردية. إلى الآبار الأخرى، إضافة 4 ميكرولتر من التحكم FFPE (الجدول 1)، و 4 ميكرولتر من السيطرة متعدد البديل (الجدول 1)، و 4 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لNTC الإجرائي. لكل بالإضافة إلى ذلك، مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا 5 مرات.
- ختم لوحة، ودوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- وضع لوحة في thermocycler لدورات PCR التالية: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية،2 دورات (15 ثانية في 95 درجة مئوية، 4 دقيقة في 60 ° C)، 23 دورات (15 ثانية في 95 درجة مئوية، 4 دقيقة في 72 درجة مئوية)، وتمديد النهائي من 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. عقد في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بعد الانتهاء من الخطوة 2.4، سيتم لوحة يشار إلى أن لوحة GS PCR.
3. إعداد مكتبة: العلامة PCR
- الكواشف ذوبان الجليد: 2X مؤشر ميكس ماجستير (الجدول 1) ورموز مؤشر (الجدول 1). دوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
ملاحظة: يتم خلط رموز مؤشر لتقديم مجموعة فريدة من المؤشرات البشرى (الباركود) لكل عينة. - في لوحة 96-جيدا، إضافة 7.5 ميكرولتر من مزيج ماجستير مؤشر 2X و 5.5 ميكرولتر من رمز مؤشر لتحديد جيدا وتخلط بواسطة pipetting صعودا ونزولا 5 مرات.
- بعناية فتح لوحة GS PCR، وإضافة 2 ميكرولتر GS PCR المنتج إلى لوحة جديدة مع مزيج الرئيسي. مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا 5 مرات. لكل عينة، تسجيل معرف عينة ورموز مؤشر البشرى المقابلة. ختم لوحة، ودوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- وضع لوحة في thermocycler وPCR لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و 10 دورات (30 ثانية في 95 درجة مئوية، و 30 ثانية في 55 درجة مئوية، 1 دقيقة في 72 درجة مئوية)، وتمديد النهائي لمدة 10 دقيقة في 72 ° C. عقد في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بعد الانتهاء من الخطوة 3.4، سيتم لوحة يشار إلى علامة PCR لوحة.
4. مكتبة تنقية واختيار الحجم
- إزالة مكتبة بيور الإعدادية حبات مغناطيسية (الجدول 1)، وشطف العازلة (الجدول 1) 2-8 درجة مئوية، والسماح لتتوازن لRT لمدة 30 دقيقة. إضافة 9.6 مل 100٪ من الإيثانول لغسل العازلة (الجدول 1) حاوية، وكأب وتخلط بواسطة قلب الزجاجة عدة مرات.
- دوامة حبات مغناطيسية لمدة 10 ثانية، وإضافة 11 ميكرولتر في آبار منفصلة من 9لوحة 6 جيدا.
- فتح علامة PCR لوحة وإضافة 10 ميكرولتر من بطاقة المنتج PCR إلى المزيج الخرز والماصة 5 مرات. احتضان الخليط لمدة 4 دقائق على RT.
- وضع لوحة 96 جيدا على الوقوف المغناطيسي (الجدول 1) لمدة 4 دقائق. مع لوحة 96-جيدا لا يزال على الموقف، إزالة والتخلص من طاف مع ماصة.
- إزالة لوحة 96-جيدا من الوقوف المغناطيسي وإضافة 100 ميكرولتر التي تحتوي على الإيثانول الاحتياطي اغسل إلى كل بئر وتخلط بواسطة pipetting صعودا ونزولا 5 مرات. احتضان لمدة 2 دقيقة.
- وضع لوحة 96 جيدا على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، ثم إزالة والتخلص من طاف مع ماصة.
- كرر الخطوة 4.5، أي ما مجموعه 2 يغسل الإيثانول، وإزالة أكبر قدر من محلول الغسيل ممكن بعد غسل الثاني.
- مع لوحة 96 جيدا على الوقوف المغناطيسي، تجف حبات لمدة 2 دقيقة في RT، ثم إزالة لوحة من الوقوف.
- resuspend والخرز بإضافة 20 ميكرولتر شطف العازلة لكل أهلا وسهلالتر والماصة صعودا ونزولا 5 مرات.
- احتضان لمدة 2 دقيقة في RT.
- وضع لوحة 96-جيدا مرة أخرى على الوقوف المغناطيسي لمدة 4 دقائق، وإزالة بعناية ونقل 18 ميكرولتر من طاف واضحة لبئر جديد.
ملاحظة: هذا الإجراء يمكن أن توقف بسلام في هذه الخطوة والعينات المخزنة في -15 إلى -30 درجة مئوية. إعادة تشغيل، ذوبان الجليد العينات المجمدة على الجليد قبل المتابعة.
5. الكمي مكتبة
- ذوبان الجليد مكتبة كوانت (LQ) الكواشف: 2X LQ ميكس ماجستير، LQ التمهيدي / مسبار ميكس، LQ الموحدة، LQ تحكم إيجابي، LQ مخفف، وLQ ROX (الجدول 1). دوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- استخدام منتجات مكتبة تنقيته، إجراء التخفيف المتسلسل من كل عينة الفردية في LQ مخفف.
- إضافة 2 ميكرولتر (مكتبة تنقية المنتج) إلى 198 ميكرولتر LQ مخفف وخلط ونزولا مع الماصة 10 مرات.
- إضافة 2 ميكرولتر (1: 100 تمييع) إلى 198 ميكرولتر LQ مخفف وخلط ونزولا مع الماصة 10 مرات.
- إعداد كمية كافية من مزيج الرئيسي LQ لعدد من العينات لفحصها وتشمل 10٪ أكثر حجم لتفادي النقص بسبب pipetting ل. إعداد ميكس ماجستير LQ في أنبوب microcentrifuge باستخدام أحجام التالية لكل عينة: 5 ميكرولتر 2X LQ ميكس ماجستير، 2 ميكرولتر LQ التمهيدي / مسبار ميكس، 0.5 ميكرولتر LQ ستاندرد و 0.5 ميكرولتر LQ ROX. مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا، دوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- إضافة 8 ميكرولتر مزيج LQ الرئيسي إلى جانب لوحة 96-جيدا البصرية.
- في آبار منفصلة، إضافة 2 ميكرولتر مكتبة الواحد، 2 ميكرولتر LQ تحكم إيجابي و 2 ميكرولتر LQ مخفف (NTC) وتخلط بواسطة pipetting صعودا ونزولا 5 مرات. ختم لوحة مع الفيلم لاصقة البصرية، دوامة لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 ثانية لجمع محتويات.
- تعيين كل من الاتحاد الماليزي وVIC كاشفروبية لكل عينة. أداء PCR التضخيم باستخدام الظروف ركوب الدراجات من 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و 40 دورات (15 ثانية في 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية).
- تحديد تركيز كل عينة (نانومتر) باستخدام المقارن طريقة C ف. حساب الفرق من المعروف LQ قياسي (C ف VIC) إلى المكتبة غير معروفة (C ف فام). يتم حساب تركيز عينة المخففة (PM) باستخدام المعادلة التالية:
[اضرب ليب] نانومتر = 12.5 × 2 Δ الكلوروكوين
في حالة استخدام عامل التخفيف بخلاف 10000، وحساب نسبة عامل التخفيف الهدف إلى 10،000، ومضاعفة هذا العامل من قبل نتيجة لمعادلة في 5.7.
6. مكتبة التطبيع وتجميع عينة
- تحديد تركيز متوسط (نانومتر) في جميع العينات (تحتوي كل منها على مؤشر البشرى الفريد) ليتم تجميعها.
- تحديد نموذج نظام القبول الفرديه (ميكرولتر) لتجميع بضرب تركيز متوسط في جميع العينات بنسبة 5، ثم قسمة الناتج على تركيز الفردية و(نانومتر). جولة القيمة الناتجة إلى أقرب عدد صحيح. أحجام مستديرة مع قيم <2 ميكرولتر إلى 2 ميكرولتر، وأحجام> 15 ميكرولتر إلى 15 ميكرولتر.
- إضافة حجم تطبيع (ميكرولتر) لكل عينة لأنبوب microcentrifuge واحد لإنشاء تجمع العينة.
- حساب تركيز جديد لكل عينة باستخدام قيم الأعداد تقريب وتسجيل النتائج.
- لتحديد تركيز تجمع العينة، وحساب مجموع جميع التركيزات الفردية وتسجيل القيمة الناتجة (نانومتر).
- تمييع تجمع العينة إلى 1.25 نانومتر باستخدام تسلسل مخفف (الجدول 1).
ملاحظة: هذا الإجراء يمكن أن توقف بسلام في هذه الخطوة والعينات المخزنة في -15 إلى -30 درجة مئوية. إعادة تشغيل، ذوبان الجليد العينات المجمدة على الجليد قبل المتابعة.
7. التسلسل
- ديناتلدى عودتهم من تجمع العينة في وجود V3 تحكم PhiX (الجدول 1) وذلك بإضافة ما يلي: 15 ميكرولتر من 1.25 نانومتر بركة عينة، 3 ميكرولتر من 0.5 نانومتر PhiX و 2 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم. يتبع دوامة لفترة وجيزة قبل الطرد المركزي وجيزة واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
- ضع تجمع العينة التشويه والتحريف على الجليد.
- إضافة 8 ميكرولتر من مكتبة التشويه والتحريف إلى 992 ميكرولتر من العازلة HT1-HYB قبل المبردة لأنبوب microcentrifuge. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج، تليها الطرد المركزي وجيزة لجمع محتويات. الحفاظ على الجليد.
- إضافة 600 ميكرولتر من مكتبة التشويه والتحريف والمخفف لوضع # 17 من خرطوشة كاشف.
- ذوبان الجليد مقروءة 1 تسلسل الاشعال (الجدول 1)، مؤشر مقروءة تسلسل الاشعال (الجدول 1)، واقرأ 2 الاشعال التسلسل (الجدول 1). في أنابيب microcentrifuge، على حدة تمييع 4 الاشعال التسلسل ميكرولتر مع 636 العازلة HT1-HYB ميكرولتر. ملاحظة: عازلة HT1-HYB هو المقدمة خفة دمح عدة التسلسل كاشف (الجدول 1).
- خلط قبل vortexing لمدة 10 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية لجمع محتويات. إضافة 600 ميكرولتر من المخفف مقروءة 1 تسلسل الاشعال لوضع # 18 من خرطوشة التسلسل الكاشف، 600 ميكرولتر من المخفف مؤشر مقروءة الاشعال لوضع رقم 19، و 600 ميكرولتر من المخفف الاشعال مقروءة 2 تسلسل لوضع # 20.
- تحميل الكواشف على الصك خ ع (الجدول 1)، وتسلسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إجراء إقران نهاية 2 × 150 دورة تسلسل التشغيل.
تحليل 8. البيانات
ملاحظة: البرنامج أداة خ ع تحويل الصور مجموعة لدعوات قاعدة ونقاط جودة، ثم demultiplexes مؤشرات البشرى لتوليد فرد FASTQ مضغوط غزيب (* .fastq.gz) الملفات لكل عينة. قبل تحليل الملفات demultiplexed، يجب على القارئ تنزيل وتثبيت البرنامج المعلوماتية الحيوية المرتبطة بها (الجدول1). يمكن تثبيت البرنامج على المستهلك الصف جهاز كمبيوتر ويندوز ولا تتطلب أجهزة الكمبيوتر المتخصصة أو اتصال بالإنترنت لأداء تحليل البيانات.
- انقر نقرا مزدوجا فوق الرمز برامج سطح المكتب.
- تسجيل الدخول إلى النظام باستخدام اسم المستخدم وكلمة المرور المنصوص عليها في دليل البرامج.
- فتح لوحة المشروع، وانقر على "مشروع جديد".
- اسم المشروع وتقديم وصف المشروع اختياري. حدد خ ع نوع لوحة المستهدفة وخ ع نوع الصك. انقر على "حفظ ومتابعة".
- تحميل الملفات FASTQ مضغوط لوإلى الأمام وعكس يقرأ. لا تقم بتحميل FASTQs "غير معين"، والتي تحتوي يقرأ أن فشلت في demultiplex. انقر على "حفظ ومتابعة".
- إدخال عدد النسخ المدخلات الفنية المستخدمة في إعداد كل مكتبة على النحو الذي يحدده الحمض النووي الكمي وظيفية فحص (راجع الخطوة 1 أعلاه). إضافة قيم أو نسخ ولصق القيم يدويا من انتشارورقة في الجدول الشرح. انقر على "حفظ ومتابعة."
- مراجعة المكتبات المشروح تحميلها للتحليل وانقر على زر "إرسال تحليل" للشروع في التحليل.
- رصد التقدم المحرز في التحليل عرضها من خلال لوحة المشروع.
ملاحظة: يتم تقديم تحليل كامل إشارة حالة عندما تكون النتائج جاهزة للمراجعة. - استعراض نتائج تحليل لعينة QC المقاييس بما في ذلك تغطية شاملة لكل مكتبة، والنسبة المئوية من يقرأ مرشحات تمرير، وعمق التغطية amplicon والتوحيد. مراجعة البديل يدعو كل مكتبة التسلسل مع dbSNP، الكونية، 1000 الجينوم وغيرها من مصادر الشرح وظيفية والسكان المستوى.
- تصدير النتائج الأولية كما الجداول ملخص جداول البيانات، وملفات * .bam و* ملفات VCF. للتخزين طويل الأجل أو تحليل المصب مع أدوات المعلوماتية المتكاملة.
Representative Results
تم تقييم ما مجموعه 90 عينة (74 فريد) تمثل الضوابط الإيجابية والسلبية، خطوط الخلايا تتميز سابقا، والمتبقية السريرية خزعات الورم FFPE عن الحمض النووي amplifiable، مدخلات متعدد PCR تخصيب اليورانيوم ذات الكلمات الدلالية مع محولات تسلسل، barcoded، وتحليلها في واحد الفوق خ ع أداة المدى (الشكل 2) التي أنتجت 19.1 M يقرأ تمرير مرشح. أدى متساوي المولية عينة تجميع في ارتفاع عمق التسلسل (3،692x يقرأ) وتغطية موحدة (97.8٪ من amplicons المشمولة ضمن 5 أضعاف من عمق القراءة وسيطة). القيم المتطرفة تضم أي قالب الضوابط، واحدة الحمض النووي خط الخلية مع كبير في عدد النسخ التضخيم، والحمض النووي FFPE تلك التي كانت ترفع علم لPCR تثبيط من قبل فحص ومراقبة الجودة قبل التحليلي (الشكل 3). واستمر التوحيد تغطية عبر 46 amplicons باستخدام ثلاث شركات مختلفة (الشكل 4A)، وعلى مختلف منخفضة الجودة عينات FFPE الحمض النووي (
تم تحديد الحساسية والقيمة التنبؤية الإيجابية للفحص من تحليل 97 عينة، بما في ذلك FFPE، FNA، طازجة، مجمدة، وخط خلية الحمض النووي، وما مجموعه 195 النتائج التسلسل. وكشفت النتائج 365 المكالمات الحقيقية الإيجابية البديل، 4 المكالمات سلبية كاذبة، و1 دعوة إيجابية كاذبة لحساسية 98.9٪ (95٪ CI: 97،1-99،7٪) والقيمة التنبؤية الإيجابية (PPV) 99.7٪ (95٪ CI : 98،2-99،99٪). أجريت التحاليل التي أجريت على indels لالخيارين EGFR المشترك (p.E746_A750delELREA وp.V769_D770insASV) في 33 أشواط العينة، مما يدل على حساسية 93.9٪ (95٪ CI: 78،4 حتي 98،9٪) وPPV 100٪ (95٪ CI: 86،3-100٪) مع المتغيرات الكشف على مجموعة من 2،4 حتي 84،8٪.
الشكل 1: مثال من منحنيات الحمض النووي الكمي المعايرة التي تمر وفشل QC معايير (A) منحنى القياسية يمر. (ب) منحنى القياسية فشلها. في هذه الحالة، كان سبب الفشل قبل pipetting مكررة من أدنى مستوى المدخلات الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على نظام خ ع شامل المستهدفة للتطبيقات علم الأورام أن يدمج ما قبل التحليلسير العمل القاعدة والتحليلية، وبعد التحليلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: قراءة التغطية وتوحيد لخ ع الموجهة للجينات السرطان في ذات جودة منخفضة FFPE الحمض النووي ومقارنة سليمة الحمض النووي خط خلية والضوابط ما مجموعه 90 عينات التي شملت FFPE السريري المتبقية (الدوائر المغلقة)، خط الخلية (الدوائر المفتوحة. )، والحمض النووي الاصطناعي قالب (زائد حرف) تم معالجتها إحصائيا باستخدام أنبوب واحد، 21-الجين متعدد PCR تخصيب اليورانيوم. كانت المعلمة كل مكتبة amplicon مع تسلسل محول للصك خ ع، barcoded مع رمز مميز ثنائي مؤشر، تنقية، كميا، وتطبيع إلى تركيز 2.5 نانومتر. كان التسلسل مكتبة الحمض النووي وتحليلها بواسطة برنامج المعلوماتية الحيوية رفيق. ديفي عينةوتضمنت بالجمع سلسلة التخفيف من MDA-MB-468 خط خلية الحمض النووي التي تحمل نسخة EGFR كبيرة عدد التضخيم (أعلى والمستطيلات مفتوحة داخل دائرة المنقطة) التي شوهت التوحيد التغطية واحدة عينة سرطان الجلد FFPE التي فشلت في توليد عددا كبيرا من يقرأ المستحقة إلى المرحل من مثبطات PCR من استخراج الحمض النووي. وكان من المتوقع فشل عينة سرطان الجلد (أسفل، دائرة منقط) من قبل التحليلي فحص الحمض النووي QPCR مراقبة الجودة. المجلس الوطني الانتقالي، لا قالب التحكم (حرف س). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Amplicon-ب-amplicon مقروءة التغطية، التماثل وكشف متغير في المتبقية السريرية FFPE ورم الحمض النووي. (أ) اقرأ تغطية في جميع مواضع المخصب في FFPE عينة من الحمض النووي التمثيلية تقاسعبر ثلاث شركات مختلفة. مشغل 1، OP1 (أشرطة زرقاء)؛ مشغل 2، OP2 (أشرطة خضراء)؛ مشغل 3، OP3 (أشرطة سوداء). (ب) التوحيد التغطية والبديل المكالمات تقييمها باستخدام ثلاث عينات الورم FFPE، بما في ذلك خليط التحكم (FFPE3 والحانات الرمادي والنص) تتألف من المعروف 5٪ BRAF c.1799T> تحور. FFPE1 (أشرطة زرقاء والنص)، FFPE2 (أشرطة برتقالية اللون والنص). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تم تخفيفه كشف الجرعة التي تعتمد على نسخ عدد المتغيرات في خط الخلوي وFFPE الحمض النووي MDA-MB-468 خط خلية الحمض النووي مع جيدا اتسم نسخة EGFR عدد التضخيم تدريجيا في خلفية خلية إشارة غير المتحول. الحمض النووي سطر لتوضيح انخفاض في نسخة تغيير الرقم كنسبةوظيفة للتخفيف. يظهر نسبة كل عينة الحمض النووي خط الخلية مع خط واضح (0، 12.5، 25، 50، و 100٪). التخفيف من FFPE عينة ورم المبيض مع التضخيم KRAS المعروف كشفت صورة مماثلة باستخدام نفس سلسلة المعايرة ولكن مع مكررات من 100٪ الحمض النووي FFPE لاثنين من كبار خطوط. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الكشف عن الطفرات دقيقة والكمي إلى 50 نسخ Amplifiable FFPE الحمض النووي، أو 1.2 نانوغرام الحمض النووي السائبة عدد نسخة amplifiable من سرطان القولون تقرر FFPE الحمض النووي عن طريق فحص ومراقبة الجودة على أساس QPCR، والمخففة 400-25 نسخ باعتبارها. مدخلات متعدد PCR تخصيب قبل التسلسل. خط أنابيب المعلوماتية الحيوية تسمى بشكل صحيح كل من فاريان معروفةنهاية الخبر الى 50 نسخة، أو ما يعادل 10 ~ القوالب متحولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم المادة / المواد | شركة | رقم الكتالوج |
| 2X ميكس ماستر Quantidex | Asuragen | 145345 |
| كوانت التمهيدي التحقيق ميكس | Asuragen | 145336 |
| تثبيط التمهيدي التحقيق ميكس | Asuragen | 145344 |
| ROX | Asuragen | 145346 |
| مشعشع مخفف للزوجة | Asuragen | 145339 |
| الحمض النووي قياسي (50) | Asuragen | 145340 |
| الحمض النووي قياسي (10) | Asuragen | 145341 |
| الحمض النووي الموحدة (2) | Asuragen | 145342 |
| الحمض النووي قياسي (0.4) | Asuragen | 145343 |
| 2X ميكس ماستر التضخيم | Asuragen | 145348 |
| لوحة عموم السرطان التمهيدي | Asuragen | 145347 |
| تحكم عموم السرطان FFPE | Asuragen | 145349 |
| تحكم عموم السرطان متعدد البديل | Asuragen | 145350 |
| الخرز الإعدادية الصرفة المكتبة | Asuragen | 145351 |
| غسل العازلة | Asuragen | 145352 |
| شطف العازلة | Asuragen | 145353 |
| 2X ميكس ماستر LQ | Asuragen | 145358 |
| LQ مخفف | Asuragen | 145354 |
| LQ إيجابيمراقبة | Asuragen | 145355 |
| LQ قياسي | Asuragen | 145356 |
| LQ التمهيدي / مسبار ميكس (ILMN) | Asuragen | 145357 |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 |
| رموز مؤشر (ILMN) - المجموعة أ | Asuragen | 150004 |
| AIL001 - AIL048 (48) | ||
| رموز مؤشر (ILMN) - مجموعة ب | Asuragen | 150005 |
| AIL049 - AIL096 (48) | ||
| 2X ميكس ماستر مؤشر | Asuragen | 145361 |
| قراءة 1 تسلسل الاشعال | Asuragen | 150001 |
| مؤشر مقروءة تسلسل الاشعال | Asuragen | 150002 |
| قراءة 2 تسلسل الاشعال | Asuragen | 150003 |
| التسلسل مخفف | Asuragen | 145365 |
| البورشيد MiSeq | البورشيد | |
| MiSeq الكاشف V3 كيت (600 دورة) | البورشيد | MS-102-3003 |
| MiSeq الكاشف نانو V2 كيت (300 دورة) | البورشيد | MS-103-1001 |
| PhiX تحكم V3 | البورشيد | FC-110-3001 |
| المغناطيسي حامل-96 (أو جهاز ما يعادلها) | AMBION | AM10027 |
| Quantidex مراسل البرمجيات | Asuragen |
الجدول 1: الكواشف وأطقم عند الاستخدام الأول من ROX، تخزين القارورة في 2-8 درجة مئوية. لا اعادة تجميد. يمكن تحميل البرنامج على www.asuragen.com.
| Gإيني | البديل الكونية | الأحماض الأمينية الكونية | ٪ البديل |
| تلك السلطات، | c.182A> G | p.Q61R | 13.3 |
| تلك السلطات، | c.35G> و | p.G12D | 15.2 |
| الجمعية قضائيا | c.182A> G | p.Q61R | 17.8 |
| الجمعية قضائيا | c.35G> و | p.G12D | 9.2 |
| KRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13.5 |
| KRAS | c.35G> و | p.G12D | 19.1 |
| PIK3CA | c.1633G> و | p.E545K | 9.3 |
| PIK3CA | c.3140A> G | p.H1047R | 9.1 |
| عدة | c.2447A> T | p.D816V | 14.6 | EGFR | c.2369C> T | p.T790M | 11.3 |
| EGFR | c.2573T> G | p.L858R | 14.9 |
| BRAF | c.1799T> و | p.V600E | 17.3 |
الجدول 2: ويتكون تحكم الاصطناعية المجمعة 12 "سائق" سرطان جين المتغيرات التي يتم كميا في 9-17٪ وفرة تم تقييم مزيج من 12 مختلفة قوالب الاصطناعية المزدوج تقطعت بهم السبل تحمل 12 الطفرات المميزة التالية التسلسل. ودعا جميع المتغيرات بشكل صحيح مع عدم وجود ايجابيات كاذبة.
| معرف عينة | وظيفي القانون الجنائي | جينة | البديل الكونية | الأحماض الأمينية الكونية | عمق للقراءة وسيطة | ٪ في غضون 5X من المتوسط | |
| BCPAP | 400 | BRAF | c.1799T> و | p.V600E | 99.5 | 3289 | 96٪ |
| BCPAP | 10000 | BRAF | c.1799T> و | p.V600E | 99.7 | 4040 | 98٪ |
| BCPAP | 25000 | BRAF | c.1799T> و | p.V600E | 99.4 | 3687 | 96٪ |
| BCPAP | 50000 | BRAF | c.1799T> و | p.V600E | 99.7 | 4611 | 93٪ |
الجدول 3: يتم الحفاظ على التغطية والبديل الدعوة على نطاق و> 100 أضعاف من إدخال الحمض النووي.
الجدول 4: البديل يدعو في 22 FFPE و 20 FNA التحليلات ورم أتفق مع نتائج من المستقلة الطفرة فحوصات كان هناك مجموعة من 22 FFPE الورم الحمض النووي مع الوضع الطفرة التي سبق تحديدها من قبل المتعامدة المقايسات خ ع المستهدفة مساهمة في 400 إلى 2،928 نسخ amplifiable في تخصيب PCR. خطوة والتسلسل باستخدام 21-جين لوحة عموم السرطان. وبالإضافة إلى ذلك، لفيف من 20 عينات الحمض النووي FNA تتميز في السابق باستخدام السائل حبة مجموعة طفرة فحص و8 PCR تضخيمها باستخدام 156 إلى 36080 مساهمة نسخ amplifiable والتسلسل. جميع المكالمات المتداخلة بين لوحة عموم السرطان خ ع وrefereوكانت وسائل الامتحانات التنافسية الوطنية في الاتفاق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وإعادة تعريف التكنولوجيا خ ع التوقعات لاستجواب لمحات الجزيئية للخزعات الورم في السريرية 9. وقد تم تطوير عدد من لوحات خ ع المستهدفة وتقنيات البحث والاختبارات المعملية المتقدمة، والمنتجات المتاحة تجاريا وألواح مخصصة لتقييم أنواع متعددة من العينات السريرية 3،5،10-15. وقد أظهرت التقارير الواردة من عدة دراسات قيمة خ ع كأداة السريرية الحساسة ومحددة للكشف عن تغيرات الجيني 3،10-12،14. ومع ذلك، فقد أثبتت الدراسات أيضا خطر من القطع الأثرية التي يمكن أن تسبب نتائج إيجابية كاذبة من الخزعات سرطان الصعبة مثل FFPE العينات 2-5،12،14. بالإضافة إلى ذلك، أبرزت المنشورات الحديثة معدلات فشل عالية لخ ع باستخدام الأورام العينات 16 و إيجابية كاذبة مكالمات مع فريقي خ ع المستهدفة التجارية التي تفاقمت من جراء استخدام الحمض النووي المنخفضة للمدخلات 12. ونتيجة لذلك، بعض مختبروقد المحافظين إما تعديل أو تضاف الضوابط والتوازنات إضافية إلى المتاحة تجاريا التقنيات خ ع المستهدفة لتحسين الأداء، في كثير من الأحيان لضمان دقة أو تأكيد النتائج من بيوينفورمتيك يحلل 5،10،11.
وقد تم تطوير لوحة 21-جين (الشكل 2)، والمحتوى المستهدفة لنظام شامل خ ع لاستجواب قائم على الأدلة، والطفرات قابلة للتنفيذ في أنواع العينات الصعبة مثل FFPE وFNA خزعات الورم. سير العمل لديها عدد من المزايا: 1) الاتساق من خلال توفير تغطية amplicon موحدة (أرقام 3 و 4، الجدول 3). 2) سهولة الاستخدام من خلال توفير ما قبل صياغتها، ومجموعات كاشف الأمثل، وتبسيط متطلبات المعلوماتية الحيوية. 3) الكفاءة من خلال تبسيط سير العمل والحد من عدد من الخطوات pipetting لبالمقارنة مع الأساليب خ ع و التجارية الأخرى. و4) دقة من خلال دمج فحص الحمض النووي لمراقبة الجودة لتقييم amplifiتمكن عدد نسخ الحمض النووي لضمان تنوع قالب مقبول وتجنب التقلبات العشوائية في كشف البديل 4. تكامل البيانات QC قبل التحليلي مع تحليل المعلوماتية الحيوية يسمح للمدخلات منخفضة من FFPE الحمض النووي. وقد تحقق ذلك من خلال تدريب خوارزمية القرار الشجرة باستخدام نسخ وظيفية مختلفة من المدخلات الحمض النووي عبر 400 عينات FFPE مع تدابير مستقلة للحقيقة، وتتضمن هذه الخوارزمية في البرنامج بيوينفورمتيك. ونتيجة لذلك، فإن إدخال الموصى بها من 400 نسخة amplifiable، أي ما يعادل عادة إلى ~ 5-20 نانوغرام من FFPE الحمض النووي، ويقارن ايجابيا إلى أساليب أخرى 10-12، بما في ذلك تخصيب القائم على التهجين حيث ينصح ~ 250 نانوغرام من الحمض النووي FFPE 17،18 . وعلى الرغم من وصف هذه التقنية للاستخدام على منصة MiSeq، فإنه يمكن تعديلها باستخدام بطاقة PCR الاشعال مع محولات أداة محددة لتمكين تحليل تسلسل على منصات خ ع و غيرها.
عدة خطوات حاسمة لضمان نجاحمن هذا الإجراء. يحدد QC فحص ما قبل التحليلي عدد نسخ amplifiable من الحمض النووي وتقارير تثبيط وظيفي. ومع ذلك، إذا تم استخدام أقل من 400 نسخة الحمض النووي amplifiable في خطوة تخصيب PCR، هناك خطر متزايد من مكالمة سلبية كاذبة من العينات مع الطفرات وفرة منخفضة (الشكل 6). بالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر خلال تنقية المكتبة لمنع الإفراط في تجفيف حبات مغناطيسية أثناء الغسل أو شطف الخطوات. وعلاوة على ذلك، النجاح الكمي مكتبة يعتمد بشكل كبير على تخفيف دقيقة من الحمض النووي مكتبة. للحصول على أفضل النتائج، والفرق من QPCR النتائج للمكتبة عينة (الكلوروكوين FAM) مقارنة LQ قياسي (الكلوروكوين VIC) يجب أن يكون ≤3.3 الكلوروكوين. إذا كان الفرق أكبر من 3.3 الكلوروكوين، وإعادة تخفيف واختبار عينة من المستحسن. على الرغم من أن علاقة ممتازة وقد لوحظ بين هذه الطريقة QPCR تنافسية ومجموعات تجارية التي تقدم الكمي المطلق باستخدام منحنى قياسي، إزاحة المدخلات مكتبة في خطوة التضخيم نسيلي نسبة إلى أساليب أخرى قد يكون من الضروري لتحقيق كثافة البذر المثلى.
بعض العينات السرطان بشكل خاص تحديا لتسلسل بسبب مثبطات أن تستمر بعد عزل الحمض النووي. للتعرف على هذه العينات قبل إعداد المكتبة، وفحص QPCR QC أيضا بالكشف عن التضخيم تثبيط من قبل بما في ذلك قالب خارجي يخدم على حد سواء الرقابة الداخلية والحارس لتثبيط وظيفي. ويقدم مثالا في الشكل (3) التي فشلت عينة سرطان الجلد الحمض النووي لتمرير تثبيط QC متري قبل التسلسل ثم فشلت في إنشاء مكتبة يمكن أن تكون متسلسلة. كان الفشل المحتمل نتيجة لتلوث الميلانين، مثبط PCR المعروفة، التي تم ترحيلها من الخطوة العزلة FFPE الحمض النووي. العينات التي يتم تحديدها من قبل فحص ومراقبة الجودة لتكون معرضة للخطر لعدم التضخيم يمكن إنقاذه من خلال ر خطوة تنظيف إضافيةس إزالة مثبطات المحتملة.
تركز لوحة 21 الجينات المستهدفة في المناطق الساخنة الجينات القائم على الأدلة وتوفر نظاما كاملا مع الكواشف والضوابط الأمثل لالحمض النووي QC، خ ع والمعلوماتية الحيوية البرامج التي يتم أبلغ من نتائج فحص الحمض النووي الكمي "وظيفية" قبل التحليلية. طريقة يكشف بدقة الطفرات قاعدة الاستبدال وindels من الحمض النووي المدخلات المنخفضة، وتقدم مثالا على نظام NGS مع خيار لتوسيع المحتوى لوحة، لكشف عن بدائل إضافية مثل هذه التنوعات وتكييفها لتسلسل الحمض النووي الريبي المستهدفة.
Disclosures
JH، ه، RZ، الغرفة، وGJL هم موظفون ولها ملكية الأسهم في Asuragen، وشركة RZ، الغرفة، وGJL هي شارك في المخترعين في طلب البراءة لتحسين البديل يدعو باستخدام amplifiable المعلومات في عدد النسخ المقررة لكل عينة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور أنيت Schlageter لإعادة النظر في المخطوطة. وأيد هذا العمل في جزء من CP120017 منحة من الوقاية من السرطان ومعهد بحوث من تكساس (PI: GJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer/Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
- Medicines in Development for Cancer. , Available from: http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf 1-103 (2014).
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77 (2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710 (2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
