Abstract
Alle neste generasjons sekvensering (NGS) prosedyrer inkluderer analyser utført ved laboratoriebenken ( "våt benken") og dataanalyser utført ved bruk av bioinformatikk rørledninger ( "tørr benk"). Begge elementer er viktig for å produsere nøyaktige og pålitelige resultater, som er spesielt kritisk for kliniske laboratorier. Målrettede NGS teknologi har stadig funnet nåde hos onkologi programmer for å hjelpe forhånd presisjon medisin mål, men metodene ofte involverer frakoblet og variable våte og tørre benk arbeidsflyt og ukoordinerte reagenvolumer sett. I denne rapporten beskriver vi en fremgangsmåte for sekvensering utfordrende cancerprøver med en 21-gen panel som et eksempel på en omfattende målrettet NGS system. Systemet integrerer funksjonelle DNA kvantifisering og kvalifisering, single-tube multiplex PCR berikelse, og bibliotek rensing og normalisering ved hjelp av analytisk verifisert, single-source reagenser med en frittstående bioinformatikk suite.Som et resultat av samtaler nøyaktig variant fra lav kvalitet og lav mengde formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) og finnålsaspirasjon (FNA) tumor biopsier kan oppnås. Metoden kan rutinemessig vurdere kreft-assosiert varianter fra en inngang på 400 amplifiserbare DNA-kopier, og er modulær design for å imøtekomme nye genet innhold. To forskjellige typer analytisk definerte kontroller kvalitetssikre og bidra til å sikre samtale nøyaktighet med klinisk relevante prøver. En fleksibel "tag" PCR trinnet bygger plattformspesifikke adaptere og indekskoder for å tillate prøve barcoding og kompatibilitet med vanlige stasjonære NGS instrumenter. Viktigere er protokollen strømlinjeformet og kan produsere 24 sekvens klar bibliotekene på en enkelt dag. Til slutt kobler tilnærming våte og tørre benk prosesser ved å innlemme pre-analytiske prøven kvalitetskontroll resultatene direkte inn i varianten ringer algoritmer for å forbedre mutasjonsdeteksjon nøyaktighet og skille falske negative og indeterminate samtaler. Denne målrettede NGS metoden bruker fremskritt innen både wetware og programvare for å oppnå høy dybde, multiplex sequencing og sensitiv analyse av heterogene kreftprøver for diagnostiske applikasjoner.
Introduction
Precision medisin er avhengig av individualisering av diagnostiske og terapeutiske muligheter for pasientene. Løftet av skreddersydde behandlinger er en direkte konsekvens av en bedre forståelse av sykdoms veier som kan informere kobling av molekylær diagnostikk og målrettede behandlingsformer. For eksempel, bruk av molekylært målrettet terapi økt fra 11% til 46% 2003-2013 1, og anti-kreft stoffer som vemurafenib og crizotinib er FDA-klarert med følges diagnostiske tester. Med sin evne til å nøyaktig gjenopprette lav overflod sekvens mål over svært multipleksede prøvesettene, har neste generasjons sekvensering (NGS) dukket opp som en metode for valg for å vurdere genetiske avvik knyttet til kreft og identifisere molekylære mål for presisjon medisin.
De vanligste solide svulster biopsier for molekylær testing inkluderer formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) og finnålsaspirasjon (FNA) specimens. Disse prøvene er nervøs med lav mengde og / eller lav kvalitet nukleinsyrer som utfordrer nøyaktig NGS vurderinger som 2-5. Gjeldende kommersielle NGS metoder for analyse av disse prøvene er basert på et lappeteppe av ulike reagenser, protokoller og IT-verktøy som representerer bevegelige mål av kontinuerlige forbedringer. For eksempel endringer i analyse kjemi og / eller programvare som skjedde hver 1-2 måneder for de mest brukte målrettede NGS kits 6. Dette ustabilitet reflekterer en mangel på sammenheng i å bygge og verifisere en enhetlig NGS system for utfordrende prøvetyper, spesielt for kreft testing, og legger en uforholdsmessig byrde på laboratorier for å utvikle sammenhengende protokoller som er optimalisert fra prøve-til-resultater. Faktisk en fersk undersøkelse av NGS brukere uthevet vanskelighetene med disse "raskt skiftende" teknologier, sammen med kravene til etablerte, medisinsk-praktisk innhold, forskanset bioinformatikk kompetanse, en solidified og integrert prosedyre som kan implementeres raskt, og effektiv arbeidsflyt og forenklede protokoller som letter on-the-job training 7. I denne artikkelen er et omfattende system for målrettet NGS beskrevet som løser disse hullene.
Den presenterte metodikken integrerer alle prosessuelle skritt fra pre-analytisk til post-analytisk på både våte og tørre benker å forbedre nøyaktigheten, følsomhet og pålitelighet av målet kvantifisering og gjenkjenning for NGS av klinisk relevant kreft genet loci. Denne tilnærmingen begynner med kvantifisering av "funksjonelle" DNA 4 for å vurdere DNA kvalitet, veilede innspill til PCR berikelse trinnet, og vakt mot falske positive samtaler som kan oppstå fra avhøret av svært lave mal eksemplarer. En enkelt-rør multipleks PCR deretter beriker for 46 loci i 21 kreftgener med kun 400 amplifiserbare DNA-kopier, etterfulgt av inkorporering av plattformspesifikke sekvenser for NGS using vanlig desktop-sekvense instrumenter. Bibliotekene blir renset ved anvendelse av en enkel magnetiske kuler prosedyre og kvantifisert med en ny, kalibrering-fri qPCR-analyse. En frittstående bioinformatikk suite, informert av prøve DNA QC resultatene til å forbedre samtalen ytelse, gir sekvens analyse følgende NGS. Vi presenterer data ved hjelp av denne systemtilnærming for målrettet NGS å avsløre grunnerstatning mutasjoner, innsetting / slettinger (indels), og kopiere antall varianter (CNVs) i lav kvalitet og lav mengde tumor biopsier som FFPE og FNA prøver, og løp kontroller.
Protocol
Merk: Denne protokollen beskriver den samtidige behandling av prøver ved hjelp av en MiSeq NGS-systemet, men kan tilpasses for den personlige Genome Machine (PGM) instrument. For det anbefalte minimum DNA inngang på 400 amplifiserbare mal eksemplarer, er analysen stand til å produsere minst 3,000x median dekning for hver av 96 prøver per NGS løp, og tilsvarende dekning dybde for 24 prøver ved hjelp av PGM på en 318 brikke. Metoden forutsetter også bruk av en sanntids-PCR instrument.
1. DNA Funksjonell Kvantifisering og kvalitetskontroll (QC)
- Tine reagenser: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Hemming Primer Probe Mix, 6-karboksy-X-rhodamine (ROX), fortynner, og de fire humant genomisk DNA kalibreringskurve standarder (DNA Standard (50 ng / mL), DNA Standard (10 ng / mL), DNA-standard (2 ng / ul), og DNA-standard (0,4 ng / ul)) (tabell 1). Vortex alle reagenser for 10 sekunder og sentrifuger ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.Hold 2x mester mix på is.
- Forbered en tilstrekkelig mengde av masterblanding for det totale antall prøver som skal undersøkes, og inkluderer 10% mer volum for å unngå mangel på grunn av pipettering. Forbered master mix i en mikro rør ved hjelp av følgende volum pr sample: 5 mL 2x Master Mix, 0,5 mL Primer Probe Mix, 0,5 mL Hemming Primer Probe Mix, 0,05 mL ROX og 2,95 mL fortynningsmiddel. Vortex i 10 sekunder og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Legg 9 ul masterblanding til brønner i en 96-brønns plate.
- Tilsett 1 pl DNA-standarder i duplikat for å generere en kalibreringskurve. Bland ved pipettering opp og ned 5 ganger.
- Sikre nukleinsyreprøven er godt blandet før bruk. Legg en fil prøve til master mix og bland ved pipettering opp-og-ned 5 ganger.
- Tett plate, vortex i 10 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Sett platen inn i PCR System. Tildele både FAM (funksjonell kvantifisering) og VIC (funksjonell hemming) detektorer for hver prøve i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre PCR-sykluser av 10 minutter ved 95 ° C, og 40 sykluser (15 sek ved 95 ° C, 1 minutt ved 60 ° C).
- Analyser qPCR data ved å generere en lineær regresjon tomten for hver av de dupliserte DNA standarder med programvareprotokoller.
- Plotte log 10 av kopiantallet for hver DNA-standard på x-aksen og de tilsvarende FAM C q-verdi på Y-aksen.
- Bekreftet at resultatene fra nukleinsyreprøven faller innenfor det dynamiske området for den DNA-standarder kalibreringskurve, og deretter beregne konsentrasjonen av den ukjente DNA i "funksjonell" eller forøkbare kopiantall per ul fra den tilsvarende posisjon på referansestandardkurven. Figur 1 viser eksempler på kalibreringskurver som passerte og mislyktes. </ Li>
- Avgjøre om forsterkning skjedde i hver reaksjon ved å se etter tilstedeværelsen av det ikke-humane target amplikon i VIC kanalen.
Merk: Som en positiv kontroll, inneholder Inhibering Primer Probe Mix primere som var spesifikke for en ikke-human eksogene målet og den tilsvarende mal. Den Inhibering Primer Probe Mix er en komponent av konsentrat-blanding som blir tilsatt til hver reaksjon, inkludert ikke-templat kontroll (NTC). I fravær av en inhibitor, bør PCR-produktet for det ikke-humane målet alltid påvises i VIC kanalen. En "ubemerket" C q for en prøve i VIC kanalen indikerer tilstedeværelse av PCR-inhibitorer som kan ha nytte av påfølgende rensing av prøven før ytterligere behandling.
2. Library Forberedelse: Gene-spesifikke (GS) PCR
- Forbered en tilstrekkelig mengde av masterblanding for det totale antall prøver som skal testes, og inkluderer 10% mer volum for å unngå mangel på grunn av pipetting. Klargjør GS PCR Master Mix i en mikro rør ved hjelp av følgende volum pr sample: 5 mL 2x Amplification Master Mix (tabell 1) og 1 ul Pan Cancer Primer Panel (tabell 1). Bland ved pipettering opp-og-ned, vortex i 10 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Alikvoter av 6 ul GS PCR masterblanding inn i brønner på en 96-brønns plate. Tilsett 4 mL av hver nukleinsyreprøven inn i individuelle brønner. Til andre brønner, tilsett 4 pl av FFPE kontroll (tabell 1), 4 pl Multi-Variant kontroll (tabell 1), og 4 pl nukleasefritt vann for en prosessuell NTC. For hver tilsetning, bland ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
- Tett plate, vortex i 10 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Sett platen i thermocycler for følgende PCR-sykluser: 5 min ved 95 ° C,2 sykluser (15 sek ved 95 ° C, 4 minutter ved 60 ° C), 23 sykluser (15 sek ved 95 ° C, 4 minutter ved 72 ° C), og en endelig forlengelse på 10 min ved 72 ° C. Hold ved 4 ° C.
Merk: Etter fullførelse av trinn 2.4, vil platen bli referert til som den GS-PCR-plate.
3. Bibliotek Forberedelse: Tag PCR
- Tine reagenser: 2x Index Master Mix (Tabell 1) og indekskoder (tabell 1). Vortex i 10 sekunder og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
Merk: Indekskoder er ferdigblandet for å gi et unikt sett av parvise indekser (strekkoder) for hver prøve. - I en 96-brønns plate, tilsett 7,5 mL av 2x Index Master Mix og 5,5 mL av en indeks kode til en spesifisert godt og bland ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
- Nøye åpne GS PCR plate, og tilsett 2 mL GS PCR-produktet til det nye plate med master mix. Bland ved pipettering opp og ned 5 ganger. For hver prøve, registrere Sample ID og de tilsvarende parvise indekskoder. Tett plate, vortex i 10 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Sett platen i thermocycler og PCR i 5 min ved 95 ° C, 10 sykluser (30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 55 ° C, 1 minutt ved 72 ° C), og en endelig forlengelse på 10 min ved 72 ° C. Hold ved 4 ° C.
Merk: Etter fullførelse av trinn 3.4, vil platen bli referert til som tag-PCR-plate.
4. Bibliotek Rensing og størrelse valg
- Fjern Bibliotek Pure Prep magnetiske kuler (tabell 1) og elueringsbuffer (tabell 1) 2-8 ° C og la til stabilisering til RT i 30 min. Legg 9,6 ml 100% etanol til vaskebuffer (tabell 1) beholderen, hetten og bland ved å snu flasken opp ned flere ganger.
- Vortex de magnetiske kuler til 10 sekunder, og tilsett 11 pl i separate brønner i et 96-brønns plate.
- Åpne Tag PCR plate og tilsett 10 mL av Tag PCR produktet til perler og pipette mix 5 ganger. Inkuber blandingen i 4 min ved RT.
- Plasser 96-brønn plate på magnetstativet (tabell 1) i 4 min. Med 96-brønns plate fortsatt på stativet, fjern og kast supernatanten med en pipette.
- Fjerne den 96-brønns plate fra den magnetiske stativet og tilsett 100 ul etanol inneholdende vaskebuffer til hver brønn og bland ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Inkuber i 2 min.
- Plasser 96-brønns plate på magnetstativ for 2 min, og ta ut og kast supernatanten med en pipette.
- Gjenta trinn 4.5, for en total av 2 etanolvaskinger for å fjerne så mye vaskeoppløsning mulig etter den andre vask.
- Med 96-brønns plate på magnetstativet, tørke perlene i 2 min ved RT, deretter fjerne platen fra stativet.
- Suspender perlene ved å tilsette 20 mL elueringsbuffer til hver well og pipettes opp-og-ned 5 ganger.
- Inkuber i 2 min ved RT.
- Plasser 96-brønns plate tilbake på magnetstativet i 4 minutter, og fjern forsiktig og overfør 18 pl av den klare supernatant i en ny brønn.
Merk: Fremgangsmåten kan bli trygt stoppes ved dette trinnet og prøvene lagres ved -15 til -30 ° C. For å starte på nytt, tine frosne prøvene på is før du fortsetter.
5. Bibliotek Kvantifisering
- Tine Bibliotek Quant (LQ) reagenser: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standard, LQ positiv kontroll, LQ fortynningsmiddel og LQ ROX (tabell 1). Vortex i 10 sekunder og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Ved hjelp av renset bibliotek produkter, utføre en seriell fortynning av hver enkelt prøve i LQ fortynningsmiddel.
- Tilsett 2 mL (bibliotek renset produkt) til 198 ul LQ fortynningsmiddel og bland opp og ned med en pipette 10 ganger.
- Tilsett 2 pl (1: 100 fortynning) til ett98 mL LQ fortynningsmiddel og bland opp-og-ned med en pipette 10 ganger.
- Forbered en tilstrekkelig mengde LQ mester miks for det totale antall prøver som skal undersøkes, og inkluderer 10% mer volum for å unngå mangel på grunn av pipettering. Klargjør LQ Master Mix i en mikro rør ved hjelp av følgende volum pr sample: 5 ul 2X LQ Master Mix, 2 ul LQ Primer / Probe Mix, 0,5 mL LQ Standard og 0,5 mL LQ ROX. Bland ved pipettering opp-og-ned, vortex i 10 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold.
- Tilsett 8 mL LQ masterblanding til en brønn av en optisk 96-brønns plate.
- I separate brønner, tilsett 2 mL fortynnet bibliotek, 2 ul LQ positiv kontroll og 2 ul LQ fortynningsmiddel (NTC) og bland ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Tett plate med optisk selvklebende film, vortex i 10 sekunder og sentrifuger ved 400 xg i 10 sek for å samle innholdet.
- Tildele både FAM og VIC Detectors for hver prøve. Utføre PCR-amplifikasjon ved anvendelse av veksling av 5 minutter ved 95 ° C, og 40 sykluser (15 sek ved 95 ° C, 1 minutt ved 60 ° C).
- Bestemme konsentrasjonen av hver prøve (nM) ved hjelp av sammenlignende C-q-metoden. Beregn forskjellen på kjente LQ Standard (C q VIC) til ukjent bibliotek (C q FAM). Konsentrasjonen av fortynnede prøven (PM) er beregnet ved hjelp av følgende ligning:
[Kons lib] nM = 12,5 x 2 Δ Cq
Ved hjelp av en fortynningsfaktor annet enn 10 000, beregne forholdet av målet fortynningsfaktoren til 10 000, og multiplisere denne faktoren med resultatet av ligningen i 5,7.
6. Bibliotek Normalisering og Sample Pooling
- Bestemme den midlere konsentrasjon (nM) på tvers av alle prøver (hver inneholdende en unik parvis indeks) som skal samles.
- Bestem den enkelte prøven volume (mL) til bassenget ved å multiplisere median konsentrasjon på tvers av alle prøvene av 5, deretter dele sin individuelle konsentrasjon (nM). Rund den resulterende verdi til nærmeste heltall. Runde volumer med verdier av <2 pl til 2 pl, og bøkene> 15 ul til 15 ul.
- Legge til den normaliserte volum (ul) for hver prøve til en enkelt mikro rør for å skape prøven bassenget.
- Beregn den nye konsentrasjonen for hver prøve ved hjelp av avrundede heltallsverdier og registrere resultatene.
- For å bestemme konsentrasjonen av prøven bassenget, beregne summen av alle enkeltkonsentrasjoner og registrere den resulterende verdi (nM).
- Fortynne prøven bassenget til 1,25 nM hjelp Sequencing fortynningsmiddel (tabell 1).
Merk: Fremgangsmåten kan bli trygt stoppes ved dette trinnet og prøvene lagres ved -15 til -30 ° C. For å starte på nytt, tine frosne prøvene på is før du fortsetter.
7. Sekvense
- denature prøven bassenget i nærvær av pHix Control v3 (tabell 1) ved å legge til følgende: 15 ul 1,25 nM Sample Pool, 3 mL av 0,5 nM pHix og 2 pl 1 N NaOH. Vortex kort etterfulgt av en kort sentrifugering og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
- Plasser denaturert prøve bassenget på is.
- Legg 8 mL av denaturert biblioteket til 992 mL av pre-kjølt HT1-Hyb buffer til en mikro tube. Vortex kort for å blande, etterfulgt av en kort sentrifugering for å samle innhold. Hold på is.
- Legg 600 mL av denaturert og fortynnes biblioteket for å posisjonere # 17 av reagenskassetten.
- Thaw Les 1 Sekvense Grunning (tabell 1), Indeks Les Sekvense Grunning (tabell 1), og lese 2 Sekvense Grunning (tabell 1). I mikrosentrifugerør, separat fortynne 4 pl sekvenseringsprimere med 636 mL HT1-Hyb buffer. Merk: HT1-Hyb buffer er gitt viddh sekvenser reagenssettet (tabell 1).
- Bland ved virvling i 10 sek og sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 sekunder for å samle innhold. Legg 600 mL av utvannet Les 1 sekvenseringsprimere å posisjonere # 18 av sekvense reagenskassett til 600 mL av utvannet Indeks Les Grunning posisjonere # 19, og 600 mL av utvannet Les 2 sekvenseringsprimere å posisjonere # 20.
- Last reagensene på NGS instrument (tabell 1) og rekkefølgen i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør en sammenkoblet-end 2 x 150 syklus sekvense løp.
8. Data Analysis
Merk: NGS instrument programvare konverterer klase bilder til basis samtaler og kvalitetspoeng, og demultiplekser parvise indekser for å generere individuelle gzip-komprimert FASTQ (* .fastq.gz) filer for hver prøve. Før analysere demultiplekset filer, må leseren laste ned og installere den tilhørende bioinformatikk programvare (tabell1). Programvaren kan installeres på en forbruker-grade Windows-PC og krever ikke spesialisert databehandling maskinvare eller en Internett-tilkobling for å utføre dataanalyse.
- Dobbeltklikk på ikonet programvare bordet.
- Logg inn til systemet ved hjelp av brukernavnet og passordet i programvarehåndboken.
- Åpne prosjektet dashbordet, og klikk "New Project".
- Navn prosjektet og gi en valgfri prosjektbeskrivelsen. Velg målrettet NGS paneltype og NGS instrument type. Klikk "Lagre og fortsett".
- Last opp komprimerte FASTQ filene for forover og bakover leser. Ikke last opp de "ikke tilordnede" FASTQs, som inneholder lyder som ikke klarte å Demultiplekse. Klikk "Lagre og fortsett".
- Input antall funksjonelle inngangskopier som brukes for å fremstille hvert bibliotek som bestemt ved DNA-funksjonell kvantifisering assay (se trinn 1 ovenfor). legge til verdier eller kopiere og lime verdiene manuelt fra en spredningark i merknaden tabellen. Klikk "Lagre og fortsett".
- Gjennomgå kommenterte bibliotekene lastet opp for analyse og klikk på "Send analyse" for å starte analysen.
- Overvåke utviklingen av analysen vises gjennom prosjektet dashbordet.
Merk: En analyse komplett statusindikasjon blir presentert når resultatene er klare for gjennomgang. - Gjennomgå de analyserte resultatene for prøve QC beregninger inkludert total dekning per bibliotek, andelen leser passerer filtre, amplicon dekning dybde og ensartethet. Gjennomgå variant kaller for hver sekvensert bibliotek med dbSNP, COSMIC, 1000 genomer og andre kilder til funksjonell og populasjonsnivå merknader.
- Eksportere rå resultatene som oppsummering regneark tabeller, * .bam filer og VCF-filer for langtidslagring eller nedstrøms analyse med utfyllende IT-verktøy.
Representative Results
Totalt 90 prøver (74 unike) representerer positive og negative kontroller, tidligere karakteriserte cellelinjer, og rest kliniske FFPE- tumor biopsier ble vurdert for forsterkende DNA, innspill til multipleks PCR berikelse, merket med sekvens adaptere, strekkodet og analysert i en enkelt Borstemmaskin NGS instrument run (figur 2) som produserte 19,1 M leser passerer filteret. Ekvimolar prøve pooling resultert i høy dybdesekvensering (3,692x leser) og jevn dekning (97,8% av amplikonene dekkes innenfor 5-fold av medianen lese dybde). Utliggere omfattet ingen templat-kontroller, en cellelinje DNA med et stort kopiantall forsterkning, og en FFPE-DNA som ble rapportert for PCR-inhibering av pre-analytiske QC analysen (figur 3). Dekning ensartethet på tvers av de 46 amplikonene ble opprettholdt ved hjelp av tre forskjellige operatører (figur 4A), og for ulike lav kvalitet FFPE DNA-prøver (
Følsomheten og positiv prediktiv verdi for analysen, ble bestemt ut fra en analyse av 97 prøver, inkludert FFPE, FNA, ferskt frosset, og cellelinje DNA, og et total på 195 sekvenseringsresultater. Resultatene viste 365 sanne positive varianten samtaler, 4 falske negative samtaler, og en falsk positiv samtale for en sensitivitet på 98,9% (95% KI: 97,1 til 99,7%) og en positiv prediktiv verdi (PPV) på 99,7% (95% KI : 98,2 til 99,99%). Analyser av indels ble utført for to felles EGFR varianter (p.E746_A750delELREA og p.V769_D770insASV) i 33 prøvekjøringer, viser en sensitivitet på 93,9% (95% CI: 78,4 til 98,9%) og en PPV på 100% (95% KI: 86,3 til 100%) med varianter oppdaget over et område av 2,4 til 84,8%.
Figur 1: Et eksempel på DNA Kvantifisering kalibreringskurver som bestått og ikke bestått QC kriterier (A) En passerer standard kurve.. (B) En sviktende standardkurve. I dette tilfellet ble det feil som skyldes duplikat pipettering av de laveste inngangs DNA standard. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oversikt over en omfattende målrettet NGS System for Oncology Programmer som Integrerer Pre-analytiskal, Analytisk, og Post-analytiske arbeidsflyter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Les Dekning og Uniformity for målrettet NGS av kreftgener i lav kvalitet FFPE DNA Sammenlignet med intakt cellelinje-DNA og kontroller Totalt 90 prøver som er inkludert rest klinisk FFPE (lukkede sirkler), cellelinje (åpne sirkler. ), og syntetiske mal DNA (pluss symboler) ble behandlet ved hjelp av single-tube, 21-genet multipleks PCR berikelse. Hvert fragment bibliotek ble merket med adaptersekvenser for NGS instrument, strekkode med en distinkt dual-indekskoden, renset, kvantifisert, og normalisert til en konsentrasjon på 2,5 nM. DNA-bibliotek ble sekvensert og analysert av følges bioinformatikk programvare. Eksempel på deviasjon inkluderte en fortynningsserie av MDA-MB-468 cellelinje-DNA som bærer et stort EGFR kopitall forsterkning (øvre, åpne rektangler i stiplet sirkel) som forvrengt dekning ensartethet og en melanoma FFPE-prøve som ikke klarte å generere en betydelig antall lyder på grunn til overføring av PCR-inhibitorer fra DNA-ekstraksjon. Den melanom prøven svikt (nederst, stiplet sirkel) ble spådd av pre-analytiske qPCR DNA QC analysen. NTC, no-mal kontroll (x symboler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Amplicon-by-fragment Les Coverage, Uniformity og Variant Detection i Residual Klinisk FFPE Tumor DNA. (A) Les dekning over alt anriket loci i et representativt FFPE DNA-prøve målesover tre forskjellige operatører. Operatør 1, OP1 (blå søyler); Operatør 2, OP2 (grønne søyler); Operatør 3, OP3 (svarte søyler). (B) Dekning ensartethet og variant anrop evaluert ved anvendelse av tre FFPE-tumorprøver, inkludert en kontrollblanding (FFPE3, grå søyler og tekst) består av en kjent 5% BRAF c.1799T> A-mutasjonen. FFPE1 (blå søyler og tekst), FFPE2 (oransje linjer og tekst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Doseavhengig Påvisning av Copy Number Varianter i celle-linje og FFPE DNA MDA-MB-468 cellelinje-DNA med et godt karakterisert EGFR kopitall amplifisering ble progressivt fortynnet i en bakgrunn av en referanse som ikke-muterte celle -line DNA for å illustrere nedgangen i kopiantallet endringen som enfunksjon av fortynning. Prosentandelen av hver cellelinje DNA-prøve er vist med en distinkt linje (0, 12,5, 25, 50 og 100%). Fortynning av en ovarian FFPE tumorprøve med kjent KRAS forsterkning avslørte en lignende profil ved hjelp av samme titrering serien, men med gjentak av 100% FFPE DNA for de to øverste linjene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Nøyaktig Mutation påvisning og kvantifisering til 50 amplifiserbart FFPE DNA-kopier, eller 1,2 ng bulk DNA forøkbare kopiantallet av en tykktarmskreft FFPE-DNA ble bestemt ved qPCR-baserte QC analysen, og fortynnet fra 400 til 25 kopier som en. innspill til multipleks PCR berikelse før sekvensering. Den bioinformatikk rørledning riktig kalt både av kjente Variants ned til 50 eksemplarer, eller tilsvarende ~ 10 mutant maler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn på Material / Material | Selskap | Catalog Number |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 |
| Hemming Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 |
| ROX | Asuragen | 145346 |
| fortynningsmiddel | Asuragen | 145339 |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 |
| DNA Standard (0,4) | Asuragen | 145343 |
| 2x Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 |
| Pan Cancer FFPE kontroll | Asuragen | 145349 |
| Pan Cancer Multi-Variant kontroll | Asuragen | 145350 |
| Bibliotek Pure Prep Perler | Asuragen | 145351 |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 |
| elueringsbuffer | Asuragen | 145353 |
| 2x LQ Master Mix | Asuragen | 145358 |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 |
| LQ PositivKontroll | Asuragen | 145355 |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 |
| Indekskoder (ILMN) - Set A | Asuragen | 150004 |
| AIL001 - AIL048 (48) | ||
| Indekskoder (ILMN) - Sett B | Asuragen | 150005 |
| AIL049 - AIL096 (48) | ||
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 |
| Les 1 sekvenseringsprimere | Asuragen | 150001 |
| Indeks Les sekvenseringsprimere | Asuragen | 150002 |
| Les 2 sekvenseringsprimere | Asuragen | 150003 |
| sekvense~~POS=TRUNC Diluent | Asuragen | 145365 |
| Illumina MiSeq | Illumina | |
| MiSeq Reagens Kit v3 (600-syklus) | Illumina | MS-102-3003 |
| MiSeq Reagens Nano Kit v2 (300-syklus) | Illumina | MS-103-1001 |
| PHix Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
| Magnetisk Stand-96 (eller tilsvarende enhet) | Ambion | AM10027 |
| Quantidex Reporter programvare | Asuragen |
Tabell 1:. Reagenser og Kits Ved første gangs bruk av ROX, oppbevare flasken ved 2-8 ° C. Ikke frys. Programvaren kan lastes ned på www.asuragen.com.
| Gene | COSMIC variant | COSMIC aminosyre | % Variant |
| NRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13.3 |
| NRAS | c.35G> A | p.G12D | 15.2 |
| HRAS | c.182A> G | p.Q61R | 17.8 |
| HRAS | c.35G> A | p.G12D | 9.2 |
| KRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13.5 |
| KRAS | c.35G> A | p.G12D | 19.1 |
| PIK3CA | c.1633G> A | p.E545K | 9.3 |
| PIK3CA | c.3140A> G | p.H1047R | 9.1 |
| KIT | c.2447A> T | p.D816V | 14.6 | EGFR | c.2369C> T | p.T790M | 11.3 |
| EGFR | c.2573T> G | p.L858R | 14.9 |
| BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 17.3 |
Tabell 2: En samlet Syntetisk Kontroll består av 12 "Driver" Kreft genvarianter som er kvantifisert på 9-17% Overflod En blanding av 12 forskjellige double-stranded syntetiske maler bærer 12 forskjellige mutasjoner ble evaluert etter sekvensering.. Alle varianter ble riktig kalt med ingen falske positiver.
| Eksempel ID | Funksjonell cps | Gene | COSMIC variant | COSMIC aminosyre | Median lese- dybde | % Innen 5x av median | |
| BCPAP | 400 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99.5 | 3289 | 96% |
| BCPAP | 10000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,7 | 4040 | 98% |
| BCPAP | 25000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99.4 | 3687 | 96% |
| BCPAP | 50000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,7 | 4611 | 93% |
Tabell 3: Dekning og Variant Calling er bevart gjennom en> 100 ganger Utvalg av DNA-inngang.
Tabell 4: Variant samtaler i 22 FFPE og 20 FNA Tumor Biopsi Enig med resultater fra uavhengige Mutation Analyser Et sett med 22 FFPE svulst DNA med mutasjonsstatus tidligere bestemt av ortogonale målrettede NGS analyser var inngang på 400 til 2928 amplifiserbare kopier til PCR berikelse. trinn og sekvensert ved hjelp av 21-genet Pan Cancer panel. I tillegg er en kohort av 20 FNA DNA-prøver fra tidligere karakteriserte ved hjelp av et flytende vulst rekke mutasjonsforsøk 8 ble PCR-amplifisert ved å bruke 156 til 36 080 inngangs amplifiserbare kopier og sekvensert. Alle overlappende samtaler mellom Pan Cancer NGS panel og refereNCE metoder var enige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
NGS teknologier har redefinert forventninger til avhør de molekylære profiler av tumor biopsier i kliniske settinger 9. En rekke målrettede NGS panelene har blitt utviklet som forsknings teknologier, laboratorie utviklet tester og kommersielt tilgjengelige produkter og tilpassede paneler for å vurdere flere typer kliniske prøver 3,5,10-15. Rapporter fra flere studier har vist verdien av NGS som en sensitiv og spesifikk klinisk verktøy for påvisning av genomiske forandringer 3,10-12,14. Likevel studier har også vist at risikoen for gjenstander som kan føre til falske positive resultater fra utfordrende kreft biopsier som FFPE eksemplarer 2-5,12,14. I tillegg har nyere publikasjoner uthevet høye feilrater for NGS bruker onkologi eksemplarer 16 og falske positive samtaler med kommersielle målrettede NGS paneler som forverres ved bruk av lav-inngang DNA 12. Som et resultat, noe laborakonservative har enten endret eller lagt til flere sjekker og balanserer til kommersielt tilgjengelige målrettede NGS teknologier for å forbedre ytelsen, ofte å sikre nøyaktighet eller bekrefte funnene fra bioinformatiske analyser 5,10,11.
Den 21-gen panel (figur 2) ble utviklet som målrettet innhold for en omfattende NGS system for å avhøre evidensbaserte, handlings mutasjoner i utfordrende prøvetyper som FFPE og FNA tumor biopsier. Arbeidsflyten har en rekke fordeler: 1) konsistens ved å gi jevn amplicon dekning (figur 3 og 4, Tabell 3); 2) lette-av-bruk ved å gi pre-formulert, optimalisert Reagent sett, og forenkle bioinformatikk krav; 3) effektivitet ved å effektivisere arbeidsflyten og redusere antall pipetteringstrinn i forhold til andre kommersielle NGS metoder; og 4) nøyaktighet ved å innlemme en DNA-QC assay for vurdering av Amplifistand DNA kopiantall for å sikre akseptabel mal mangfold og unngå stokastiske svingninger i variant deteksjon fire. Integreringen av pre-analytiske QC data med bioinformatikk analyse åpner for lave tilførsler av FFPE DNA. Dette ble oppnådd ved å trene en beslutnings tre algoritme ved hjelp av ulike funksjonelle kopier av DNA-inngang over 400 FFPE-prøver med uavhengige mål på sannheten, og innlemme denne algoritmen i den bioinformatiske programvare. Som et resultat, er den anbefalte input av 400 amplifiserbare eksemplarer, typisk tilsvarende ~ 5-20 ng FFPE-DNA, sammenligner gunstig med andre metoder 10-12, inkludert hybridisering basert anrikning hvor ~ 250 ng av DNA FFPE anbefales 17,18 . Selv om den teknikk som er beskrevet for bruk på en MiSeq plattform, kan det bli modifisert ved hjelp av PCR-primere Tag med instrument-spesifikk adaptere for å gjøre det mulig sekvensanalyse på andre NGS plattformer.
Flere trinn er avgjørende for å sikre suksessav prosedyren. Den pre-analytiske QC analysen bestemmer det forøkbare kopiantallet av DNA og rapporter funksjonell inhibering. Imidlertid, hvis mindre enn 400 amplifiserbare DNA-kopier blir brukt i PCR-oppformering trinnet, er det en økt risiko for et falskt negativt anrop fra prøver med lav-overflod mutasjoner (figur 6). I tillegg må man være forsiktig under bibliotek rensing for å forhindre overtørking av de magnetiske kuler under vaske- eller eluering trinn. Dessuten er vellykket bibliotek kvantifisering svært avhengig av nøyaktig fortynning av bibliotek DNA. For det beste resultatet, vil forskjellen i qPCR resultater for prøven biblioteket (Cq FAM) sammenlignet med LQ Standard (Cq VIC) bør være ≤3.3 Cq. Dersom forskjellen er større enn 3,3 Cq, re-fortynning og testing av prøven er anbefalt. Selv om en god korrelasjon har blitt observert mellom denne konkurranse qPCR metoden og kommersielle kits som tilbyr absolutt kvantifisering ved hjelp av en standard kurve, En forskyvning av biblioteket tilførsel til klonale forsterkningstrinn i forhold til andre fremgangsmåter kan være nødvendig for å oppnå optimal poding tetthet.
Noen kreftprøver er spesielt utfordrende å sekvensere grunn av inhibitorer som vedvarer etter DNA isolering. For å identifisere disse prøvene før biblioteket forberedelse, qPCR QC analysen påviser også forsterkning hemming ved å inkludere en eksogen mal som fungerer som både en intern kontroll og et fast punkt for funksjonell hemming. Et eksempel er vist i figur 3 hvor et melanom DNA-prøve mislyktes i å passere QC inhibering metrisk før sekvensering og deretter ikke klarte å generere et bibliotek som kan bli sekvensert. Svikten var sannsynligvis en konsekvens av melanin forurensning, en kjent PCR-inhibitor, overført fra FFPE DNA isoleringstrinnet. Prøver som er identifisert av QC analyse for å være i faresonen for forsterkning svikt kan være berget gjennom en ekstra opprydding trinn to fjerne potensielle hemmere.
Den målrettede 21-gen panel fokuserer på evidensbaserte genet hotspots og gir et komplett system med optimaliserte reagenser og kontroller for DNA QC, NGS og bioinformatikk programvare blir informert av pre-analytiske "funksjonelle" DNA kvantifisering resultater. Fremgangsmåten detekterer nøyaktig basis-substitusjonsmutasjoner og indels fra lav-inngang DNA, og et eksempel på et NGS system med mulighet for å ekspandere panelet innhold, for å detektere ytterligere varianter som CNVs og være tilpasset for målrettet RNA-sekvensering.
Disclosures
JH, AH, RZ, BCH, og GJL er ansatt og har lager eierskap i Asuragen, Inc. RZ, BCH, og GJL er co-oppfinnere på en patentsøknad for å bedre variant ringe med forsterkende kopinummerinformasjon bestemt for hver prøve.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Annette Schlageter for gjennomgang av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd CP120017 fra Cancer Prevention and Research Institute of Texas (PI: GJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer/Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
- Medicines in Development for Cancer. , Available from: http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf 1-103 (2014).
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77 (2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710 (2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
