Abstract
Alle næste generation sekventering (NGS) procedurer omfatter analyser udført på laboratoriet bænken ( "våd bænk") og data analyser udføres med bioinformatik rørledninger ( "tør bænk"). Begge elementer er afgørende for at skabe præcise og pålidelige resultater, som er særligt kritiske for kliniske laboratorier. Målrettede NGS teknologier har i stigende grad fundet Nåde for onkologi applikationer til at hjælpe forhånd præcision medicin mål, men de metoder, ofte involverer afbrudt og variable våde og tørre bænk arbejdsgange og ukoordinerede reagenser sæt. I denne rapport beskriver vi en metode til sekventering udfordrende kræft prøver med en 21-gen panel som et eksempel på et omfattende målrettet NGS-system. Systemet integrerer funktionelle DNA kvantificering og kvalificering, single-rør multiplex PCR berigelse, og bibliotek rensning og normalisering hjælp analytisk-verificerede, single-source-reagenser med en standalone bioinformatik suite.Som et resultat, nøjagtig variant opkald fra lav kvalitet og lav mængde formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) og kan opnås fine-nål aspiration (FNA) tumorbiopsier. Fremgangsmåden kan vurderes rutinemæssigt cancerassocierede varianter fra et input på 400 amplificerbare DNA-kopier, og er modulopbygget for at imødekomme nye gen indhold. To forskellige typer af analytisk definerede kontrol giver kvalitetssikring og hjælp beskyttelsesklausul opkald nøjagtighed med klinisk relevante prøver. En fleksibel "tag" PCR trin integrerer platform-specifikke adaptere og indekskoder at tillade prøve stregkoder og kompatibilitet med fælles stationære NGS instrumenter. Vigtigt er det, protokollen er strømlinet og kan producere 24 sekvens-klar biblioteker på en enkelt dag. Hvis man fulgte den forbinder våde og tørre bænk processer ved inkorporering kontrolresultater præ-analytisk prøve kvalitet direkte i variant ringer algoritmer til at forbedre mutationsdetektion nøjagtighed og differentiere falsk-negative og indeterminate opkald. Denne målrettede NGS metode bruger fremskridt i både wetware og software for at opnå høj-dybde, multiplex sekventering og følsom analyse af heterogene prøver kræft til diagnostiske applikationer.
Introduction
Precision medicin afhængig af individualisering af diagnostiske og terapeutiske muligheder for patienter. Løftet om skræddersyede behandlinger er en direkte følge af en bedre forståelse af smitteveje, der kan informere sammenkobling af molekylær diagnostik og målrettede lægemidler. For eksempel brugen af molekylært målrettede behandlinger steget fra 11% til 46% fra 2003 til 2013 en, og kræftmedicin såsom vemurafenib og crizotinib er FDA-godkendt med ledsagende diagnostiske tests. Med sin evne til præcist genvinde med lav hyppighed sekvens mål på tværs stærkt multipleksede prøvesæt, har næste generation sekventering (NGS) opstået som en metode til evaluering af genetiske afvigelser i forbindelse med cancer og identifikation molekylære mål for præcision medicin.
De mest almindelige solide tumorer biopsier for molekylær test omfatter formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) og fin-nål aspiration (FNA) specimENS. Disse prøver er fyldt med lav mængde og / eller lav kvalitet nukleinsyrer, der udfordrer nøjagtig NGS vurderinger 2-5. Aktuelle kommercielle NGS metoder til analyse af disse prøver er baseret på et kludetæppe af forskellige reagenser, protokoller og IT-værktøjer, der repræsenterer bevægelige mål af løbende forbedringer. For eksempel, ændringer i assay kemi og / eller software opstod hver 1-2 måneder for de mest almindeligt anvendte målrettede NGS kits 6. Denne ustabilitet afspejler en manglende sammenhæng i konstruere og verificere et forenet NGS system til udfordrende prøvetyper, især til test kræft, og sætter en urimelig byrde for laboratorier til at udvikle sammenhængende protokoller, der er optimeret fra prøve-til-resultater. Faktisk en nylig undersøgelse af NGS brugere fremhævede vanskelighederne ved disse "hurtigt skiftende" teknologier, sammen med kravene til etablerede, medicinsk-handlingsrettede indhold, forskanset bioinformatik ekspertise, en solidified og integreret procedure, der kan gennemføres hurtigt, og strømlinede arbejdsgange og forenklede protokoller, der letter on-the-job træning 7. I denne artikel er et omfattende system til målrettet NGS beskrevet, der løser disse huller.
Den præsenterede metode integrerer alle proceduremæssige skridt fra præ-analytisk til post-analytisk på både våde og tørre bænke til at forbedre nøjagtigheden, følsomhed og pålidelighed mål kvantificering og detektion NGS af klinisk relevant kræft gen loci. Denne fremgangsmåde begynder med kvantificering af "funktionel" DNA 4 for at vurdere DNA kvalitet, guide input til PCR berigelse skridt, og beskytter mod falsk-positive opkald, der kan opstå i forbindelse med afhøringen af meget lave skabelon kopier. En enkelt-rør multiplex-PCR beriger derefter til 46 loci i 21 cancer gener kun bruger 400 amplificerbare DNA-kopier, efterfulgt af inkorporering af platform-specifikke sekvenser for NGS using fælles desktop sekventering instrumenter. Biblioteker oprenses ved anvendelse af en simpel magnetisk perle procedure og kvantificeret med en hidtil ukendt, kalibreringsfri qPCR assay. En standalone bioinformatik suite, informeret af prøve-DNA QC resultater til at forbedre opkald ydeevne, giver sekvensanalyse efter NGS. Vi præsenterer data ved hjælp af dette system tilgang for målrettet NGS at afsløre basis-substitutionsmutationer, indsættelse / sletninger (indels), og kopier nummer varianter (CNVs) i lav kvalitet og lav mængde tumorbiopsier såsom FFPE og FNA prøver, og køre kontroller.
Protocol
Bemærk: Denne protokol beskriver samtidig behandling af prøver ved hjælp af en MiSeq NGS System, men kan tilpasses til den personlige Genome Machine (PGM) instrument. For den anbefalede minimale DNA indgang på 400 amplificerbare skabelonkopier er assayet stand til at producere mindst 3,000x median dækning af hver af 96 prøver pr NGS løb, og tilsvarende dækning dybde i 24 prøver ved anvendelse PGM på en 318 chip. Fremgangsmåden kræver også anvendelsen af en real-time PCR instrument.
1. DNA Funktionel Kvantificering og kvalitetskontrol (QC)
- Tø reagenser: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Hæmning Primer Probe Mix, 6-carboxy-X-rhodamin (ROX), fortyndingsmiddel og de fire humant genomisk DNA kalibrering kurve standarder (DNA Standard (50 ng / pl), DNA Standard (10 ng / pl), DNA Standard (2 ng / pl), og DNA Standard (0,4 ng / pl)) (tabel 1). Vortex alle reagenser til 10 sek og centrifuger ved maksimal hastighed i 10 sek til at indsamle indhold.Hold 2x mester mix på is.
- Forbered en tilstrækkelig mængde mester mix til det samlede antal prøver, der skal testes, og omfatter 10% mere volumen for at undgå mangel på grund af pipettering. Forbered master mix i et mikrocentrifugerør ved hjælp af følgende mængder pr prøve: 5 pi 2x Master Mix, 0,5 pi Primer Probe Mix, 0,5 pi Hæmning Primer Probe Mix, 0,05 pi ROX og 2,95 pi diluent. Vortex i 10 sek, og der centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Tilføj 9 pi mastermix i brønde i en plade med 96 brønde.
- Tilsæt 1 pi DNA Standards in duplo til at generere en kalibreringskurve. Bland ved pipettering op og ned 5 gange.
- Sikre nukleinsyreprøven er godt blandet før brug. Tilsæt 1 pi prøve til master mix og bland ved pipettering op og ned 5 gange.
- Forsegle skiltet, vortex i 10 sekunder og centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Pladen anbringes i PCR System. Tildel både FAM (funktionel kvantificering) og VIC (funktionel inhibering) detektorer for hver prøve i overensstemmelse med producentens anvisninger. Udfør PCR-cykler af 10 minutter ved 95 ° C, og 40 cykler (15 sekunder ved 95 ° C, 1 min ved 60 ° C).
- Analyser qPCR data ved at generere en lineær regression plot for hver af de dublerede DNA-standarder ved hjælp af software-protokoller.
- Plotte Log 10 af kopiantallet for hver DNA standard på x-aksen og den tilsvarende FAM C q værdi på y-aksen.
- Bekræfter, at resultaterne fra nukleinsyreprøven falder inden for dynamiske område af DNA Standards kalibreringskurven, og derefter beregne koncentrationen af det ukendte DNA i "funktionel" eller amplificerbare kopiantal pr pi fra sin tilsvarende position på referencestandard kurve. Figur 1 viser eksempler på kalibreringskurver der passerede og mislykkedes. </ Li>
- Bestemme, om amplifikation fandt sted i hver reaktion ved at kontrollere for tilstedeværelsen af det ikke-humane målamplicon i VIC kanal.
Bemærk: Som en positiv kontrol, den Inhibering Primer probemixen indeholder primers til et ikke-humant exogent målet og den tilsvarende skabelon. Inhiberingen Primer probemix er en komponent af master mix, der tilsættes til hver reaktion, herunder kontrol uden template (NTC). I fravær af en inhibitor, bør altid detekteres PCR-produktet for den ikke-humane mål i VIC kanal. En "uopdaget" C q for en prøve i VIC-kanalen indikerer tilstedeværelsen af PCR-inhibitorer, der kan have gavn af efterfølgende oprydning af prøven forud for yderligere behandling.
2. Bibliotek Forberedelse: Gene-specifik (GS) PCR
- Forbered en tilstrækkelig mængde mester mix til det samlede antal prøver, der skal testes, og omfatter 10% mere volumen for at undgå mangel på grund af pipettIng. Forbered GS PCR Master Mix i et mikrocentrifugerør ved anvendelse af følgende mængder pr prøve: 5 pi 2x Amplification Master Mix (tabel 1) og 1 pi Pan Cancer Primer Panel (tabel 1). Bland ved pipettering op og ned, vortex i 10 sekunder og centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Alikvot den 6 pi GS PCR Master Mix i brønde i en plade med 96 brønde. Tilsættes 4 pi af hver nukleinsyreprøve i individuelle brønde. Til andre brønde, tilsættes 4 pi af FFPE Kontrol (tabel 1), 4 pi af Multi-Variant kontrol (tabel 1), og 4 pi af nuklease-frit vand til en proceduremæssig NTC. For hver tilsætning, bland ved pipettering op og ned 5 gange.
- Forsegle skiltet, vortex i 10 sekunder og centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Pladen anbringes i thermocycler for følgende PCR-cykler: 5 minutter ved 95 ° C,2 cykler (15 sekunder ved 95 ° C, 4 min ved 60 ° C), 23 cykler (15 sekunder ved 95 ° C, 4 min ved 72 ° C), og en afsluttende forlængelse på 10 minutter ved 72 ° C. Hold ved 4 ° C.
Bemærk: Efter afslutning af trin 2.4, vil pladen blive benævnt GS PCR-plade.
3. Bibliotek Forberedelse: Tag PCR
- Tø reagenser: 2x Index Master Mix (tabel 1) og indekskoder (tabel 1). Vortex i 10 sek, og der centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
Bemærk: Index Koder er forblandet at give et unikt sæt af parvise indeks (stregkoder) for hver prøve. - I en 96-brønds plade, tilsættes 7,5 ul af 2x Index Master Mix og 5,5 ul af et indeks kode til en specificeret godt og bland ved pipettering op og ned 5 gange.
- Åbn forsigtigt GS PCR-plade, og der tilsættes 2 pi GS PCR-produkt til den nye plade med master mix. Bland ved pipettering op og ned 5 gange. For hver prøve registrere prøve-ID og de tilsvarende parvise indekskoder. Forsegle skiltet, vortex i 10 sekunder og centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Pladen anbringes i thermocycler og PCR i 5 minutter ved 95 ° C, 10 cykler (30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, 1 min ved 72 ° C), og en endelig forlængelse på 10 minutter ved 72 ° C. Hold ved 4 ° C.
Bemærk: Efter afslutning af trin 3.4, vil pladen blive benævnt Tag PCR-plade.
4. Bibliotek Rensning og Størrelse Selection
- Fjern Bibliotek Pure Prep magnetiske perler (tabel 1) og elueringspuffer (tabel 1) fra 2-8 ° C og tillade at ækvilibrere til stuetemperatur i 30 minutter. Tilføj 9,6 ml 100% ethanol til vaskebuffer (tabel 1) beholder, cap og bland ved at vende flasken flere gange.
- Vortex de magnetiske perler i 10 sekunder og tilføje 11 pi i separate brønde i en 96-brønds plade.
- Åbn Tag PCR-plade, og der tilsættes 10 ul Tag PCR-produkt til perler og pipette mix 5 gange. Inkuber blandingen i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Placer 96-brønds plade på den magnetiske stativ (tabel 1) i 4 minutter. Med den 96-brønds plade stadig på standen, fjern og kassér supernatanten med en pipette.
- Fjern plade med 96 brønde fra den magnetiske stativ og tilsættes 100 pi ethanol-holdige vaskebuffer til hver brønd, og bland ved pipettering op og ned 5 gange. Inkuber i 2 min.
- Placer plade med 96 brønde på den magnetiske stativ i 2 min, derefter fjerne og kassere supernatanten med en pipette.
- Gentag trin 4.5, i alt 2 ethanol vasker, fjerne så meget vaskeopløsning muligt efter den anden vask.
- Med 96-brønds plade på den magnetiske stativ, tørre perlerne i 2 minutter ved stuetemperatur, derefter fjerne pladen fra stativet.
- Resuspendere perlerne ved at tilsætte 20 pi elueringspuffer til hver welll og pipette op-og-ned 5 gange.
- Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Placer 96 brønde tilbage på den magnetiske stativ i 4 minutter, og fjern forsigtigt og overføre 18 pi af den klare supernatant til en ny brønd.
Bemærk: Proceduren kan stoppes sikkert på dette trin og prøver opbevaret ved -15 til -30 ° C. For at genstarte, optø frosne prøver på is, før du fortsætter.
5. Bibliotek Kvantificering
- Thaw Bibliotek Quant (LQ) reagenser: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standard, LQ Positiv Kontrol, LQ fortyndingsmiddel og LQ ROX (tabel 1). Vortex i 10 sek, og der centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Anvendelse af renset biblioteksprodukter, udføre en seriefortynding af hver enkelt prøve i LQ fortyndingsmiddel.
- Tilsæt 2 pi (bibliotek renset produkt) til 198 pi LQ fortynder og bland op-og-ned med en pipette 10 gange.
- Tilsæt 2 pi (1: 100 fortynding) til 198 pi LQ fortynder og blande-og-ned med en pipette 10 gange.
- Forbered en tilstrækkelig mængde LQ mester mix til det samlede antal prøver, der skal testes, og omfatter 10% mere volumen for at undgå mangel på grund af pipettering. Forbered LQ Master Mix i et mikrocentrifugerør ved hjælp af følgende mængder pr prøve: 5 pi 2X LQ Master Mix, 2 pi LQ Primer / Probe Mix, 0,5 pi LQ Standard og 0,5 pi LQ ROX. Bland ved pipettering op og ned, vortex i 10 sekunder og centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold.
- Tilsæt 8 pi LQ mastermix til en brønd af en optisk plade med 96 brønde.
- I separate brønde, tilsættes 2 pi fortyndet bibliotek, 2 pi LQ positive kontrol og 2 pi LQ Fortynder (NTC) og bland ved pipettering op og ned 5 gange. Forsegle skiltet med optisk selvklæbende film, vortex i 10 sekunder og centrifugeres ved 400 xg i 10 sek for at indsamle indhold.
- Tildel både FAM og VIC detectors for hver prøve. Udfør PCR-amplifikation ved anvendelse cyklusbetingelser af 5 minutter ved 95 ° C, og 40 cykler (15 sekunder ved 95 ° C, 1 min ved 60 ° C).
- Bestemme koncentrationen af hver prøve (nM) ved anvendelse af sammenlignende C q metode. Beregn forskellen af de kendte LQ Standard (C q VIC) til ukendte bibliotek (C q FAM). Koncentrationen af den fortyndede prøve (pM) beregnes under anvendelse af følgende ligning:
[Konc lib] nM = 12,5 x 2 Δ Cq
Hvis der anvendes en anden end 10.000 fortyndingsfaktor, beregne forholdet mellem mål-fortyndingsfaktor til 10.000, og formere denne faktor af resultatet af ligningen i 5.7.
6. Bibliotek Normalisering og Sample Pooling
- Bestem medianen koncentration (nM) på tværs af alle prøver (hver indeholder en unik parvis indeks), der skal samles.
- Bestem den enkelte prøve volume (pl) til at samle ved at gange den mediane koncentration på tværs af alle prøver med 5, så dividere med dens individuelle koncentration (nM). Rundt den resulterende værdi til nærmeste heltal. Runde volumener med værdier <2 pi til 2 pi, og mængder> 15 gl til 15 pi.
- Tilsæt normaliserede volumen (pi) for hver prøve til en enkelt mikrocentrifugeglas at skabe prøven pool.
- Beregn den nye koncentration for hver prøve ved hjælp af afrundede heltalsværdier og registrere resultaterne.
- At bestemme koncentrationen af prøven pool, beregne summen af alle individuelle koncentrationer og registrere den resulterende værdi (nM).
- Fortynde prøven puljen til 1,25 nM under anvendelse Sequencing Diluent (tabel 1).
Bemærk: Proceduren kan stoppes sikkert på dette trin og prøver opbevaret ved -15 til -30 ° C. For at genstarte, optø frosne prøver på is, før du fortsætter.
7. Sekventering
- Denature prøven pool i nærvær af PhiX Kontrol v3 (tabel 1) ved tilsætning af følgende: 15 pi 1,25 nM Sample Pool, 3 pi af 0,5 nM PhiX og 2 pi af 1 N NaOH. Vortex kortvarigt efterfulgt af en kort centrifugering og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Placer denaturerede prøve pulje på is.
- Tilsæt 8 pi denatureret bibliotek til 992 pi præ-kølet HT1-Hyb-buffer til et mikrocentrifugerør. Vortex kort at blande, efterfulgt af en kort centrifugering for at indsamle indhold. Hold på is.
- Tilsættes 600 pi af den denaturerede og fortyndet bibliotek til position # 17 af reagenset patronen.
- Thaw Læs 1 sekventeringsprimere (tabel 1), Index Læs sekventeringsprimere (tabel 1), og læs 2 sekventeringsprimere (tabel 1). I mikrocentrifugerør, separat fortyndet 4 pi sekventeringsprimere med 636 pi HT1-Hyb-buffer. Bemærk: HT1-Hyb buffer er forudsat with sekventeringen reagenskittet (tabel 1).
- Vortexes i 10 sek, og der centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek for at indsamle indhold. Tilføj 600 pi fortyndede Læs 1 sekvensprimere at positionere # 18 af sekventering reagenskassette til 600 pi fortyndede Indeks Læs Primere positionere # 19, og 600 pi fortyndet Læs 2 sekvensprimere at positionere # 20.
- Indlæse reagenserne på NGS instrument (tabel 1) og sekvens ifølge producentens anvisninger. Udfør en parret udgang 2 x 150 cyklus sekventering køre.
8. Data Analysis
Bemærk: Den NGS instrument software konverterer klynge billeder til base-opkald og kvalitet scoringer, og demultiplekser parvise indekser til at generere individuelle gzip-komprimeret FASTQ (* .fastq.gz) filer for hver prøve. Forud for at analysere de demultipleksede filer, skal læseren hente og installere den tilhørende bioinformatik software (tabel1). Softwaren kan installeres på en forbruger-grade Windows-pc og kræver ikke specialiseret computing hardware eller en internetforbindelse til at udføre dataanalyse.
- Dobbeltklik på ikonet software skrivebordet.
- Login til systemet ved hjælp af brugernavn og den adgangskode, i softwaren manual.
- Åbn instrumentbræt projektet, og klik på "Nyt projekt".
- Navngiv projektet og give en valgfri projektbeskrivelse. Vælg den målrettede NGS panel type og NGS instrumenttype. Klik på "Gem og fortsæt".
- Upload de komprimerede FASTQ filer til frem og bak læser. Du må ikke uploade de "ikke-tildelte" FASTQs, som indeholder læser, der har undladt at demultiplex. Klik på "Gem og fortsæt".
- Input antallet af funktionelle input eksemplarer anvendes til fremstilling hvert bibliotek som bestemt ved DNA funktionelle kvantificering assay (se trin 1 ovenfor). Manuelt tilføje værdier eller kopiere og indsætte værdier fra en spredningark i annotation tabellen. Klik på "Gem og fortsæt".
- Gennemgå de kommenterede biblioteker uploadet til analyse og klik på "Send analyse" for at starte analysen.
- Overvåge udviklingen af analysen vises via instrumentbrættet projektet.
Bemærk: En analyse komplet status indikation præsenteres, når resultaterne er klar til gennemgang. - Gennemgå de analyserede resultater for prøve QC målinger herunder samlede dækning pr bibliotek, procentdel af læser passerer filtre, amplicon dækning dybde og ensartethed. Gennemgå variant kræver hver sekventeret bibliotek med dbSNP, COSMIC, 1.000 genomer og andre kilder til funktionelle og befolkningsniveau annotation.
- Eksporter de rå resultater som resumé regneark tabeller, * .bam filer og * .vcf filer til langtidsopbevaring eller downstream analyse med komplementære IT-værktøjer.
Representative Results
I alt 90 prøver (74 unikke), der repræsenterer positive og negative kontroller, tidligere karakteriserede cellelinjer, og resterende kliniske FFPE tumorbiopsier blev vurderet for amplificerbart DNA, input til multiplex-PCR berigelse, mærket med sekvens adaptere, barcoded, og analyseret i en enkelt bordmodel NGS instrument run (figur 2), der producerede 19,1 M læser passerer filteret. Ækvimolær prøve pooling resulterede i høj dybde sekventering (3,692x læser) og ensartet dækning (97,8% af amplikoner dækket inden for 5-fold af median læse dybde). Outliers omfattede uden template kontrol, en cellelinie DNA med et stort kopital amplifikation, og en FFPE DNA, som er blevet markeret for PCR inhibering med præ-analytiske QC assay (figur 3). Dækning ensartethed på tværs af de 46 amplikoner blev opretholdt under anvendelse af tre forskellige operatører (figur 4A), og for forskellige lav kvalitet FFPE DNA-prøver (
Følsomheden og positiv prædiktiv værdi for assayet blev bestemt ud fra en analyse af 97 prøver, herunder FFPE, FNA, frisk-frosset, og celle-linje DNA og alt 195 sekventeringsresultaterne. Resultaterne viste 365 sande positive variant opkald, 4 falske negative opkald og en falsk positiv opfordring til en følsomhed på 98,9% (95% CI: 97,1-99,7%) og en positiv prædiktiv værdi (PPV) på 99,7% (95% CI : 98,2 til 99,99%). Analyser af indels blev udført for to fælles EGFR varianter (p.E746_A750delELREA og p.V769_D770insASV) i 33 sample-løber, viser en følsomhed på 93,9% (95% CI: 78,4-98,9%) og en PPV på 100% (95% CI: 86,3 til 100%) med varianter detekteret over et område på 2,4 til 84,8%.
Figur 1: Et eksempel på DNA Kvantificering kalibreringskurver der Pass og Fail QC Kriterier (A) en passerer standard kurve.. (B) En svigtende standardkurve. I dette tilfælde blev fejl forårsaget af to eksemplarer pipettering af det laveste input DNA standard. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over en omfattende målrettet NGS System til Oncology Programmer, der Integrerer Pre-analytiskal, Analytical, og Post-analytiske arbejdsgange. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Læs Dækning og Ensartethed for målrettede NGS for kræft gener i Low-kvalitet FFPE DNA Sammenlignet med Intakt Cell-line DNA og kontroller alt 90 prøver, der omfattede resterende kliniske FFPE (lukkede cirkler), celle-line (åbne cirkler. ), og syntetisk template-DNA (plus symboler) blev bearbejdet under anvendelse af enkeltstrenget rør, 21-genet multiplex-PCR berigelse. Hver amplikon bibliotek blev mærket med adapter sekvenser for NGS instrumentet, stregkodede med en særskilt dual-indeks kode, renset, kvantificeret og normaliseret til en koncentration på 2,5 nM. DNA-biblioteket blev sekventeret og analyseret af følgesvend bioinformatik software. Sample devitioner omfattede en fortyndingsrække af MDA-MB-468 cellelinje-DNA forsynet med et stort EGFR kopital amplifikation (øverste, åbne rektangler inden stiplede cirkel), der forvrængede dækning ensartethed og en melanom FFPE prøve, som undlod at generere et stort antal læser skyldes til fremførsel af PCR-inhibitorer fra DNA-ekstraktion. Den manglende melanom prøve (bund, prikket cirkel) blev forudsagt af den præ-analytiske qPCR DNA QC assay. NTC, no-skabelon kontrol (x symboler). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Amplikon-by-amplikon Læs Dækning, Ensartethed og Variant Detection i Resterende Clinical FFPE Tumor-DNA. (A) Læs dækning på tværs af alle beriget loci i et repræsentativt FFPE DNA-prøve måltpå tværs af tre forskellige operatører. Operatør 1, Op1 (blå søjler); Operatør 2, Op2 (grønne søjler); Operatør 3, OP3 (sorte søjler). (B) Dækning ensartethed og variant opkald evalueret ved hjælp af tre FFPE tumor prøver, herunder en kontrol blanding (FFPE3, grå bjælker og tekst) består af en kendt 5% BRAF c.1799T> En mutation. FFPE1 (blå barer og tekst), FFPE2 (orange barer og tekst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Dosisafhængig Påvisning af Copy Number Varianter i Cell-line og FFPE DNA MDA-MB-468 cellelinje-DNA med en velkarakteriseret EGFR kopital amplifikation blev progressivt fortyndet i en baggrund af en reference ikke-muterede celle -line DNA at illustrere fald i kopiantal forandring som enfunktion af fortyndingen. Procentdelen af hver cellelinie DNA-prøve er vist med en distinkt linie (0, 12,5, 25, 50, og 100%). Fortynding af en æggestokkene FFPE tumor prøve med en kendt KRAS forstærkning afslørede en lignende profil med det samme titrering serie, men med replikater af 100% FFPE DNA for de to øverste linjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Nøjagtig Mutation detektion og kvantificering til 50 amplificerbare FFPE DNA-kopier, eller 1,2 ng Bulk DNA Det amplificerbare kopital af en coloncancer FFPE DNA blev bestemt ved qPCR-baserede QC assay og fortyndet fra 400 til 25 kopier som en. input til multiplex-PCR berigelse inden sekventering. Den bioinformatik rørledning korrekt kaldt begge de kendte Variants ned til 50 kopier, eller hvad der svarer til ~ 10 mutant skabeloner. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på Material / Material | Selskab | katalognummer |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145.345 |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145.336 |
| Hæmning Primer Probe Mix | Asuragen | 145.344 |
| ROX | Asuragen | 145.346 |
| Fortynder | Asuragen | 145.339 |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145.340 |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145.341 |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145.342 |
| DNA Standard (0,4) | Asuragen | 145.343 |
| 2x Amplification Master Mix | Asuragen | 145.348 |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145.347 |
| Pan Cancer FFPE Kontrol | Asuragen | 145.349 |
| Pan Cancer Multi-Variant Kontrol | Asuragen | 145.350 |
| Bibliotek Pure Prep Beads | Asuragen | 145.351 |
| Wash Buffer | Asuragen | 145.352 |
| Elution Buffer | Asuragen | 145.353 |
| 2x LQ Master Mix | Asuragen | 145.358 |
| LQ Fortynder | Asuragen | 145.354 |
| LQ PositivKontrol | Asuragen | 145.355 |
| LQ Standard | Asuragen | 145.356 |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145.357 |
| LQ ROX | Asuragen | 145.359 |
| Indeks Koder (ILMN) - Set A | Asuragen | 150.004 |
| AIL001 - AIL048 (48) | ||
| Indeks Koder (ILMN) - Set B | Asuragen | 150.005 |
| AIL049 - AIL096 (48) | ||
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145.361 |
| Læs 1 sekventeringsprimere | Asuragen | 150001 |
| Indeks Læs sekventeringsprimere | Asuragen | 150002 |
| Læs 2 sekventeringsprimere | Asuragen | 150.003 |
| Sequencing Fortynder | Asuragen | 145.365 |
| Illumina MiSeq | Illumina | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 |
| PhiX Kontrol v3 | Illumina | FC-110-3001 |
| Magnetisk Stand-96 (Eller tilsvarende anordning) | Ambion | AM10027 |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
Tabel 1:. Reagenser og Kits Ved første brug af ROX, opbevare hætteglasset ved 2-8 ° C. Må ikke nedfryses igen. Software kan downloades på www.asuragen.com.
| GeNE | COSMIC variant | COSMIC aminosyre | % Variant |
| nationale tilsynsmyndigheder | c.182A> G | p.Q61R | 13.3 |
| nationale tilsynsmyndigheder | c.35G> A | p.G12D | 15.2 |
| HRAS | c.182A> G | p.Q61R | 17.8 |
| HRAS | c.35G> A | p.G12D | 9.2 |
| KRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13.5 |
| KRAS | c.35G> A | p.G12D | 19.1 |
| PIK3CA | c.1633G> A | p.E545K | 9.3 |
| PIK3CA | c.3140A> G | p.H1047R | 9.1 |
| KIT | c.2447A> T | p.D816V | 14.6 | EGFR | c.2369C> T | p.T790M | 11.3 |
| EGFR | c.2573T> G | p.L858R | 14.9 |
| BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 17.3 |
Tabel 2: en poolet Syntetisk Control Består af 12 "Driver" Cancer genvarianter, der kvantificeres ved 9-17% Overflod En blanding af 12 forskellige dobbelt-strenget syntetiske skabeloner bærer 12 forskellige mutationer blev evalueret efter sekventering.. Alle varianter blev korrekt kaldt uden falske positiver.
| Sample ID | Funktionel cps | Gene | COSMIC variant | COSMIC aminosyre | Median læse dybde | % Inden 5x af median | |
| BCPAP | 400 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,5 | 3289 | 96% |
| BCPAP | 10.000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,7 | 4040 | 98% |
| BCPAP | 25.000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,4 | 3687 | 96% |
| BCPAP | 50.000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,7 | 4611 | 93% |
Tabel 3: Dækning og Variant Calling bevares Over en> 100 gange Range af DNA Input.
Tabel 4: Variant opkald i 22 FFPE og 20 FNA tumorbiopsier Enig med Resultater fra Independent Mutation Analyser Et sæt af 22 FFPE tumor DNA med mutation status tidligere bestemt af ortogonale målrettede NGS analyser var input på 400 til 2928 amplificerbare kopier i PCR berigelse. trin og sekventeret ved anvendelse af 21-genet Pan Cancer panel. Derudover en kohorte af 20 FNA DNA-prøver tidligere karakteriserede ved anvendelse af en flydende kugle-array mutation assay 8 blev PCR-amplificeret under anvendelse af 156 til 36.080 input amplificerbare kopier og sekventeret. Alle overlappende opkald mellem Pan Cancer NGS panel og refereNCE metoder var enige. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
NGS teknologier har redefineret forventninger spørgekriterierne de molekylære profiler af tumorbiopsier i klinisk 9. En række målrettede NGS panelerne er udviklet som forskningsteknologier, laboratorie udviklede tests, og kommercielt tilgængelige produkter og brugerdefinerede paneler til vurdering af flere typer af kliniske prøver 3,5,10-15. Rapporter fra flere undersøgelser har vist værdien af NGS som en følsom og specifik klinisk redskab til påvisning af genomisk ændringer 3,10-12,14. Men undersøgelser har også vist, at risikoen for artefakter, som kan forårsage falsk-positive resultater fra udfordrende kræft biopsier såsom FFPE prøver 2-5,12,14. Derudover har de seneste publikationer fremhævet høje fejlrater for NGS hjælp onkologi prøver 16 og falsk-positive samtaler med kommercielle målrettede NGS paneler, der forværres ved brug af lav-input DNA 12. Som et resultat, nogle laboraKonservative har enten ændret eller tilføjet yderligere kontrol og balance til kommercielt tilgængelige målrettede NGS teknologier til at forbedre ydeevnen, ofte for at sikre nøjagtigheden eller bekræfte resultaterne fra bioinformatiske analyser 5,10,11.
Den 21-genet (figur 2) blev udviklet som målrettet indhold for en omfattende NGS system til at afhøre evidensbaserede, handlingsrettede mutationer i udfordrende prøvetyper som FFPE og FNA tumorbiopsier. Arbejdsprocessen har en række fordele: 1) konsistens ved at give ensartet amplicon dækning (figur 3 og 4, tabel 3); 2) lethed-i-brug ved at give præ-formuleret, optimerede reagenser sæt, og forenkle bioinformatik krav; 3) effektivitet ved at strømline arbejdsgangen og reducere antallet af pipetteringstrin i forhold til andre kommercielle NGS metoder; og 4) nøjagtighed ved at inkorporere en DNA QC assay til vurdering af forstærker,stand DNA-kopi antal til at sikre acceptabel skabelon mangfoldighed og undgå stokastiske udsving i variant detektering 4. Integrationen af den præ-analytiske QC data med bioinformatik analyse giver mulighed for lave indgange FFPE DNA. Dette blev opnået ved at uddanne en beslutning-tree algoritme, der anvender forskellige funktionelle kopier af DNA input tværs 400 FFPE prøver med uafhængige målinger af sandhed, og indarbejde denne algoritme i bioinformatiske software. Som følge heraf er den anbefalede input på 400 amplificerbare kopier, typisk svarende til ~ 5-20 ng FFPE DNA, sammenligner positivt til andre metoder 10-12, herunder hybridisering-baserede berigelse hvor ~ 250 ng FFPE DNA anbefales 17,18 . Selvom teknik er beskrevet til brug på et MiSeq platform, kan det modificeres ved anvendelse af Tag PCR-primere med instrumentspecifikke adaptere for at muliggøre sekvensanalyse på andre NGS platforme.
Flere trin er afgørende for at sikre succesaf proceduren. Den præ-analytiske QC assay bestemmer amplificerbare kopital af DNA og rapporter funktionel inhibering. Hvis der imidlertid anvendes mindre end 400 amplificerbare DNA-kopier i PCR-berigelse trin, er der en øget risiko for et falsk-negative opkald fra prøver med lav tæthed mutationer (figur 6). Endvidere skal man være omhyggelig under biblioteket oprensning for at forhindre over-tørring af de magnetiske perler under vaske- eller elueringstrin. Endvidere vellykket bibliotek kvantificering er meget afhængig af den præcise fortynding af biblioteks-DNA'et. For det bedste resultat, er forskellen af qPCR resultaterne for prøven bibliotek (Cq FAM) sammenlignet med LQ Standard (Cq VIC) være ≤3.3 Cq. Hvis forskellen er større end 3,3 Cq, re-fortynding og afprøvning af prøven anbefales. Selv om der er observeret en fremragende korrelation mellem dette konkurrenceprægede qPCR metode og kommercielle kits, der tilbyder absolut kvantificering ved hjælp af en standardkurve, En forskydning af biblioteket input til den klonale amplifikationstrin i forhold til andre metoder kan være nødvendige for at opnå optimal udsåningstæthed.
Nogle kræft prøver er særligt udfordrende at sekventere grund af inhibitorer, der fortsat efter DNA isolation. For at identificere disse prøver forud for biblioteket forberedelse, qPCR QC-analysen registrerer også hæmmer forstærkningen herunder en eksogen skabelon, der fungerer som både en intern kontrol og en skildvagt for funktionel hæmning. Et eksempel er vist i figur 3, hvor en melanom DNA-prøve bestået den QC inhibering metriske inden sekventering og derefter undladt at generere et bibliotek, der kunne sekventeres. Den manglende var sandsynligvis en konsekvens af melanin forurening, en kendt PCR-inhibitor, fremført fra FFPE DNA isolation trin. Prøver, der er identificeret af QC-analysen at være i fare for forstærkning fiasko kan reddes gennem en ekstra oprydning trin to fjerne potentielle inhibitorer.
Den målrettede 21-gen panel fokuserer på evidensbaserede gen hotspots og giver et komplet system med optimerede reagenser og kontroller for DNA QC, NGS og bioinformatik software, der er informeret af præ-analytiske "funktionelle" DNA kvantificering resultater. Fremgangsmåden nøjagtigt detekterer basis-substitutionsmutationer og indels fra lav-input DNA og giver et eksempel på et NGS-system med mulighed for at udvide panelet indhold, for at opdage yderligere varianter, såsom CNVs og tilpasses til målrettet RNA-sekventering.
Disclosures
JH, AH, RZ, BCH, og GJL er medarbejdere og har kapitalandele i Asuragen, Inc. RZ, BCH, og GJL er co-opfindere på en patentansøgning for at forbedre variant telefonerer via amplificerbar kopi nummer oplysninger bestemt for hver prøve.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Annette Schlageter for gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud CP120017 fra forebyggelse Cancer og Research Institute of Texas (PI: GJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer/Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
- Medicines in Development for Cancer. , Available from: http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf 1-103 (2014).
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77 (2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710 (2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
