Abstract
Alla nästa generations sekvensering (NGS) förfaranden inkluderar analyser utförda på laboratoriebänken ( "våt bänk") och dataanalyser genomförs med hjälp av bioinformatik rörledningar ( "torr bänk"). Båda delarna är nödvändig för att producera exakta och tillförlitliga resultat, som är särskilt kritisk för kliniska laboratorier. Riktade NGS teknik har alltmer funnit nåd för onkologiapplikationer för att hjälpa förväg mål precision medicin, men de metoder som ofta involverar bortkopplad och rörlig våt- och torrbänkarbetsflöden och okoordinerade reagensuppsättningar. I denna rapport beskriver vi en metod för sekvense utmana cancerprover med en 21-gen panel som ett exempel på en samlad målinriktad NGS systemet. Systemet integrerar funktionella DNA kvantifiering och kvalificering, single-röret multiplex PCR anrikning, och bibliotek rening och normalisering med hjälp av analytiskt verifierade, single-source-reagens med en fristående bioinformatik svit.Som ett resultat, samtal korrekt varianten från låg kvalitet och låg kvantitet formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) och fin-needle aspiration (FNA) tumörbiopsier kan uppnås. Metoden kan rutinmässigt bedöma cancerassocierade varianter från en ingång 400 amplifierbara DNA-kopior, och är modulärt uppbyggt för att rymma nya genen innehåll. Två olika typer av analytiskt definierade kontroller ger kvalitetssäkring samt skydda samtals noggrannhet med kliniskt relevanta prover. En flexibel "tag" PCR-steget bäddar plattformsspecifika adaptrar och indexkoder för att tillåta prov barcoding och kompatibilitet med gemensam stationär NGS instrument. Viktigt är protokollet strömlinjeformad och kan producera 24 sekvens redo bibliotek på en enda dag. Slutligen förbinder strategi vått och torrt bänk processer genom att införliva pre-analytiskt prov kvalitetsresultat kontroll direkt i varianten ringer algoritmer för att förbättra mutation noggrannhet upptäcka och särskilja falskt negativa och indetermmedfödd samtal. Detta riktade NGS metod använder framsteg inom både wetware och mjukvara för att uppnå hög djup, multiplex sekvensering och känslig analys av heterogena cancerprover för diagnostiska tillämpningar.
Introduction
Precision medicin bygger på individualisering av diagnostiska och terapeutiska alternativ för patienter. Löftet om skräddarsydda behandlingar är en direkt följd av en bättre förståelse av vägar sjukdomstillstånd som kan informera kopplingen mellan molekylär diagnostik och målsökande behandling. Till exempel användning av molekylärt inriktade terapier ökade från 11% till 46% från 2003 till 2013 1 och anti-cancerläkemedel sådana som vemurafenib och crizotinib är FDA-godkänt med följeslagare diagnostiska tester. Med sin förmåga att korrekt återhämta låg överflöd sekvens mål över mycket multiplexerade provuppsättningar, har nästa generations sekvensering (NGS) dykt upp som en metod för val för att utvärdera genetiska avvikelser i samband med cancer och identifiering av molekylära mål för precisions medicin.
De vanligaste solida tumörbiopsier för molekylär testning inkluderar formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) och fin nål aspiration (FNA) specimILE. Dessa prover är fylld med låg mängd och / eller låg kvalitet nukleinsyror som utmanar korrekt NGS bedömningar 2-5. Nuvarande kommersiella NGS metoder för analys av dessa prover är baserade på ett lapptäcke av olika reagenser, protokoll och dataverktyg som representerar rörliga mål av ständiga förbättringar. Till exempel förändringar i analyskemi och / eller programvara inträffade var 1-2 månader för de mest allmänt använda riktade NGS kit 6. Denna instabilitet återspeglar en brist på samstämmighet i att konstruera och verifiera ett enat NGS-system för krävande provtyper, i synnerhet för cancertestning, och sätter en orimlig börda på laboratorier för att utveckla sammanhängande protokoll som är optimerade från prov till resultat. Faktum är att en färsk undersökning av NGS användare betonade svårigheterna med dessa "snabbt föränderliga" teknik, tillsammans med kraven för etablerade, medicinskt angripbara innehåll, förankrade bioinformatik expertis, en solidifiEd och integrerat förfarande som kan genomföras snabbt och strömlinjeformade arbetsflöden och förenklade protokoll som underlättar on-the-job training 7. I den här artikeln, är ett omfattande system för riktade NGS beskrivs som tar dessa luckor.
Den presenterade metoden integrerar alla processuella åtgärder från pre-analytiska till post-analytisk både våta och torra bänkar att förbättra noggrannheten, känslighet och tillförlitlighet mål kvantifiering och detektion av NGS av kliniskt relevant cancer genloci. Detta tillvägagångssätt börjar med kvantifiering av "funktionell" DNA 4 för att utvärdera DNA-kvalitet, guide matas in i PCR-anrikningssteg, och skydda mot falskt positiva samtal som kan uppstå vid förhör av mycket låga templatkopior. En enda rör multiplex PCR berikar sedan för 46 loci i 21 cancergener med enbart 400 amplifierbara DNA-kopior, följt av inkorporering av plattformsspecifika sekvenser för NGS using vanliga skrivbordssekvenseringsinstrument. Bibliotek renas med hjälp av en enkel magnetisk pärla förfarande och kvantifieras med en roman, kalibrering fritt qPCR analys. En fristående bioinformatik svit, informerades prov DNA QC resultat för att förbättra samtals prestanda, ger sekvensanalys efter NGS. Vi presenterar data med hjälp av detta system strategi för riktad NGS att avslöja bas-substitutionsmutationer, inför / deletioner (InDels), och antalet exemplar varianter (CNVs) i låg kvalitet och låg mängd tumörbiopsier såsom FFPE och FNA prover och kör kontroller.
Protocol
Obs: Detta protokoll beskriver samtidig bearbetning av prover med en MiSeq NGS System men kan anpassas för personliga Genome Machine (PGM) instrument. För den rekommenderade minimi DNA ingång 400 amplifierbara mallkopior, är analysen kan producera minst 3,000x median täckning för vart och ett av 96 prover per NGS springa, och täckning djup motsvarande för 24 prover med hjälp av PGM på en 318 chip. Metoden kräver även användning av en realtids-PCR-instrument.
1. DNA Funktionell Kvantifiering och kvalitetskontroll (QC)
- Tina reagens: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Inhibition Primer Probe Mix, 6-karboxi-X-rodamin (ROX), utspädningsmedel, och de fyra humana genom DNA kalibreringskurva standarder (DNA Standard (50 ng / l), DNA Standard (10 ng / | il), DNA-Standard (2 ng / | il), och DNA-Standard (0,4 ng / | j, l)) (tabell 1). Vortex alla reagens för 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sekunder för att samla innehållet.Håll 2x Master Mix på is.
- Förbered en tillräcklig mängd av Master Mix för det totala antalet prover som skall testas och inkluderar 10% mer volym för att undvika brist på grund av pipettering. Förbered Master Mix i ett mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per prov: 5 pl 2x Master Mix, 0,5 l Primer Probe Mix, 0,5 l Hämning Primer Probe Mix, 0,05 l ROX och 2,95 l spädningsmedel. Vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sekunder för att samla innehållet.
- Lägga 9 ^ il huvudblandning i brunnar i en 96-brunnars platta.
- Tillsätt 1 pl av DNA-standarder i duplikat för att generera en kalibreringskurva. Blanda genom att pipettera upp och ner 5 gånger.
- Säkerställa nukleinsyraprovet är väl blandad före användning. Lägg 1 pl prov till Master Mix och blanda genom att pipettera upp och ner 5 gånger.
- Förslut plattan, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sek för att samla in innehållet.
- Placera plattan i PCR System. Tilldela både FAM (funktionell kvantifiering) och VIC (funktionell hämning) detektorer för varje prov enligt tillverkarens anvisningar. Utföra PCR-cykler av 10 min vid 95 ° C och 40 cykler (15 sek vid 95 ° C, 1 min vid 60 ° C).
- Analysera qPCR data genom att generera en linjär regression tomt för var och en av de dubbla DNA-standarder med hjälp av programvara protokoll.
- Plottar Log 10 av antalet kopior för varje DNA-standard på x-axeln och motsvarande FAM C q värde på y-axeln.
- Bekräfta att resultaten från nukleinsyraprovet faller inom det dynamiska området för DNA-standarder kalibreringskurvan, och sedan beräkna koncentrationen av det okända DNA: t i "funktionell" eller amplifierbar kopietal per | il från dess motsvarande position på referensstandard kurvan. Figur 1 visar exempel på kalibreringskurvor som godkänd och underkänd. </ Li>
- Bestämma om amplifiering har inträffat i varje reaktion genom att kontrollera med avseende på närvaro av den icke-humana target amplicon i VIC-kanalen.
Obs: Som en positiv kontroll, hämning Primer Probe Mix innehåller primers specifika för en icke-human exogena mål och motsvarande mall. Hämningen Primer Probe Mix är en del av Master Mix som tillsätts till varje reaktion, inklusive ingen mall kontroll (NTC). I frånvaro av en inhibitor, bör PCR-produkten för den icke-humana målet alltid detekteras i VIC-kanalen. En "oupptäckt" C q för ett prov i VIC-kanalen indikerar närvaron av PCR-inhibitorer som kan dra nytta av efterföljande sanering av provet före vidare bearbetning.
2. Bibliotek Förberedelser: genspecifika (GS) PCR
- Förbered en tillräcklig mängd av Master Mix för det totala antalet prov som ska testas och innehåller 10% mer volym för att undvika brist på grund av pipettIng. Förbered GS PCR Master Mix i ett mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per prov: 5 pl 2x Amplification Master Mix (tabell 1) och 1 pl Pan Cancer Primer Panel (tabell 1). Blanda genom att pipettera upp och ner, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sek för att samla in innehållet.
- Alikvotera 6 pl GS PCR Master Mix i brunnar i en 96-brunnars platta. Tillsätt 4 | il av varje nukleinsyraprov i enskilda brunnar. Till andra brunnar, tillsätt 4 pl av FFPE kontroll (tabell 1), 4 pl av Multi-Variant kontroll (tabell 1) och 4 pl nukleasfritt vatten för en ordnings NTC. För varje tillsats, blanda genom att pipettera upp och ner 5 gånger.
- Förslut plattan, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sek för att samla in innehållet.
- Placera plattan i termocykler för följande PCR-cykler: 5 min vid 95 ° C,2 cykler (15 sek vid 95 ° C, 4 min vid 60 ° C), 23 cykler (15 sek vid 95 ° C, 4 min vid 72 ° C), och en slutlig förlängning av 10 min vid 72 ° C. Håll vid 4 ° C.
Notera: Efter fullbordan av steg 2,4, kommer plattan att hänvisas till som den GS PCR-platta.
3. Library Förberedelser: Tag PCR
- Tina reagens: 2x index Master Mix (tabell 1) och Index koder (tabell 1). Vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sekunder för att samla innehållet.
Obs: Index koder förblandas för att ge en unik uppsättning parvisa index (streckkoder) för varje prov. - I en 96-brunnar, tillsätt 7,5 pl av 2x index Master Mix och 5,5 pl av en index kod till en specificerad väl och blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger.
- Öppna försiktigt GS PCR-platta, och tillsätt 2 mikroliter GS PCR-produkten till den nya plattan med Master Mix. Blanda genom att pipettera upp och ner 5 gånger. För varje prov registrera prov-ID och motsvarande parvisa Index koder. Förslut plattan, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sek för att samla in innehållet.
- Placera plattan i termocykler och PCR under 5 minuter vid 95 ° C, 10 cykler (den 30 sek vid 95 ° C, 30 sek vid 55 ° C, 1 min vid 72 ° C), och en slutlig förlängning av 10 min vid 72 ° C. Håll vid 4 ° C.
Obs: Efter fullbordan av steg 3,4, kommer plattan att hänvisas till som den Tag PCR plattan.
4. Bibliotek Rening och storlek Urval
- Avlägsna de Bibliotek Ren Prep magnetiska pärlor (tabell 1) och elueringsbuffert (Tabell 1) 2-8 ° C och låt jämvikt till RT i 30 min. Lägga 9,6 ml 100% etanol till tvättbuffert (tabell 1) behållare, lock och blanda genom att vända flaskan flera gånger.
- Vortex de magnetiska pärlor för 10 sek och lägga 11 l i separata brunnar i en 96-brunnar.
- Öppna Tag PCR-platta och tillsätt 10 pl Tag PCR-produkt till pärlor och pipet mix 5 gånger. Inkubera blandningen under 4 minuter vid RT.
- Placera 96-brunnar på den magnetiska stativ (tabell 1) under 4 min. Med 96-brunnar fortfarande på stativet, ta bort och kasta supernatanten med en pipett.
- Avlägsna 96-brunnar från magnetiskt stativ och tillsätt 100 pl etanolinnehållande tvättbuffert i varje brunn och blanda genom att pipettera upp och ner 5 gånger. Inkubera under 2 min.
- Placera 96-brunnar på den magnetiska står för 2 minuter, ta sedan bort och kassera supernatanten med en pipett.
- Upprepa steg 4,5, för totalt 2 etanol tvättar, ta bort så mycket tvättlösning möjligt efter den andra tvättningen.
- Med 96-brunnar på den magnetiska monter, torka pärlorna i 2 min vid RT, ta bort plattan från stativet.
- Resuspendera kulorna genom tillsats av 20 pl elueringsbuffert till varje well och pipett upp-och-ned 5 gånger.
- Inkubera under 2 min vid rumstemperatur.
- Placera 96-brunnar tillbaka på den magnetiska stativ för 4 min och försiktigt bort och överföra 18 | il av den klara supernatanten till en ny brunn.
Notera: Proceduren kan säkert stoppas i detta steg och prover förvaras vid -15 till -30 ° C. För att starta om, tina frusna prover på is innan du fortsätter.
5. Bibliotek Kvantifiering
- Tina Library Quant (LQ) reagens: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standard, LQ positiv kontroll, LQ Diluent, och LQ ROX (tabell 1). Vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sekunder för att samla innehållet.
- Använda renade biblioteks produkter, utföra en serieutspädning av varje enskilt prov i LQ Diluent.
- Tillsätt 2 l (bibliotek renad produkt) till 198 pl LQ Diluent och blanda upp-och-ner med en pipett 10 gånger.
- Tillsätt 2 | j, l (1: 100 utspädning) till en98 pl LQ Diluent och blanda upp-och-ner med en pipett 10 gånger.
- Förbered en tillräcklig mängd LQ Master Mix för det totala antalet prover som skall testas och inkluderar 10% mer volym för att undvika brist på grund av pipettering. Förbered LQ Master Mix i ett mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per prov: 5 pl 2X LQ Master Mix, 2 pl LQ Primer / Probe Mix, 0,5 l LQ Standard och 0,5 l LQ ROX. Blanda genom att pipettera upp och ner, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sek för att samla in innehållet.
- Lägg 8 pl LQ Master Mix till en brunn av en optisk 96-brunnar.
- I separata brunnar, tillsätt 2 pl utspädd bibliotek, 2 pl LQ positiv kontroll och två il LQ spädningsmedel (NTC) och blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger. Förslut plattan med optisk limfilm, vortex i 10 sekunder och centrifugera vid 400 xg under 10 sek för att samla in innehållet.
- Tilldela både FAM och VIC Detectors för varje prov. Utföra PCR-amplifiering med användning av cykelbetingelser av 5 min vid 95 ° C och 40 cykler (15 sek vid 95 ° C, 1 min vid 60 ° C).
- Bestämma koncentrationen i varje prov (nM) med användning av den jämförande C q-metoden. Beräkna skillnaden av de kända LQ Standard (C q VIC) till den okända biblioteket (C q FAM). Koncentrationen av det utspädda provet (pM) beräknas med användning av följande ekvation:
[Konc lib] nM = 12,5 x 2 Δ Cq
Vid användning av en spädningsfaktor än 10.000, beräkna förhållandet mellan mål-spädningsfaktor som 10.000, och multiplicera denna faktor genom resultatet av ekvationen i 5,7.
6. Bibliotek Normalisering och prov Pooling
- Bestäm median koncentration (nM) i alla prover (som vardera innehåller en unik parvis index) som skall läggas samman.
- Fastställa den individuella prov volume (l) till pool genom att multiplicera mediankoncentrationen i alla prover med 5, sedan dividera med dess individuella koncentration (nM). Runda det resulterande värdet till närmaste heltal. Runda volymer med värden på <2 ^ till 2 pl och volymer> 15 mikroliter till 15 pl.
- Lägga den normaliserade volym (il) för varje prov till en enda mikrocentrifugrör att skapa provpoolen.
- Beräkna den nya koncentrationen för varje prov med hjälp av rundade heltalsvärden och notera resultaten.
- För att bestämma koncentrationen av provpoolen, beräkna summan av alla koncentrationer och registrera det resulterande värdet (nM).
- Späd provet poolen till 1,25 nM med hjälp av sekvensering Diluent (tabell 1).
Notera: Proceduren kan säkert stoppas i detta steg och prover förvaras vid -15 till -30 ° C. För att starta om, tina frusna prover på is innan du fortsätter.
7. Sekvensering
- denature prov poolen i närvaro av PhiX kontroll v3 (tabell 1) genom att lägga till följande: 15 ul av 1,25 nM prov Pool, 3 pl 0,5 nM PhiX och 2 pl av en N NaOH. Vortex följt kortvarigt av en kort centrifugering och inkubera under 5 min vid RT.
- Placera den denaturerade provet poolen på is.
- Tillsätt 8 il denaturerad bibliotek till 992 pl av pre-kyld HT1-Hyb buffert till ett mikrocentrifugrör. kort vortex för att blanda, följt av en kort centrifugering för att samla in innehållet. Håll på is.
- Lägg 600 ul av den denaturerade och utspädd bibliotek för att placera # 17 av reagenspatronen.
- Tina Läs 1 sekvenseringsprimrar (tabell 1), Index Läs sekvenseringsprimrama (tabell 1) och läs 2 sekvenseringsprimrar (tabell 1). I mikrocentrifugrör, separat späda 4 il sekvenseringsprimrar med 636 pl HT1-Hyb buffert. Obs: HT1-Hyb buffert tillhandahålls with sekvensereagenssats (tabell 1).
- Blanda genom att vortexa i 10 sek och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sek för att samla in innehållet. Lägg 600 pl utspätt Läs 1 sekvenseringsprimrar att positionera # 18 av sekvensreagenspatronen till 600 pl utspätt Index Läs Primers placera # 19, och 600 pl utspätt Läs 2 sekvenseringsprimrar att positionera # 20.
- Ladda reagenserna på NGS instrument (tabell 1) och sekvens enligt tillverkarens anvisningar. Utför en parade slut 2 x 150 cykelsekvenseringskörning.
8. Dataanalys
Obs! NGS instrumentets programvara konverterar kluster bilder att basera samtal och kvalitetsresultat, och demultiplexerar parvisa index för att generera enskilda gzip-komprimerad FASTQ (* .fastq.gz) filer för varje prov. Före analys av demultiplexerade filer måste läsaren hämta och installera tillhörande programvara för bioinformatik (Tabell1). Programvaran kan installeras på en konsument-grade Windows PC och inte kräver specialiserad datorhårdvara eller en Internet-anslutning för att utföra dataanalys.
- Dubbelklicka på ikonen programvara skrivbordet.
- Logga in i systemet med hjälp av användarnamn och lösenord som i programvaran manuellt.
- Öppna projektet instrumentpanelen och klicka på "New Project".
- Namnge projektet och ger en valfri projektbeskrivning. Välj den riktade NGS paneltyp och NGS typ av instrument. Klicka på "Spara och fortsätt".
- Ladda upp komprimerade FASTQ filer för framåt och bakåt läser. Inte ladda upp "otilldelade" FASTQs, som innehåller läser som misslyckades att demultiplexera. Klicka på "Spara och fortsätt".
- Mata in antalet funktionella ingångs exemplar som används för att framställa varje bibliotek som bestäms av DNA funktionella kvantifiering analys (se steg 1 ovan). Manuellt lägga till värden eller kopiera och klistra värden från en spridningarket i annoteringen tabellen. Klicka på "Spara och fortsätt".
- Granska kommenterade bibliotek uppladdade för analys och klicka på "Skicka analys" för att initiera analysen.
- Övervaka framskridandet av analysen visas genom projektet instrumentbräda.
Obs: En analys komplett statusindikering presenteras när resultaten är redo för granskning. - Granska de analyserade resultaten för prov QC statistik inklusive total täckning per bibliotek, andelen läser passerar filter, amplikon täckning djup och enhetlighet. Granska varianten kräver varje sekvens bibliotek med dbSNP, COSMIC, 1000 genom och andra källor till funktionell och populationsnivå anteckning.
- Exportera rå resultat som sammanfattande kalkylblad tabeller, * .bam filer och * .vcf-filer för långtidslagring eller nedströms analys med kompletterande informatikverktyg.
Representative Results
Sammanlagt 90 prover (74 unika) representerar positiva och negativa kontroller, tidigare karakteriserade cellinjer, och kvarvarande kliniska FFPE tumörbiopsier bedömdes för amplifierbar DNA, matas in multiplex PCR anrikning, märkt med sekvens adaptrar, streckkods och analyserades i en enda bänk NGS instrument run (Figur 2) som gav 19,1 M läser passerar filtret. Ekvimolär prov pooling resulterade i hög djup sekvensering (3,692x läser) och jämn täckning (97,8% av amplikoner som omfattas inom fem gånger av median läs djup). Outliers bestod no-mall kontroller, en cell-linje DNA med ett stort antal kopior förstärkning, och ett FFPE DNA som flaggades för PCR hämning av pre-analytiska QC analys (Figur 3). Täckning enhetlighet över 46 amplikoner bibehölls med hjälp av tre olika operatörer (Figur 4A), och för olika låg kvalitet FFPE DNA-prover (
Känsligheten och positiva prediktiva värdet för analysen bestämdes från en analys av 97 prover, inklusive FFPE, FNA, färskfryst och cellinje-DNA, och totalt 195 sekvense resultat. Resultaten visade 365 sant positiva variant samtal, 4 falska negativa samtal, och ett falskt positivt samtal för en känslighet på 98,9% (95% CI: 97,1-99,7%) och ett positivt prediktivt värde (PPV) av 99,7% (95% CI : 98,2-99,99%). Analyser av InDels utfördes för två vanliga EGFR-varianter (p.E746_A750delELREA och p.V769_D770insASV) i 33 provkörningar, visar en känslighet på 93,9% (95% CI: 78,4-98,9%) och en PPV av 100% (95% CI: 86,3-100%) med varianter detekteras över ett område av 2,4-84,8%.
Figur 1: Ett exempel på DNA Kvantifiering kalibreringskurvor som godkänd och underkänd QC kriterier (A) En passerande standardkurva.. (B) En misslyckas standardkurva. I detta fall var det fel som orsakas av duplikat pipettering av de lägsta ingångs DNA standard. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt över en samlad målinriktad NGS System för Oncology Program som integrerar Pre-analytiskaal, Analytical och Post-analytiska arbetsflöden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Läs täckning och likformighet för riktade NGS av cancergener i låg kvalitet FFPE DNA Jämfört med intakt cell-line DNA och kontroller Totalt 90 prover som ingår resterande kliniska FFPE (fyllda cirklar), cell-linje (öppna cirklar. ), och syntetiska templat-DNA (plus symboler) bearbetades med användning av enkelrörs, 21-genen multiplex PCR anrikning. Varje amplikon biblioteket taggade med adaptersekvenser för NGS instrument, streckkods med en distinkt dubbla indexkoden, renat, kvantifieras och normaliserades till en koncentration av 2,5 nM. DNA-biblioteket sekvenserades och analyserades med den följeslagare programvara för bioinformatik. Exempel devisamheten ingår en utspädningsserie av MDA-MB-468-cell-linje DNA som bär ett stort EGFR kopietal förstärkning (topp, öppna rektanglar inom streckad cirkel) som förvrängda täckning enhetlighet och en melanom FFPE prov som misslyckades med att generera ett avsevärt antal läser på grund till överföring av PCR-inhibitorer från DNA-extraktion. melanom prov misslyckande (botten, streckad cirkel) förutsågs av pre-analytiska qPCR DNA QC analys. NTC, ingen mall kontroll (x symboler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Amplicon-by-amplikon Läs Täckning, Enhetlighet och Variant Detection i resterande Clinical FFPE tumör-DNA. (A) Läs täckning i alla anrikat loci i ett representativt FFPE DNA-prov mättöver tre olika operatörer. Operatör 1, Op1 (blå staplar); Operatör 2, Op2 (gröna staplar); Operatören 3, OP3 (svarta staplar). (B) Täckning enhetlighet och variant samtal utvärderades med hjälp av tre FFPE tumörprover, inklusive en kontrollblandning (FFPE3, grå staplar och text) består av en känd 5% BRAF c.1799T> En mutation. FFPE1 (blå staplar och text), FFPE2 (orange barer och text). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Dosberoende detektion av Copy Number Variants i Cell-linje och FFPE DNA MDA-MB-468-cell-linje DNA med en väldefinierad EGFR antal kopior förstärkning progressivt utspädd i en bakgrund av en referens icke-muterad cell -line DNA för att illustrera den minskade kopietalet förändring som enfunktion av utspädningen. Den procentuella andelen av varje cell-linje DNA-prov visas med en distinkt linje (0, 12,5, 25, 50, och 100%). Utspädning av en äggstocks FFPE tumörprov med en känd KRAS förstärkning visade en liknande profil med samma titrering serie men med replikat av 100% FFPE DNA för de två översta raderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Accurate Mutation detektion och kvantifiering till 50 amplifierbar FFPE DNA-kopior, eller 1,2 ng Bulk DNA Den amplifierbara kopietalet av en tjocktarmscancer FFPE DNA bestämdes genom qPCR-baserade QC-analysen, och späddes från 400 till 25 kopior som en. bidrag till multiplex PCR anrikning före sekvensering. Den bioinformatik pipeline korrekt kallas både av den kända Variants ner till 50 kopior, eller motsvarande ~ 10 muterade mallar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn på Material / Material | Företag | Katalognummer |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 |
| Inhibering Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 |
| ROX | Asuragen | 145346 |
| spädningsmedel | Asuragen | 145339 |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 |
| DNA Standard (0,4) | Asuragen | 145343 |
| 2x Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 |
| Pan cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 |
| Pan cancer FFPE Kontroll | Asuragen | 145349 |
| Pan Cancer Multi-Variant kontroll | Asuragen | 145350 |
| Biblioteket Rena Prep Pärlor | Asuragen | 145351 |
| tvätt~~POS=TRUNC buffert~~POS=HEADCOMP | Asuragen | 145352 |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 |
| 2x LQ Master Mix | Asuragen | 145358 |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 |
| LQ PositivKontrollera | Asuragen | 145355 |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 |
| Index koder (ILMN) - Set A | Asuragen | 150004 |
| AIL001 - AIL048 (48) | ||
| Index koder (ILMN) - Set B | Asuragen | 150005 |
| AIL049 - AIL096 (48) | ||
| 2x index Master Mix | Asuragen | 145361 |
| Läs 1 sekvenseringsprimers | Asuragen | 150001 |
| Index Läs sekvenseringsprimrar | Asuragen | 150002 |
| Läs 2 sekvenseringsprimers | Asuragen | 150003 |
| sekvense Diluent | Asuragen | 145365 |
| Illumina MiSeq | Illumina | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cykel) | Illumina | MS-102-3003 |
| MiSeq Reagens Nano Kit v2 (300-cykel) | Illumina | MS-103-1001 |
| PhiX Kontroll v3 | Illumina | FC-110-3001 |
| Magnetisk Stand-96 (eller likvärdig anordning) | Ambion | AM10027 |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
Tabell 1:. Reagens och Kits Vid första användning av ROX, lagra flaskan vid 2-8 ° C. Frys inte in. Programvaran kan laddas ner på www.asuragen.com.
| Gene | COSMIC variant | COSMIC aminosyra | % Variant |
| NRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13,3 |
| NRAS | c.35G> A | p.G12D | 15,2 |
| HRAs | c.182A> G | p.Q61R | 17,8 |
| HRAs | c.35G> A | p.G12D | 9,2 |
| KRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13,5 |
| KRAS | c.35G> A | p.G12D | 19,1 |
| PIK3CA | c.1633G> A | p.E545K | 9,3 |
| PIK3CA | c.3140A> G | p.H1047R | 9,1 |
| UTRUSTNING | c.2447A> T | p.D816V | 14,6 | EGFR | c.2369C> T | p.T790M | 11,3 |
| EGFR | c.2573T> G | p.L858R | 14,9 |
| BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 17,3 |
Tabell 2: En sammanslagen Syntetisk Kontroll består av 12 "Driver" Cancer genvarianter som kvantifieras på 9-17% Överflöd En blandning av 12 olika dubbelsträngade syntetiska mallar som bär 12 olika mutationer utvärderades efter sekvensering.. Alla varianter var korrekt kallas utan falsklarm.
| prov ID | Funktionell cps | Gen | COSMIC variant | COSMIC aminosyra | Medianläsa djup | % Inom 5x av median | |
| BCPAP | 400 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,5 | 3289 | 96% |
| BCPAP | 10000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,7 | 4040 | 98% |
| BCPAP | 25000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,4 | 3687 | 96% |
| BCPAP | 50000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99,7 | 4611 | 93% |
Tabell 3: Täckning och Variant Calling bevaras Under en> 100-faldig Område DNA ingång.
Tabell 4: Variant samtal i 22 FFPE och 20 FNA tumörbiopsier Håller med resultat från oberoende mutationsanalyser En uppsättning av 22 FFPE tumör DNA med mutation status som tidigare bestämts av ortogonala riktade NGS analyser matades in på 400 till 2928 amplifierbara kopior i PCR-anrikning. steg och sekvenserades med hjälp av 21-genen Pan cancer panel. Dessutom har en kohort av 20 FNA DNA-prover som tidigare karakteriserats med hjälp av en vätskepärla array mutationstest 8 PCR-amplifierades med användning av 156 till 36.080 ingångs amplifierbara kopior och sekvenserades. Alla överlappande samtal mellan Pan Cancer NGS panelen och REFERENCE metoder var överens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
NGS teknik har omdefinierat förväntningar förhöra de molekylära profiler tumörbiopsier i kliniska situationer 9. Ett antal riktade NGS paneler har utvecklats som forskningsteknik, laboratorie utvecklat tester och kommersiellt tillgängliga produkter och anpassade paneler för att bedöma flera olika typer av kliniska prover 3,5,10-15. Rapporter från flera studier har visat värdet av NGS som en känslig och specifik klinisk verktyg för detektion av genomiskt förändringar 3,10-12,14. Ändå studier har också visat att risken för artefakter som kan orsaka falskt positiva resultat från utmanande cancer biopsier såsom FFPE prover 2-5,12,14. Dessutom har de senaste publikationerna markerade höga felfrekvens för NGS använder onkologi prover 16 och falskt positiva samtal med kommersiella riktade NGS paneler som förvärras genom användningen av lågintensivt DNA 12. Som ett resultat, en del laboraTories har antingen ändrats eller lagts till ytterligare kontroller och avvägningar för att kommersiellt tillgängliga riktade NGS teknik för att förbättra prestanda, ofta för att säkerställa riktigheten eller bekräfta resultaten från bioinformatiska analyser 5,10,11.
21-genen panel (Figur 2) utvecklades som riktat innehåll för en omfattande NGS system för att förhöra evidensbaserade, genomförbara mutationer i utmanande provtyper såsom FFPE och FNA tumörbiopsier. Arbetsflödet har ett antal fördelar: 1) konsistens genom att tillhandahålla en enhetlig amplikon täckning (figurerna 3 och 4, tabell 3); 2) enkel att använda genom att tillhandahålla pre formulerade, optimerade reagensuppsättningar, och förenkla bioinformatik krav; 3) effektivitet genom att effektivisera arbetsflödet och minska antalet pipetteringssteg jämfört med andra kommersiella NGS metoder; och 4) noggrannhet genom att införliva en DNA QC analys för att bedöma amplifikan DNA-kopieantal för att säkerställa acceptabel mall mångfald och undvika stokastiska fluktuationer i variant upptäckt fyra. Integrationen av pre-analytiska QC data med bioinformatik analys möjliggör låga ingångar FFPE DNA. Detta uppnåddes genom att utbilda ett beslutsträd algoritm där olika funktionella kopior av DNA ingång över 400 FFPE prover med oberoende åtgärder av sanning, och införliva denna algoritm i bioinformatik programvara. Som ett resultat, den rekommenderade ingången på 400 amplifierbara kopior, typiskt motsvarande ~ 5-20 ng av FFPE-DNA, kan med fördel jämföras med andra metoder 10-12, inklusive hybridisering baserade anrikning där ~ 250 ng av FFPE DNA rekommenderas 17,18 . Även om den teknik beskrivs för användning på en MiSeq plattform kan den modifieras med användning av Tag PCR-primrar med instrumentspecifika adaptrar för att göra det möjligt för sekvensanalys på andra NGS plattformar.
Flera steg är avgörande för att säkerställa framgångav förfarandet. Pre-analytiska QC analys bestämmer amplifierbara kopietalet av DNA och rapporter funktionell hämning. Men om mindre än 400 amplifierbara DNA-kopior används i PCR anrikningssteg, finns det en ökad risk för falskt negativa samtal från prover med låg förekomst mutationer (Figur 6). Dessutom måste man vara försiktig vid biblioteket rening för att förhindra övertorkning av de magnetiska pärlorna under tvätt- eller elueringssteg. Vidare är framgångsrik bibliotek kvantifiering starkt beroende av den exakta utspädningen av biblioteks-DNA. För bästa resultat, skillnaden mellan qPCR resultat för provet biblioteket (Cq FAM) jämfört med LQ Standard (Cq VIC) bör vara ≤3.3 Cq. Om skillnaden är större än 3,3 Cq, re-spädning och testning av provet rekommenderas. Även en utmärkt korrelation har observerats mellan denna konkurrens qPCR metod och kommersiella kit som erbjuder absolut kvantifiering med hjälp av en standardkurva, En förskjutning av biblioteket input i den klonala amplifieringssteget i förhållande till andra metoder kan vara nödvändiga för att uppnå optimal såddtäthet.
Vissa cancerprover är särskilt utmanande att sekvensera grund av hämmare som kvarstår efter DNA-isolering. För att identifiera dessa prover innan biblioteket förberedelse, qPCR QC analys detekterar även förstärkning hämning genom att inkludera en exogen mall som fungerar som både en intern kontroll och en sentinel för funktionell hämning. Ett exempel visas i fig 3, i vilken en melanom-DNA-prov inte klarar de QC inhibering metriska före sekvensering och sedan misslyckats med att generera ett bibliotek som skulle kunna sekvenseras. Misslyckandet var sannolikt en följd av melanin kontamination, en känd PCR-hämmare, som överförts från FFPE DNA isoleringssteget. Prover som identifieras av QC analys för att vara i riskzonen för förstärkning fel kan räddas genom en extra sanering steg to ta bort potentiella inhibitorer.
Den riktade 21-genen panel fokuserar på evidensbaserade gen hotspots och tillhandahåller ett komplett system med optimerade reagenser och kontroller för DNA QC, NGS och bioinformatik mjukvara som informeras av pre-analytiska "funktionella" DNA kvantifiering resultat. Metoden identifierar exakt bas-substitutionsmutationer och InDels från lågintensivt DNA, och ger ett exempel på ett NGS-system med möjlighet att utöka innehåll panelen för att upptäcka ytterligare varianter som CNVs och anpassas för riktad RNA-sekvensering.
Disclosures
JH, AH, RZ, BCH och GJL är anställda och har aktieinnehav i Asuragen, Inc. RZ, BCH och GJL är co-uppfinnare på en patentansökan för att förbättra variant ringa med amplifierbar kopietal uppgifter bestämdes för varje prov.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Annette Schlageter för granskning av manuskriptet. Detta arbete stöddes delvis av bidrag CP120017 från Cancer Prevention och Forskningsinstitut Texas (PI: GJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer/Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
- Medicines in Development for Cancer. , Available from: http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf 1-103 (2014).
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77 (2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710 (2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
