Abstract
Le virus grippal A (IAV) hémagglutinines reconnaissent les acides sialique sur la surface de la cellule en tant que récepteurs fonctionnels pour pénétrer dans les cellules. Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV peut traverser la barrière des espèces pour la volaille, les porcs, les chevaux et les humains. Les virus aviaires reconnaissent l'acide sialique attaché à un avant-dernier galactose par une liaison α2-3 (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains reconnaissent de préférence l'acide sialique avec une liaison α2-6 (récepteurs de type humain). Pour contrôler si les virus aviaires s'adaptent aux récepteurs de type humain, plusieurs méthodes peuvent être utilisées. microarrays Glycan avec diverses bibliothèques de sialosides synthétiques sont de plus en plus utilisés pour évaluer la spécificité du récepteur. Cependant, cette technique n'a pas été utilisée pour mesurer avidités. Mesure de l'avidité est généralement obtenue en évaluant la liaison de l'hémagglutinine ou un virus dilué en série à glycanes adsorbés polypropylène plaques à 96 puits classiques. Dans cet essai, avec α glycanes2-3 ou α2-6 acides sialiques sont couplés à la biotine et adsorbés sur des plaques de streptavidine ou sont couplées à polyacrylamide (PAA), qui adsorbe directement à la matière plastique. Nous avons considérablement miniaturisé cet essai en imprimant directement sialosides PAA liés et leurs homologues non PAA lié sur des lames de verre micro-puits. Ce set-up, avec 48 tableaux sur une seule diapositive, permet des dosages simultanés de 6 glycane protéines de liaison à 8 dilutions, interrogeant 6 glycanes différents, y compris deux témoins non sialylés. Ceci est équivalent à 18x plaques à 96 puits dans le dosage de plaque classique. Le format de tableau glycane diminue la consommation de composés et des produits biologiques et améliore l'efficacité ainsi grandement.
Introduction
Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV est capable de traverser la barrière des espèces pour la volaille et les mammifères, y compris les humains. IAV aviaire reconnaissent α2-3 acides sialiques liés (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains se lient α2-6 acides sialiques liés (récepteurs de type humain). Pour être en mesure de se répliquer efficacement et transmettre entre les humains un IAV aviaire a besoin de se lier à de type humain récepteurs 1.
IAVs sont divisés sur la base de tests sérologiques qui caractérise l'antigénicité de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), les glycoprotéines d'enveloppe. HA se lie aux acides sialiques, tandis que NA est l'enzyme détruisant le récepteur à l'autre extrémité du cycle de vie viral et clive l' acide sialique 2. Tous les virus infectant l' homme, y compris la grippe H1N1, H2N2 et H3N2, ont une origine aviaire 3. Au cours des deux décennies plusieurs aviaire aux croisements humains dernière ont eu lieu, avec le virus H5N1, H7N7 et H7N9 étant le plus connu; however, d' autres sous - types ont infecté des humains de façon plus sporadique (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heureusement, il semble qu'aucun de ces virus ont été en mesure d'adapter pleinement à l' acide sialique de type humain récepteurs α2-6 liés 5-8. Adaptation des virus zoonotiques aviaire ou d'autres pour accueillir la réplication et la transmission dans des hôtes humains pourraient avoir un effet dévastateur sur la santé humaine. Par conséquent, la connaissance préalable de la façon dont ces virus évoluent pour lier les récepteurs de type humain contribuera à la surveillance mondiale des virus émergents de la grippe.
Détermination de la préférence des récepteurs a été élucidée en utilisant érythrocytes d'espèces différentes et reste un essai privilégié entre les chercheurs de la grippe 9-12. La démonstration que les virus aviaires reconnaissent l'acide sialique α2-3 et virus humains α2-6 liés acide sialique a été basée sur un essai utilisant hémagglutination des érythrocytes enzymatiquement conçus pour contenir chacun des linkages 13,14. Bien que la lecture est hémagglutination, un essai standard pour virologues, les structures glycanniques sous-jacentes ne sont pas définies, seule la liaison terminal. En outre, la disponibilité limitée des sialyltransférases, utilisés pour re-sialyler les cellules, ont limité l'utilisation de ce test 15-18. Par la suite, d' autres méthodes permettant de déterminer les préférences de liaison au récepteur ont été introduites en utilisant des structures de glycanes sialylés liés à la poly-acrylamide (PAA) ou poly-glutamate (PGA) dans des analyses basées sur des structures en forme de plaque 19,20. Plusieurs variantes sont possibles dans le revêtement soit glycanes ou des virus dans des plaques de microtitrage, dont chacune résulte en un dosage de type ELISA robuste, fiable et très sensible 21-23. En variante, les glycanes liés à la biotine peuvent remplacer PAA / PGA et peuvent être conjugués à des plaques revêtues de streptavidine 2,24. Bien que certains sérums spécifiques peuvent être nécessaires, ELISA sont glycanes standard et plusieurs liés à l'AAP sont facilement commercially et non-disponibles dans le commerce (Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Technologies de microréseaux Glycan ont émergé comme un outil précieux pour déterminer la spécificité du récepteur, comme plusieurs glycanes différents sont repérés, et se lier à un large éventail de différentes structures peuvent être évaluées dans un seul essai 25-29. La liaison de l' IAV à ces structures fournit une meilleure compréhension des structures glycanniques que IAV reconnaît préférentiellement 30-33. microarrays Glycan nécessitent de petites quantités de volume d'échantillon pour effectuer une analyse de liaison et utilise uniquement des quantités infimes de glycane par point (2 nl). Cependant, ces réseaux sont généralement utilisés seulement pour évaluer la spécificité des glycanes récepteurs. L'analyse de plusieurs virus ou des protéines d'hémagglutinine, à différents intervalles de concentration peut être prohibitif en raison du nombre des lames nécessaires. En outre, à ce jour, aucun test relatif avidement a été développé en utilisant ar glycanedes techniques de rayons.
Pour combiner l'exigence de l'échantillon à faible offerte par les techniques de microréseaux glycanes et la sensibilité des glycanes de l'AAP liés dans des essais basés sur ELISA, nous avons cherché à développer une gamme glycanes multi-puits qui permettrait d'analyse à haut débit avec une résolution similaire ou mieux par rapport le dosage traditionnel à base d'ELISA. En même temps, nous voulions minimiser la quantité de produits biologiques et les produits chimiques rapporteurs consommés. Le résultat final est un test de avidement miniaturisé, spécialement développé pour la surveillance de la spécificité IAV et est également applicable pour évaluer d'autres protéines de liaison glycanes. L'utilisation d'une lame de verre séparé en 48 micro-puits par un masque de Teflon, 6 glycanes différents sont repérés en 6 répétitions par puits. La plate-forme de puces à ADN offrent les mêmes tendances dans la liaison au récepteur vu dans le format macro ELISA avec plusieurs avantages. Celles-ci comprennent (i) l'impression du composé en 6 réplicats, en utilisant un minimum de l'échantillon, par rapport au revêtement de plusieurs lignes iplaque na, en utilisant 100 pi par puits; (II) plusieurs composés différents analysés simultanément dans un seul puits, y compris les contrôles; (III) une diminution massive du volume d'incubation et; (IV) une plage dynamique plus large en utilisant un affichage fluorescent. Une seule diapositive peut être calculée comme équivalente à 18x plaques à 96 puits.
Avec le protocole suivant, tout laboratoire capable de fabriquer et d'analyse des microréseaux repérés devraient être capables de fabriquer ce format ELISA miniaturisé.
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Protocol
Remarque: Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Tableau de construction
- Glycan Préparation et installation de la plaque
- Préparer un stock de tampon d'impression. Faites d'abord 500 ml d'une solution 150 mM stock de phosphate de sodium dibasique. Assurez-vous également 50 ml d'une solution 150 mM stock de monobasique solution de phosphate de sodium. Dans un ballon, en utilisant une barre d'agitation magnétique et d'un pH-mètre, titrer lentement la solution dibasique de phosphate de sodium monobasique avec la solution jusqu'à ce qu'un pH de 8,5 soit atteint. Ajouter du Tween-20 à 0,005%.
- Préparer les échantillons glycanes. Diluer PAA glycanes conjugués, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-AAP) et 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (figure 1A )) doivent être dilués à 100 ug / ml dans un tampon d'impression à partir step1.1.1. glycanes monovalents,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) et 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) à 100 pM dans du tampon d'impression à l' étape 1.1.1. Enfin, préparer les colorants à fonction amine, à utiliser comme marqueurs de la grille / feux d'atterrissage. Dye taches de marquage sont imprimés à 1 uM.
NOTE: Atto488-NHS colorant est utilisé dans nos impressions. Cependant, tout colorant à fonction amine, pouvant être lu par le scanner de diapositives est approprié à cet effet. - Transfert de 10 ul de chaque échantillon de glycane à des plaques de microtitrage à 384 puits, utilisé pour le robot d'impression. Magasin glycanes inutilisés dans une solution tampon d'impression à -20 ° C dans des tubes scellés. Tansfer 10 ul du marqueur de colorant sur la plaque d'impression.
- Impression
NOTE: Toutes les steps qui concernent le toucher ou déplacer les diapositives doivent être effectuées avec des gants.- Placez Arrayer épingles dans la tête d'impression en fonction de la configuration correcte de la mise en page. Pour cette mise en page en utilisant une broche pour imprimer tous les échantillons et les tableaux. Imprimer les glycanes en blocs de six, en sautant une caractéristique (une caractéristique est définie comme point unique d'un certain composé), de chaque côté, de telle sorte que les taches du même échantillon ne sont pas imprimés exactement à côté de l'autre.
NOTE: L'utilisateur final doit décider de la configuration. - Retirer les lames des sacs, des boîtes ouvertes, et éliminer toutes les particules de poussière ou de petits morceaux de plastique qui pourraient être sur leurs surfaces en soufflant de l'azote gazeux ultra-pur sur chaque diapositive. Placez le nombre désiré de diapositives, côté enduite vers le haut, sur la scène arrayer.
- Programmer le arrayer, utilisez les paramètres de 27 points par visite à la plaque source, en utilisant 3 "pré-taches" sur des lames revêtues de poly-L-lysine, pour éliminer l'excès de liquide à la pointe des aiguilles d'impression
- Allumez MPU (unité d'alimentation principale) et l'unité de contrôle du climat. Ouvrez le logiciel d'analyse Carreleurs sur ordinateur.
- Sélectionnez la mise en page à l'impression. Sélectionnez Options → Outil Pin à utiliser pour l'impression de la matrice 1 x 1 outil d'impression - 1 seule broche. Sélectionnez l'onglet Cible → Outil Tableau Définition → Motif d'impression et d'ajouter de la hauteur (spot à spot à distance), le nombre de lignes et de colonnes pour accueillir les échantillons à imprimer, et le motif d'impression des échantillons (pour ce tableau 8 x 8 impression motif est utilisé à 340 pas de um pour 7 échantillons au total).
- Sélectionnez Target → Mise en page des diapositives et programmer la distance de bloc à bloc pour permettre l'impression de chaque tableau répliquée dans le 48 puits (4 x 12) modèle de diapositive. Sélectionnez Source et ajoutez le nombre de micros source (1 pour chaque échantillon lors de l'utilisation 1 broches) (pour cette impression 7 micros source sera utilisée pour accueillir 6 puits d'échantillon et 1 marqueur de colorant ainsi).
NOTE: Le dialogue source doit devenir vert pour montrer que le nombredes visites de source correspondent aux échantillons à imprimer dans le modèle d'impression. - Sélectionnez Target → Adapter Plate et Glisser la mise en page et d'ajuster le nombre de diapositives (5 diapositives sont imprimées à la fois pour cette impression avec 1 pré-détachage slide).
- Relâchez le plateau en cliquant sur le bouton T1 pour activer le plateau et ajouter le nombre souhaité de diapositives sur le plateau, en accordant une attention particulière aux endroits de la glissière pré-spotting (BLEU) et les diapositives «réelles».
- Placez les lames de verre lisses sur tous les ports de vide restant à bloquer le vide et cliquez sur OK pour activer le vide. Vérifiez que toutes les diapositives sont maintenus en place et cliquez sur OK pour revenir le plateau à la position de la maison.
- Chargez la plaque d'impression dans le support de plaque et assurer le rack est correctement réglé en place. Cliquez sur GO et permettre le processus d'impression de procéder.
- Imprimer les 24 places restantes dans les répétitions de 6 points par matrice (4 tableaux / visite de la source).
- Charger les plaques à 384 puitsdans l'imprimante et lancer l'impression. Maintenir l'humidité relative, pendant l'impression, tout au long de l'impression entre 55 et 65%. L'imprimante arrête après l'impression 5 diapositives.
NOTE: Bien que le microréseau dans cet essai a été imprimé en 8 x 8 modèle spécifique, différents robots d'impression de microréseau nécessiteront une programmation spécifique de l'équipement pour réaliser la mise en page souhaitée. Il appartient à l'utilisateur final afin de déterminer le modèle le plus approprié étant donné les caractéristiques de leurs équipements.
- Placez Arrayer épingles dans la tête d'impression en fonction de la configuration correcte de la mise en page. Pour cette mise en page en utilisant une broche pour imprimer tous les échantillons et les tableaux. Imprimer les glycanes en blocs de six, en sautant une caractéristique (une caractéristique est définie comme point unique d'un certain composé), de chaque côté, de telle sorte que les taches du même échantillon ne sont pas imprimés exactement à côté de l'autre.
- Humidification / Immobilisation
NOTE: Une fois que les diapositives ont terminé l'impression, ils subissent une étape d'immobilisation temporaire, appelée aussi humidifier. Humidification post-impression permet d'homogénéiser l'échantillon de fixation par re-mouillant les taches et en assurant un blocage complet.- Placer les lames dans une chambre d'humidité à 100% immédiatement après l'impression pendant une période de 30 min. Construire la chambre en plaçant des serviettes en papier très humides plat dans le fond d'un grand plat en verre, en plaçant les diapositivessur une sorte de rack, comme un porte-tube à essai, imprimer vers le haut, et d'étanchéité avec une pellicule de plastique pour piéger l'humidité.
- Nombre glisse avec un alcool / solvant résistant à la plume de marquage et de stocker dans une boîte de dessiccation. Dessécher durant la nuit.
- Numérotation, blocage, et stockage
- Préparer le tampon de blocage - éthanolamine 50 mM dans 50 mM de tampon borate. Tout d' abord, dissoudre l' acide borique, en ddH 2 O, à une concentration finale de 50 mM dans un flacon contenant un barreau d'agitation magnétique. Remuer vigoureusement la solution sur une plaque d'agitation jusqu'à ce que tout solide soit dissous. Tout en remuant constamment, ajouter la quantité appropriée d'éthanolamine à partir d'une solution 16,54 M d'actions pour atteindre la concentration désirée 50 mM. Ajouter de l'hydroxyde de sodium concentré pour ajuster à un pH final de 9,2.
- Immerger les lames imprimées dans la solution de tampon de blocage pendant 1 h.
- Après 1 h, rincer les lames dans ddH 2 O pour éliminer toute trace de tampon de blocage en excès.Eliminer le tampon de blocage dans un conteneur à déchets approprié.
- Transférer les lames aux porteurs de coloration du verre et essorer. tableaux secs en les plaçant dans une centrifugeuse équipée de supports de plaques battantes, à une vitesse de 10 g pendant 5 min.
- Une fois les lames sont sèches, elles peuvent être incubées immédiatement ou stockées. Les conditions de stockage sont de -20 ° C dans un sac en plastique scellé.
2. Analyse des protéines de liaison Glycan
- Préparer une chambre humidifiée dans laquelle les tableaux à hybrider conviendra. Une chambre simple, se compose d'un plat en pyrex, en couches sur le fond avec des serviettes en papier humide et un support, sur lequel les diapositives reposeront.
- Utilisez lectines biotinylées SNA (Sambuca nigra agglutinine) et la CEA (Erythrina de agglutinine cristagalli) à 10 pg / ml + 2 pg / ml de streptavidine-555 colorant, dans un tampon de sondage (PBS + 0,01% de Tween-20). Pour HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 et A / KY / 07 H1N1, dans cet exemple), l'utilisationune concentration initiale de 20 ug / ml de pré-complexé, 34 comme décrit précédemment. En bref, faire un HA: Souris-α-Strep: mélange chèvre-α-Mouse-Alexa647 dans un tampon de blocage (PBS + BSA à 3% + 0,01% de Tween-20), à un rapport de 4: 1 molaire: 2.
REMARQUE: La matrice est sondé avec des lectines de vérifier que les glycanes sont immobilisés et détectables (figure 1B). - Transférer la solution de glycane de liaison de protéine-anticorps mélange de 20 pl sur une plaque à 384 puits et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Dilué en série des échantillons lectine et HA 1: 1, dans leur tampon approprié, 8 fois, en mélangeant 10 ul d'échantillon avec 10 pi de tampon.
- Pipette 8 pi de l'échantillon sur la surface micro-puits et incuber dans la chambre d'humidification étanche (100% HR) pendant 90 min.
- Laver les lames une par une en tenant les bords et les plongeant quatre fois dans un mélange de PBS et de Tween à 0,05%, puis quatre fois dans du PBS, et finalement quatre fois dans H 2 O déminéralisée En utilisantle même protocole de séchage décrit à l'étape de blocage, les matrices de spin sec dans une centrifugeuse pendant 5 mn à 10 x g.
3. Numérisation et Analyses de données
NOTE: Les microarrays glycanes peuvent être numérisés à différents paramètres, selon le fabricant du scanner de puces à ADN. En faisant varier la puissance et la résolution laser, l'instrument peut produire une image avec autant de signaux que possible dans sa gamme dynamique (figure 1C).
- Utilisez un scanner de diapositives fluorescent et analyser les tableaux immédiatement après incubation avec les protéines de liaison glycanes. Prenez soin d'assurer la glissière est correctement insérée dans l'appareil de balayage.
- un logiciel de balayage ouvert. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir le programme. Connectez-vous à scanner: Scanner → Connect ou le bouton vert dans le menu du panneau de navigation du scanner.
- porte ouverte autoloader du scanner. Placer les lames dans les fentes dans autochargeur ordre spécifique. Fermer la porte de l'autochargeur. Click "lire loader" dans le panneau Outils de navigation pour détecter automatiquement les diapositives dans le scanner.
- Paramètre scan Set: paramètres Scanner → numérisation appropriés à l'expérience (par exemple , 635 puissance laser élevée, le gain de détection de 50%). diapositives de numérisation: Scanner → numérisation. Sélectionnez le chemin en créant un dossier pour enregistrer les images numérisées et nom scans individuels. Pour ce faire, avant la numérisation réelle. Répéter pour chaque diapositive. Cliquez sur OK pour lancer la numérisation.
- Utilisez le logiciel du scanner pour mettre en place l'instrument et de numériser les diapositives. Réglez le scanner pour numériser itérativement à la puissance laser faible (5 mW) avec l'augmentation de réglages de gain de 25%, 50% et 75%.
REMARQUE: Les paramètres peuvent être testés et optimisés, mais gardez à l'esprit que chaque balayage peut éventuellement réduire la sortie de fluorescence des colorants en raison de photoblanchiment.- acquisition de données ouvertes et des logiciels d'analyse tels que les logiciels Mapix. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir le programme. Ouvrir l'image scan: Fichier → im ouvertâge. fichier GAL Ouvrir: Analyser → grille ouverte et sélectionnez le fichier de liste d'adresses globale appropriée.
- Entrer en mode blocs: le mode image → blocs pour déplacer la grille. Utilisez les marqueurs de la grille pour définir la grille à l'emplacement approprié sur la diapositive. Ajuster les blocs individuels que nécessaire pour correspondre au tableau imprimé.
- Entrer en mode de spots: Image → Mode de spots pour régler l'emplacement et la taille des taches individuelles au sein du bloc. Une fois que tous les blocs et les taches sont ajustées et en place, mesure des intensités du signal Analyser par des calculs photométriques →. Enregistrez le fichier de sortie.
- Une fois que les diapositives ont terminé la numérisation, les images sont analysées pour les signaux de liaison avec le programme de traitement d' image installée (Figure 1D - G). Pour l'analyse d'image, charger un fichier GAL (Array List) sur l'image TIFF numérisée.
REMARQUE: Le fichier GAL contient à la fois le modèle et les identités de chaque emplacement spot layout place. fichiers GAL pour les tableaux sont created par le logiciel de l'imprimante en utilisant un fichier texte délimité par des tabulations qui contient l'identité des échantillons et leur emplacement dans la plaque source 384 puits. - Utilisez les lumières marqueur / d'atterrissage de la grille imprimée sur les microarrays pour placer correctement la grille de GAL. peuvent avoir besoin de points individuels à déplacer individuellement, mais un tableau bien imprimé généralement permettre à des blocs dans la grille à placer avec facilité. Après le placement de la grille, de recueillir des intensités spot par le logiciel et enregistré en tant que fichier texte délimité par des tabulations (.txt).
- Utilisation du programme tableur, ouvrez le fichier de sortie du scanner. Ouvrez le fichier macro approprié dans l'emplacement du dossier. Cliquez sur Afficher → Macro → RunMacro.
NOTE: La pré-écrite copie les données brutes de sortie, supprimer des lignes et des colonnes inutiles, trier les données par exemple, calculer les valeurs moyennes de fond de signaux moins moyennes et tracer les valeurs résultantes pour une feuille de tableur contenant les graphiques pour chaque des six samples tester sur le tableau.
- Utilisation du programme tableur, ouvrez le fichier de sortie du scanner. Ouvrez le fichier macro approprié dans l'emplacement du dossier. Cliquez sur Afficher → Macro → RunMacro.
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Representative Results
Impression, numérisation et analyses de données
Pour imprimer correctement, il est essentiel d'avoir un alignement correct de la grille repérée dans le masque de téflon, qui délimite chaque tableau sur la diapositive. Pendant l'impression, en raison de la nature du revêtement de téflon, les taches ne sont pas visibles à l'oeil nu sur les glissières MPX. L'attention est portée ensuite à l'apparition des pré-taches sur les lames recouvertes de poly-L-lysine. Directement après l'impression, chaque diapositive doit être vérifiée par l'œil de la présence de chaque composé repéré qui est visible en raison des sels du tampon séché à l'endroit. Les tableaux sont inspectés pour un alignement correct des taches au sein des frontières de téflon et bon nombre de caractéristiques repérées.
Les diapositives sont numérisés dans un processus itératif de la baisse du pouvoir d'analyse plus élevé pour éviter photo blanchiment et permettant la comparaison des higson avidité pour abaisser la liaison avidité des protéines, qui ont des signaux de sortie supérieurs et inférieurs, respectivement. Après la numérisation, l'intensité de fluorescence de chaque tache dans les images de sortie sont mesurés au moyen d'un programme d'imagerie. Chaque tableau est superposée avec un fichier de grille qui correspond au nombre de caractéristiques imprimées sur la surface de la matrice (figure 1D - G). En utilisant des colorants fluorescents imprimés, les frontières des glycanes imprimés sont définis et un masque qui est intégré à l'identité de l'échantillon imprimé lassos chaque spot. Le masque d'imagerie sera Lasso enregistrer tous les aspects de la tache imagée (taille, intensité du signal, les coordonnées de la grille, etc.) et la sortie de ces informations dans un fichier texte délimité par des tabulations. En utilisant le logiciel de tabulation (tableur), les échantillons sont classés par l'identité et l'intensité du signal moyenne moins de fond est en moyenne plus de 4 des 6 points pour chaque échantillon, en laissant le signal le plus élevé et le plus bas comme des valeurs aberrantes. Un graphique de ligne de signal de moyenne moyennemoins de fond est tracée contre les huit concentrations de protéines appliquées à la matrice et contient une ligne pour chaque échantillon. Le graphique de sortie finale est lissée au moyen d' un calcul de régression non linéaire (figure 1I).
Glycan protéines de liaison
L'AAP-Array est utilisée pour évaluer la spécificité de liaison au récepteur de la grippe A hémagglutinines de virus. Une caractéristique supplémentaire de notre tableau, non présent dans l'essai de plaque analogue, est l'inclusion des témoins non sialylées dans le même micro-puits. Pour évaluer que les composés imprimés sont présents après l'impression, plante couramment utilisé lectines avec une spécificité connue ont été utilisés. ECA se lie à galactose terminal relié β1-4 à N-acétyl-glucosamine (Galβ1-4GlcNAc ou LacNAc) et ne se lie pas si le galactose terminal est coiffé d'acide sialique. ECA ne détecte que les glycanes non sialylées sur notre arr glycane miniaturiséay (figure 2A). L'absence de liaison à un quelconque des échantillons de glycanes sialylés est également indicative que ceux-ci sont complètement bouchés avec de l'acide sialique terminal. Pour α2-6 acide sialique lié, SNA a été utilisé comme un contrôle de la lectine (figure 2B). Comme prévu, SNA ne se lie à α2-6 acides sialiques liés, mais avec des différences notables d'affinité pour les répétitions di-LacNAc non-AAP liée AAP liée. Cette différence reflète la sensibilité des glycanes de l'AAP liée et permet la discrimination des protéines qui peuvent se lier avec une faible avidité. Pour α2-3 acide sialique lié, une hémagglutinine H5 dérivé du virus A / Vietnam / 1203-1204 qui est connu pour reconnaître α2-3 acides sialiques liés seulement a été utilisé 6. Le profil de liaison de l'HA H5 montre en effet une spécificité pour α2-3 acides sialiques liés, avec une plus grande avidité pour les structures liées AAP (figure 2C). Enfin, l'hémagglutinine H1 à partir d'une souche H1N1 saisonnière humaine qui a été utilisé, comme prévu, quelié à α2-6 acide contenant des structures sialique liés (figure 2D).
Figure 1: L' impression, la numérisation et l'analyse d' images (A) PAA-conjugué 6SLNLN est montrée comme une structure glycane représentative qui est imprimé sur les lames de verre.. (B) l' incubation d' une protéine de liaison de glycane sur le réseau des glycanes multi-puits est représenté par un volume de 8 ul qui crée une gouttelette sur la surface du tableau. (C) Après incubation des protéines de liaison glycanes sur le réseau et la numérisation dans un scanner de diapositives fluorescente confocale, une image représentative est obtenue. (D) L'image est superposée avec une grille et, en utilisant des marqueurs de la grille pour un alignement correct, les taches simples peuvent être analysées. (E) A proximité d'un ensemble complet de 8 tableaux, dans lesquels une seule protéine de liaison glycanea été analysé en utilisant huit 1: 1 dilutions. (F) Un seul tableau, dans un seul puits est représenté; le tableau est démarquée par les marqueurs de la grille en haut à droite (3 points) et en bas à gauche (2 points), cette protéine de liaison glycane lie un composé unique sur le tableau comme une réplique de six est clairement visible. (G) La grille est représentée avec lassos encerclant spots individuels spécifiques. (H) Logiciel d'imagerie calcule les valeurs de signal à partir du fichier d'image et génère un fichier de données délimité par des tabulations. (I) Les données peuvent être compilées dans un tableur ou d'un logiciel stastical pour créer un graphique de sortie représentatif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Sortie de lectines végétales (CEA, SNA) et IAV hemagglutinins avec des spécificités différentes (H5 à partir de A / Vietnam / 1203/04 H1 de A / Kentucky / 07). (A) se lie à CEA LacNAc terminal ou Galb1-4GlcNAc spécifique et détecte la présence des composés non-sialylés, utilisés comme témoins pour hémagglutinines IAV. (B) SNA ne reconnaît que les glycanes portant un acide sialique α2-6 terminal. (C) Le hémagglutinine recombinante du virus H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) de contrainte se lie à α2-3 acides sialiques et fournit un profil de liaison aux récepteurs de type aviaire. (D) L'hémagglutinine recombinante d'un virus H1N1 humaine saisonnière (A / Kentucky / 07) se lie à des récepteurs de type humain seulement. l'intensité du signal fluorescent a été mesuré pour chaque point, et l'intensité moyenne moins signifie fond a été calculé en utilisant le programme de feuille de calcul. Pour chaque glycane, l'intensité de signal moyenne est calculée à partir de 6 réplicats taches. Les signaux les plus élevés et les plus bas des 6 répétitions sont enlevés et le reste 4 répliquetes sont utilisées pour calculer le signal de moyenne, écart-type (SD), et la mesure d'erreur standard (SEM). Les graphiques représentent la moyenne de fond signal de moins en moyenne pour chaque échantillon et les barres d' erreur sont la valeur SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Évaluer IAV la spécificité du récepteur est une étape importante dans l'analyse de potentiel pandémique de virus aviaires. la reconnaissance de l'acide sialique par le virus est lié à plusieurs propriétés biologiques telles que la liaison et la libération à partir de la cellule. La connaissance des mutations qui en acides aminés sont nécessaires pour les virus aviaires pour atteindre α2-6 de liaison et traversent la barrière des espèces permet la préparation aux pandémies. Plusieurs essais sont utilisées pour déterminer la spécificité du récepteur; Cependant, tous ont leurs inconvénients, y compris la mesure de l' avidité et non seulement la spécificité et vice - versa.
Nous décrivons ici un nouvel outil miniaturisé basé sur la technique ELISA largement utilisé et accepté, qui utilise des fragments terminaux PAA liés de glycanes plus complexes. Utilisation de 4 lectines bien définies, 2 de l'usine et 2 de la grippe A l'origine du virus, nous montrons que nous maintenons la spécificité et l'avidité relative.
Lorsque l'on calcule le montant de la réduction des produits chimiques et biological utilisé par miniaturiser l'ELISA sur une puce de réseau glycanes, on arrive étonnamment grandes différences. Tout d'abord, les produits biologiques; nous utilisons 10x moins de volume d'essai et d'utiliser 6 composés d'essai en 6 répétitions; ceci peut être calculée comme étant l'équivalent de 36x rangées dans des plaques à 96 puits. Le résultat est que nous utilisons 360x moins biologiques. Les étapes critiques comprennent l'impression correcte et le risque de milieux élevés en utilisant des agents de liaison de glycanes non purifiées ou des anticorps de détection pauvres.
Les composés utilisés dans cet essai, bien que toujours disponibles, ne sont pas facilement fabriqués par synthèse chimio-enzymatique. Grâce à la technologie microarray-impression, chaque spot est à seulement 2 nl, comparativement à 100 pi par puits d'une plaque de microtitrage. Impression d'une seule diapositive contenant 48 puits et 6 composés, en 6 répétitions, nous consommons environ 1152 nl. La procédure de revêtement même dans des plaques à 96 puits résultats dans le revêtement d'un total de 1.842 puits avec 100 ul de composé dans la même concentration. Par conséquent, l'impression de til composé par rapport à l'essai de la plaque, nous atteignons une réduction frappante de 1,500x. Par conséquent, au total, les produits biologiques sont réduits à 360 fois la consommation et glycane par 1500 fois. L'utilisation de gestionnaires liquides robotiques, nous prévoyons que la plupart des mesures pourraient être automatisées, permettant à l'ensemble de dosage être utilisé comme un écran à haut débit.
Bien que microarrays d'impression et d'analyses d'images suivantes nécessitent des machines et des outils spéciaux, ces instruments ne sont pas rares et sont présents dans de nombreuses universités et instituts. L'impression est directe et ne nécessite pas de modifications chimiques. Par conséquent, nous pensons que, avec cette quantité minimale de composés et technique d'impression simple, ce test pourrait être plus généralement applicable. Comme il réduit le volume d'incubation, les coûts des anticorps et des produits biologiques précieux, cette technique, il sera possible pour les laboratoires disposant de ressources limitées pour évaluer la spécificité des IAV ou d'autres protéines de liaison glycanes avec une grande fidélité tout en conservant un coût moindres.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le Fonds Scripps Microarray Core et un contrat par les Centers for Disease Control (PCE). RPDV est un bénéficiaire d'une subvention Rubicon et VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). Le Consortium pour Glycomics fonctionnels (http://www.functionalglycomics.org/) financé par NIGMS subvention GM62116 (JCP) a fourni plusieurs glycanes utilisés dans cette étude. Ceci est la publication 29113 de The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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