Abstract
Virus de Influenza A (IAV) hemaglutininas reconocen ácidos siálico en la superficie celular como receptores funcionales para poder entrar en las células. Las aves acuáticas salvajes son el reservorio natural de IAV, pero IAV puede cruzar la barrera de las especies de aves de corral, cerdos, caballos y seres humanos. Los virus aviares reconocen ácido siálico unido a una penúltima galactosa mediante un enlace α2-3 (receptores de tipo aviar) mientras que los virus humanos reconocen preferentemente ácido siálico con una articulación (α2-6 receptores de tipo humano). Para controlar si los virus aviares se están adaptando a los receptores de tipo humano, varios métodos se pueden utilizar. microarrays de glicanos con diversas bibliotecas de sialosides sintéticos se utilizan cada vez más para evaluar la especificidad del receptor. Sin embargo, esta técnica no se utiliza para medir avideces. Medición de la avidez se consigue típicamente mediante la evaluación de la unión de la hemaglutinina o virus diluido en serie a glicanos adsorbidos en placas de 96 pocillos de polipropileno convencionales. En este ensayo, los glicanos con α2-3 o α2-6 ácidos siálicos están acoplados a biotina y adsorben a placas de estreptavidina, o se acoplan a poliacrilamida (PAA) que adsorben directamente al plástico. Hemos miniaturizado significativamente este ensayo imprimiendo directamente sialosides PAA-ligado y sus contrapartes no-PAA ligado en portaobjetos de vidrio micro pocillos. Esta puesta a punto, con 48 matrices en una sola diapositiva, permite ensayos simultáneos de 6 glicano proteínas de unión a los 8 diluciones, interrogando 6 glicanos diferentes, incluyendo dos controles no sialilados. Esto es equivalente a 18x placas de 96 pocillos en el ensayo de placa tradicional. El formato de matriz de glicanos disminuye el consumo de compuestos y productos biológicos y de este modo se mejora notablemente la eficiencia.
Introduction
Las aves acuáticas salvajes son el reservorio natural de IAV, pero IAV es capaz de cruzar la barrera de las especies de aves y mamíferos, incluidos los humanos. Virus de este tipo de aves reconocen α2-3 ácidos siálico unido (receptores de tipo aviar), mientras que los virus humanos se unen α2-6 ácidos siálico unido (receptores de tipo humano). Para ser capaz de replicarse y transmitir entre los seres humanos una IAV aviar necesita para unirse a los receptores de tipo humano 1 de manera eficiente.
Virus de este tipo se dividen basado en serología que caracteriza a la antigenicidad de su hemaglutinina (HA) y glicoproteínas de la envoltura de la neuraminidasa (NA). HA se une a los ácidos siálicos, mientras que NA es la enzima destructora del receptor en el otro extremo del ciclo de vida viral, y se unirá de ácido siálico 2. Todos los virus que infectan a humanos, incluyendo H1N1, H2N2 y H3N2, tienen un origen aviar 3. Durante las dos últimas décadas de varias aves a humanos cruces se han producido, con el H5N1, H7N7, H7N9 y siendo el más conocido; Howeembargo, otros subtipos de haber infectado a los humanos de forma más esporádica (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Afortunadamente, parece que ninguno de estos virus han sido capaces de adaptarse plenamente a los receptores de ácido siálico ligado α2-6 de tipo humano 5-8. La adaptación de los virus zoonóticos aviar u otros para dar cabida a la replicación y la transmisión en huéspedes humanos podría tener un efecto devastador sobre la salud humana. Por lo tanto, el conocimiento previo de cómo estos virus están evolucionando para unirse a receptores de tipo humano ayudará a la vigilancia de todo el mundo de los virus de influenza emergentes.
Determinación de preferencia receptor fue aclarada primero usando eritrocitos de diferentes especies y sigue siendo un ensayo favorecida entre los investigadores de la gripe 9-12. La demostración de que los virus aviares reconocen ácido siálico α2-3 y α2-6 virus humanos vinculados ácido siálico se basó originalmente en un ensayo usando la hemaglutinación de eritrocitos enzimáticamente por ingeniería genética para contener cada uno de los linkages 13,14. Aunque la lectura es de hemaglutinación, un ensayo estándar para los virólogos, las estructuras de glicano subyacentes no están definidos, sólo el enlace terminal. Además, la disponibilidad limitada de las sialiltransferasas, que se utiliza para volver a sialylate las células, han limitado el uso de este ensayo 15-18. Posteriormente, se introdujeron otros métodos de determinación de las preferencias de unión al receptor usando las estructuras de glicano sialiladas vinculados a las estructuras de poli-glutamato (PGA) de poli-acrilamida (PAA) o en ensayos basados en la placa de 19,20. Varias variaciones son posibles en el revestimiento de cualquiera de los glicanos o virus a placas de microtitulación, cada uno de lo que resulta en un ensayo de tipo ELISA robusto, fiable y muy sensibles 21-23. Alternativamente, los glicanos de biotina ligada puede sustituir a PAA / PGA y se pueden conjugar a las placas recubiertas con estreptavidina 2,24. Aunque se puede requerir algunos sueros específica, las pruebas ELISA son glicanos estándar y varios enlaces a PAA son fácilmente commerciallY como no disponibles comercialmente (Consorcio para Funcional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Las tecnologías de microarrays de glicanos se han convertido en una herramienta muy valiosa para determinar la especificidad del receptor, como múltiples glicanos diferentes se han manchado, y la unión a una amplia gama de diferentes estructuras pueden ser evaluados dentro de un único ensayo de 25-29. La unión de IAV a estas estructuras proporciona una mejor comprensión de las estructuras de glicano que IAV reconoce preferentemente 30-33. microarrays de glicanos requieren pequeñas cantidades de volumen de muestra para realizar un ensayo de unión y sólo utiliza cantidades muy pequeñas de glicano por punto (2 nl). Sin embargo, estas matrices se utilizan normalmente sólo para evaluar la especificidad de los receptores de glicanos. Análisis de múltiples virus, o proteínas de hemaglutinina, en múltiples intervalos de concentración puede ser prohibitivo debido al número de diapositivas requeridos. Por otra parte, hasta la fecha, ningún ensayo de avidez relativa ha sido desarrollado utilizando ar glicanotécnicas de rayos.
Para combinar el requisito bajo la muestra proporcionada por las técnicas de microarrays de glicanos y la sensibilidad de los glicanos PAA-ligado en ensayos basados en ELISA, hemos tratado de desarrollar una matriz de glicanos de múltiples pocillos que permitiría análisis de alto rendimiento con una resolución similar o mejor en comparación para el ensayo basado en ELISA tradicional. Al mismo tiempo, hemos querido minimizar la cantidad de productos biológicos y químicos consumidos reportero. El resultado final es un ensayo de avidez miniaturizado, desarrollado específicamente para el seguimiento de IAV especificidad y es igualmente aplicable a evaluar otras proteínas de unión de glicano. El uso de un portaobjetos de vidrio separados en 48 micro pozos por una máscara de teflón, 6 glicanos diferentes se han manchado en 6 repeticiones por pocillo. La plataforma de microarrays ofrecen las mismas tendencias en la unión al receptor vistos en el formato ELISA macro con varias ventajas. Estos incluyen (I) de impresión de compuesto en 6 repeticiones, utilizando mínima de la muestra, en comparación con el recubrimiento de varias filas ina placa, usando 100 l por pocillo; (II) múltiples compuestos diferentes analizaron simultáneamente en un único pozo, incluyendo los controles; (III) una disminución masiva en volumen de incubación y; (IV) un rango dinámico más grande, utilizando una lectura fluorescente. Una sola diapositiva se puede calcular que es equivalente a 18x placas de 96 pocillos.
Con el siguiente protocolo, cualquier laboratorio capaz de fabricar y analizar manchado microarrays deben ser capaces de fabricar este formato ELISA miniaturizado.
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Protocol
NOTA: Todas las etapas se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
1. Matriz de construcción
- Glicanos Preparación y configuración de la placa
- Preparar una reserva de memoria intermedia de impresión. En primer lugar hacer 500 ml de una solución madre 150 mM de fosfato de sodio dibásico. También asegúrese de 50 ml de una solución madre 150 mM de solución de fosfato de sodio monobásico. En un matraz, usando una barra de agitación y pH metro magnética, lentamente se valora la solución de fosfato de sodio dibásico con la solución monobásico hasta que se alcanza un pH de 8,5. Añadir Tween-20 a 0,005%.
- Preparar las muestras de glicanos. Diluir PAA glicanos conjugados, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) y 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) se deben diluirse a 100μg / ml en tampón de impresión de step1.1.1. glicanos monovalentes,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) y 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) a 100μM en tampón de impresión de la etapa 1.1.1. Por último, preparar los tintes de amina-funcionalizado, para su uso como marcadores de rejilla / luces de aterrizaje. manchas de colorante marcador se imprimen en 1 mM.
NOTA: tinte Atto488-NHS se utiliza en nuestras impresiones. Sin embargo, cualquier colorante funcionalizada con amina, legible por el escáner de diapositivas es apropiado para este propósito. - Transferencia de 10 l de cada muestra de glicano a placas de microtitulación de 384 pocillos, que se utilizan para el robot de impresión. Tiendas glicanos no utilizados en solución tampón de impresión a -20 ° C en tubos sellados. Tansfer 10 l de marcador de colorante a la plancha de impresión.
- Impresión
NOTA: Todas steps que la preocupación de tocar o mover las diapositivas debe hacerse con guantes.- Coloque Arrayer alfileres en la cabeza de impresión de acuerdo con la configuración correcta de la disposición. Por esta disposición usar un pin para imprimir todas las muestras y matrices. Imprimir los glicanos en bloques de seis, saltarse una característica (una característica se define como único punto de un compuesto determinado), a cada lado, de tal manera que los puntos de la misma muestra no se imprimen exactamente al lado de otra.
NOTA: El usuario final debe decidir la configuración. - Retirar los portaobjetos de las bolsas, cajas abiertas, y quitar cualquier partícula de polvo o pequeños trozos de plástico que pueda estar en sus superficies soplando gas nitrógeno de pureza ultra alta en cada diapositiva. Coloque el número deseado de diapositivas, cara recubierta hacia arriba, en la etapa arrayer.
- Programa de la arrayer, utilice los parámetros de 27 puntos por cada visita a la placa de la fuente, usando 3 "pre-spots" en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, para eliminar el exceso de líquido en la punta de los pasadores de impresión
- Encienda MPU (unidad de alimentación principal) y la Unidad de Control de Clima. Abra el software de análisis de baldosas en el ordenador.
- Selecciona un diseño a la impresión. Seleccione Opciones → herramienta del Pin para ser utilizado para la impresión de la matriz 1 x 1 herramienta de impresión - 1 solo perno. Seleccione la pestaña Destino → Herramienta de arreglo Definición → Modelo de la impresión y añadir el terreno de juego (punto-a-punto de distancia), el número de filas y columnas para dar cabida a las muestras que se desea imprimir, y el patrón de la impresión de las muestras (para esta matriz a 8 x 8 patrón de impresión se utiliza a 340 micras de paso de 7 muestras en total).
- Seleccionar Destino → Diseño de la diapositiva y programar la distancia de bloque a bloque para permitir la impresión de cada matriz de duplicados en la plantilla de diapositivas de 48 pocillos (4 x 12). Seleccionar fuente y añadir el número de pastillas de origen (1 para cada muestra utilizando las patillas 1) (para esta impresión 7 pastillas de origen se utilizará para dar cabida a 6 pocillos de muestra y 1 marcador de tinte también).
NOTA: El diálogo fuente cambiará a verde para indicar que el númerode visitas de origen coincide con las muestras que se van impresos en el patrón de impresión. - Seleccione la Plata Destino → Adaptador y diseño de diapositiva y ajustar el número de diapositiva (5 diapositivas se imprimen a la vez para esta impresión con 1 tobogán de pretratamiento).
- Liberar la bandeja haciendo clic en el botón T1 para activar la bandeja y añadir el número deseado de diapositivas a la bandeja, prestando especial atención a la ubicación de la diapositiva de pretratamiento (AZUL) y se desliza "reales".
- Colocar los portaobjetos de vidrio de fricción en todos los puertos de vacío restantes para bloquear el vacío y haga clic en OK para activar el vacío. Compruebe que todas las diapositivas se mantienen en su sitio y haga clic en OK para volver la bandeja a la posición inicial.
- Cargar la plancha de impresión en el soporte de la placa y asegurar el bastidor está configurado correctamente en su lugar. Haga clic en OK y permitir que el proceso de impresión continúe.
- Imprimir los 24 puntos restantes en repeticiones de 6 puntos por conjunto de matrices (4 / visita fuente).
- Cargar las placas de 384 pocillosen la impresora y empezar a imprimir. Mantener la humedad relativa, durante la impresión, a través de la impresión entre 55 y 65%. La impresora se detiene después de imprimir 5 diapositivas.
NOTA: Mientras el microarray en este ensayo se ha impreso un patrón específico de 8 x 8, diferentes tipos de robots de impresión de microarrays necesitará una programación específica equipo para lograr el diseño deseado. Corresponde al usuario final para determinar el patrón más adecuado dada especificaciones de sus equipos.
- Coloque Arrayer alfileres en la cabeza de impresión de acuerdo con la configuración correcta de la disposición. Por esta disposición usar un pin para imprimir todas las muestras y matrices. Imprimir los glicanos en bloques de seis, saltarse una característica (una característica se define como único punto de un compuesto determinado), a cada lado, de tal manera que los puntos de la misma muestra no se imprimen exactamente al lado de otra.
- Humidificación / Inmovilización
NOTA: Una vez que las diapositivas han terminado de imprimir, se someten a una etapa de inmovilización temporal, también llamada de humidificación. La humidificación de post-impresión ayuda a homogeneizar la muestra de apego al volver a mojar las manchas y asegurar el bloqueo completo.- Ponga los portaobjetos en una cámara de humedad del 100% inmediatamente después de la impresión por un período de 30 min. Construir la cámara mediante la colocación de toallas de papel húmedas muy planas en la parte inferior de un gran plato de vidrio, colocando las diapositivasen algún tipo de bastidor, como por ejemplo un Gradilla de impresión hacia arriba, y sellado con una envoltura de plástico para atrapar la humedad.
- Número desliza con un / pluma de alcohol resistente a los disolventes marcar y guardar en una caja de desecación. Desecar durante la noche.
- Numeración, bloqueo y almacenamiento
- Preparar el tampón de bloqueo - etanolamina 50 mM en 50 mM de tampón de borato. En primer lugar, disolver el ácido bórico, en ddH 2 O, a una concentración final de 50 mM en un matraz que contenía una barra de agitación magnética. Agitar enérgicamente la solución en una placa de agitación hasta que se haya disuelto todo el sólido. Mientras que constantemente se agita, añadir la cantidad apropiada de etanolamina a partir de una solución de 16.54 m stock para alcanzar la concentración deseada 50 mM. Añadir hidróxido de sodio concentrado para ajustar a un pH final de 9,2.
- Sumergir las diapositivas impresas en la solución tampón de bloqueo durante 1 hora.
- Después de 1 hora, enjuague los portaobjetos en ddH2O para eliminar cualquier rastro de exceso de tampón de bloqueo.Desechar el amortiguador de bloqueo en un recipiente apropiado para desechos.
- La transferencia de las diapositivas a los titulares de tinción de vidrio y centrifugar. matrices secas colocándolas en una centrífuga equipada con los titulares de la placa de balanceo, a una velocidad de 10 g durante 5 min.
- Una vez que los portaobjetos están secos, pueden ser incubadas inmediatamente o almacenar. Las condiciones de almacenamiento son -20 ° C en una bolsa de plástico sellada.
2. Análisis de proteínas de unión a glicanos
- Preparar una cámara humidificada en la que las matrices para hibridarse se ajuste. Una cámara sencilla consiste en un plato de Pyrex, en capas en la parte inferior con toallas de papel humedecidas y un bastidor, sobre la que se desliza descansarán.
- Utilice lectinas biotiniladas SNA (Sambuca nigra aglutinina) y ECA (Erythrina cristagalli aglutinina) a 10 mg / ml + 2 mg / ml de estreptavidina-555 tinte, en tampón de sondeo (PBS + 0,01% de Tween-20). Para HA (A / Vietnam / 1203/04 H5N1 y A / KY / 07 H1N1, en este ejemplo), el usouna concentración de partida de 20 mg / ml pre-complejado, como se describió anteriormente 34. En pocas palabras, hacer una HA: Ratón-α-Strep: mezcla de cabra-α-ratón-Alexa647 en tampón de bloqueo (PBS + BSA al 3% + 0,01% de Tween-20), a una relación molar 4: 1: 2.
NOTA: La matriz se sondeó con lectinas de cerciorarse de que los glicanos se inmovilizan y detectable (Figura 1B). - Transferir la solución de la mezcla proteína-anticuerpo de unión glicano de 20 l a una placa de 384 pocillos y se incuba en hielo durante 30 min. En serie diluir lectina y las muestras de HA 1: 1, en su tampón apropiado, 8 veces, mediante la mezcla de 10 l de muestra con 10 l de tampón.
- Pipeta de 8 l de la muestra en la superficie micro-pocillo e incubar en la cámara de humidificación sellado (100% de HR) durante 90 min.
- Se lavan los portas uno a la vez manteniendo los bordes y les inmersión cuatro veces en una mezcla de PBS y 0,05% de Tween, luego cuatro veces en PBS, y finalmente cuatro veces en H2O desionizada Utilizandoel mismo protocolo de secado descrito en la etapa de bloqueo, girar los arrays se secan en una centrífuga durante 5 minutos a 10 x g.
3. Los análisis de datos de exploración y
NOTA: Los microarrays de glicanos pueden ser escaneados en diferentes configuraciones, dependiendo del fabricante del escáner de microarrays. Mediante la variación de la potencia del láser y la resolución, el instrumento puede producir una imagen con tantas señales como sea posible dentro de su rango dinámico (Figura 1C).
- Utilizar un escáner de diapositivas fluorescente y escanear las matrices inmediatamente después de la incubación con las proteínas de unión de glicanos. Tenga cuidado para asegurar la tapa está correctamente insertada en el instrumento de exploración.
- software de exploración abierta. Haga clic en Inicio para abrir el programa. Conectar con el escáner: Escáner → Conectar o el botón verde en el menú del panel de navegación del explorador.
- Abrir puerta del cargador automático del escáner. Colocar los portaobjetos en las ranuras de cargador automático con el fin específico. Cierre la puerta del cargador automático. click "leer cargador" en el panel de herramientas de navegación para detectar automáticamente las diapositivas en el escáner.
- Ajuste el parámetro de análisis: parámetros de escaneado del escáner → adecuadas para el experimento (por ejemplo, 635 de energía láser de alta, aumento de la detección del 50%). diapositivas de la exploración: explorador → escaneo. Seleccionar ruta mediante la creación de una carpeta para guardar las imágenes de la exploración y exploraciones individuales de nombres. Para ello, antes de la real de la exploración. Repita este procedimiento para cada diapositiva individual. Haga clic en OK para iniciar la exploración.
- Utilice el software del escáner para configurar el instrumento y escanear las diapositivas. Conjunto escáner para escanear de forma iterativa en láser de baja potencia (5 mW) con el aumento de los ajustes de ganancia de 25%, 50% y 75%.
NOTA: Los ajustes pueden ser probados y optimizados, pero tenga en cuenta que cada exploración, posiblemente, puede reducir la salida de la fluorescencia de los colorantes debido a photobleaching.- adquisición de datos abierta y software de análisis como el software MAPIX. Haga clic en Inicio para abrir el programa. Abrir exploración de imagen: Archivo → im abiertoaños. Abrir archivo GAL: Analizar → rejilla abierta y seleccione el archivo GAL apropiado.
- Entre en el modo bloques: el modo de imagen → bloques para mover la cuadrícula. Utilice los marcadores de la red para configurar la red a la ubicación adecuada en la diapositiva. Ajuste bloques individuales como sea necesario para que coincida con la matriz impresa.
- Ingrese al modo de manchas: Imagen → Modo de puntos para ajustar la ubicación y el tamaño de las manchas individuales dentro del bloque. Una vez que todos los bloques y los puntos se ajustan y en su lugar, la intensidad de señal medida por Analizar → cálculos fotométricos. Guarde el archivo de salida.
- Una vez que las diapositivas han terminado de escanear, las imágenes se analizaron para las señales de unión con el programa de procesamiento de imágenes instalado (Figura 1 D - G). Para el análisis de imágenes, cargar un archivo GAL (Lista Array) la imagen escaneada TIFF terminado.
NOTA: El archivo GAL contiene tanto el patrón de disposición in situ y las identidades de cada lugar in situ. archivos GAL para las matrices son created por el software de la impresora utilizando un archivo de texto delimitado por tabuladores que contiene la identidad de las muestras y su ubicación en la placa de fuente de 384 pocillos. - Utilice la rejilla de luces de posición / desembarque impresas en los microarrays para colocar correctamente la red GAL. manchas individuales pueden necesitar ser movido de forma individual, sino un conjunto bien impreso generalmente permitirá bloques dentro de la red para ser colocados con facilidad. Tras la colocación de la rejilla, recoger las intensidades de terreno por el software y guardado como un archivo de texto delimitado por tabulaciones (.txt).
- Utilizando el programa de hoja de cálculo, abra el archivo de salida del escáner. Abra el archivo de macro adecuada de la ubicación de la carpeta. Haga clic en Ver → → Macro EjecutarMacro.
NOTA: El pre-escrito copiará los datos de salida primas, eliminar filas y columnas innecesarias, ordenar los datos por ejemplo, el cálculo de los valores de fondo de la señal menos una media promedio y trazar los valores resultantes de a una hoja de hoja de cálculo que contiene los gráficos para cada de los seis sampLes probado en la matriz.
- Utilizando el programa de hoja de cálculo, abra el archivo de salida del escáner. Abra el archivo de macro adecuada de la ubicación de la carpeta. Haga clic en Ver → → Macro EjecutarMacro.
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Representative Results
Impresión, escaneo y análisis de datos
Para garantizar una impresión correcta, que es vital tener la correcta alineación de la rejilla manchado dentro de la máscara de teflón, que delimita cada matriz en la diapositiva. Durante la impresión, debido a la naturaleza del recubrimiento de teflón, puntos no pueden ser vistos por el ojo desnudo en las diapositivas MPX. Se presta atención a continuación a la aparición de los pre-manchas en las diapositivas de poli-L-lisina recubiertos. Directamente después de la impresión, cada diapositiva se debe comprobar a simple vista la presencia de cada compuesto manchado que es visible debido a las sales del tampón secos en el lugar. Las matrices son inspeccionados para la correcta alineación de los puntos dentro de las fronteras de teflón y la correcta cantidad de características manchadas.
Las diapositivas se escanean en un proceso iterativo de baja al poder de escaneo superior para evitar la decoloración foto y permitir la comparación de higsu avidez para bajar las proteínas de unión de avidez, que tienen señales de salida superiores e inferiores, respectivamente. Después de la exploración, la intensidad de fluorescencia de cada punto en las imágenes de salida se mide usando un programa de imágenes. Cada matriz se cubrió con un archivo de la red que coincide con el número de características impresas en la superficie de la matriz (Figura 1D - G). El uso de colorantes fluorescentes impresos, las fronteras de los glicanos impresos están definidas y una máscara que se integra con la identidad de la muestra impresa Lassoes cada punto. La máscara de imagen lazo registrará todos los aspectos del punto de captación de imagen (tamaño, intensidad de la señal, las coordenadas de la cuadrícula, etc.) y enviar esta información a un archivo de texto delimitado por tabuladores. El uso de software de tabulación (hoja de cálculo), las muestras se ordenan por la identidad y la intensidad de señal media menos de fondo se promedia en 4 de los 6 puntos para cada muestra, dejando de lado la señal más alta y la más baja como atípicos. Un gráfico de líneas de señal media promediomenos el fondo se representa frente a las ocho concentraciones de proteínas aplicadas a la matriz y contiene una línea para cada muestra. El gráfico de salida final se alisa con un cálculo de regresión no lineal (Figura 1I).
Glicanos proteínas de unión
El PAA-Array se utiliza para evaluar la especificidad de unión al receptor de la gripe A hemaglutininas del virus. Una característica adicional de nuestra matriz, no está presente en el ensayo de placa análoga, es la inclusión de los controles no sialiladas en el mismo micro pocillos. Para evaluar que los compuestos impresos están presentes después de la impresión, planta que se usa comúnmente con las lectinas se utilizaron especificidad conocida. ECA se une a galactosa terminal vinculado β1-4 a N-acetil-glucosamina (Galβ1-4GlcNAc o LacNAc) y no se unirá si la galactosa terminal está tapado con ácido siálico. ECA sólo detecta los glicanos no sialilados en nuestro arr glicano miniaturizadoay (Figura 2A). La falta de la unión a ninguna de las muestras de glicano sialiladas es también indicativo de que éstos están completamente tapados con ácido siálico terminal. Para α2-6 ácido siálico unido, SNA se utilizó como control lectina (Figura 2B). Como era de esperar, SNA sólo se une a α2-6 ácidos siálicos enlaces, pero con notables diferencias en la afinidad por repeticiones LacNAc di-no-PAA ligada PAA-vinculado. Esta diferencia refleja la sensibilidad de los glicanos ligados PAA y permite la discriminación de las proteínas que pueden unirse con baja avidez. Para α2-3 ácido siálico unido, una hemaglutinina H5 deriva de un virus / Vietnam / 1203/04 que se sabe que reconocer sólo α2-3 ácidos siálicos enlaces se utilizó 6. El perfil de unión de la HA H5 de hecho muestra especificidad para α2-3 ácidos siálicos enlazados, con una avidez mayor para las estructuras vinculadas-PAA (Figura 2C). Por último, se utilizó la hemaglutinina H1 de una cepa H1N1 estacional humana que, como se esperaba, solamenteunido a α2-6 estructuras que contienen ácido siálico unido (Figura 2D).
Figura 1: impresión, escaneo y análisis de imagen (A) PAA conjugado 6SLNLN se muestra como una estructura de glicano representante que se imprime en los portaobjetos de vidrio.. (B) incubar una proteína de unión de glicanos en la matriz de glicano de múltiples pocillos se muestra con un volumen de 8 l que crea una gota en la superficie de la matriz. (C) Después de la incubación de las proteínas de unión de glicanos en la matriz y el escaneo en un escáner de diapositivas confocal de fluorescencia, se obtiene una imagen representativa. (D) La imagen se superpone con una rejilla y, el uso de marcadores de la rejilla para la alineación apropiada, las manchas individuales pueden ser analizadas. (E) Un primer plano de un conjunto completo de 8 matrices, en los que una sola proteína de unión glucanose analizó usando ocho 1: 1 diluciones. (F) una sola matriz, en un solo pozo está representado; la matriz está demarcada por los marcadores de rejilla en la parte superior derecha (3 puntos) y la parte inferior izquierda (2 puntos), esta proteína de unión glucano se une un solo compuesto en la matriz como una repetición de seis es claramente visible. (G) La rejilla se muestra con lazos que rodean manchas individuales específicas. (H) de imágenes de software calcula los valores de señal desde el archivo de imagen y da salida a un archivo de datos delimitado por tabuladores. (I) Los datos pueden ser tabulados en la hoja de cálculo o software de stastical para crear un gráfico de salida representativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La producción de lectinas de plantas (ECA, SNA) y hema IAVgglutinins con diferentes especificidades (H5 de A / Vietnam / 1203/04, H1 de A / Kentucky / 07). (A) se une ECA LacNAc terminal o Galb1-4GlcNAc específicamente y detecta la presencia de los compuestos no sialiladas, que se utiliza como controles hemaglutininas de IAV. (B) SNA sólo reconoce glicanos que llevan un ácido siálico terminal de α2-6. (C) La hemaglutinina recombinante del virus H5N1 (/ / 1203-04 Una Vietnam) cepa se une a α2-3 sialic ácidos y proporciona un perfil de unión al receptor de tipo aviar. (D) La hemaglutinina recombinante de una estacional H1N1 humana (A / Kentucky / 07) se une a los receptores de tipo humano solamente. intensidad de la señal fluorescente se midió para cada mancha, y la intensidad media de menos de fondo se calculó utilizando hoja de cálculo significa. Para cada glicano, la intensidad media de la señal se calcula a partir de 6 repeticiones manchas. Las señales más altos y más bajos de las 6 repeticiones se eliminan y el restante 4 réplicasTES se utilizan para calcular la señal media, la desviación estándar (SD), y la medición de error estándar (SEM). Los gráficos representan la media de la señal de fondo menos un promedio para cada muestra y las barras de error son el valor SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La evaluación de la especificidad del receptor IAV es un paso importante en el análisis de potencial pandémico del virus aviares. El ácido siálico reconocimiento por el virus está vinculada a varias propiedades biológicas tales como la unión a y la liberación de la célula. El conocimiento de que las mutaciones de aminoácidos son necesarios para los virus aviares para lograr la unión α2-6 y cruzan la barrera de las especies permite preparación para una pandemia. Varios ensayos se utilizan para determinar la especificidad del receptor; sin embargo, todos tienen sus inconvenientes, incluyendo avidez solamente la medición y no especificidad, y viceversa.
Aquí se describe un nuevo miniaturizado herramienta basada en el ampliamente utilizado y aceptado ELISA, que utiliza fragmentos terminales PAA-ligado de glicanos complejos. Utilizando 4 lectinas bien definidos, 2 de planta y 2 del virus de la influenza A de origen, se muestra que mantenemos especificidad y avidez relativa.
Cuando calculamos la cantidad de reducción de productos químicos y biological utilizado por la miniaturización de la prueba ELISA en un chip de matriz de glicanos, se llega sorprendentemente grandes diferencias. En primer lugar, los productos biológicos; utilizamos 10 veces menos volumen de ensayo y el uso de los compuestos de ensayo 6 de 6 repeticiones; esta puede ser calculada como el equivalente de 36x filas en placas de 96 pocillos. El resultado es que utilizamos 360x menos biológicos. Los pasos críticos incluyen la impresión correcta y el riesgo de fondos de alta utilizando agentes de unión de glicanos no purificados o anticuerpos de detección pobres.
Los compuestos utilizados en este ensayo, aunque todavía disponible, no se hacen fácilmente por síntesis quimio-enzimática. El uso de la tecnología de microarrays de impresión, cada punto es solamente 2 nl, en comparación con 100 l por pocillo de una placa de microtitulación. Impresión de una sola diapositiva que contiene 48 pozos y 6 compuestos, en 6 repeticiones, que consumen aproximadamente 1.152 nl. El mismo procedimiento de recubrimiento en placas de 96 pocillos resultados en el recubrimiento de un total de 1.842 pocillos con 100 l de compuesto en la misma concentración. Por lo tanto, la impresión tque en el compuesto en comparación con el ensayo de placa, alcanzamos una reducción notable de 1,500x. Por lo tanto, en total, los productos biológicos se reducen 360 veces y el consumo de glicano por 1.500 veces. La utilización de controladores líquidos robóticos, prevemos que la mayoría de los pasos podrían ser automatizados, lo que permite el ensayo completo puede utilizar como una pantalla de alto rendimiento.
Aunque microarrays de impresión y análisis de imágenes posteriores requieren máquinas y herramientas especiales, estos instrumentos no son raros y están presentes en muchas universidades e institutos. La impresión es directa y no requiere alteraciones químicas. Por lo tanto, creemos que, con esta cantidad mínima de compuestos y técnica de impresión simple, este ensayo podría ser de aplicación más general. A medida que se reduce el volumen de incubación, los costos de anticuerpos y productos biológicos preciosos, esta técnica hará que sea factible para laboratorios con recursos limitados para evaluar la especificidad de IAV u otras proteínas de unión de glicanos con alta fidelidad, manteniendo un costo menors.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo para el Scripps Microarray Core, y un contrato de los Centros para el Control de Enfermedades (JCP). RPdV es un beneficiario de una subvención VENI Rubicón y de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO). El Consorcio para Funcional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/), financiado por la subvención GM62116 NIGMS (JCP) proporcionó varios glucanos utilizados en este estudio. Esta es la publicación 29113 de The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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