Abstract
Virus influenzale A (IAV) emoagglutinine riconoscono acidi sialico sulla superficie delle cellule, come i recettori funzionali per ottenere l'ingresso nelle cellule. uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV può attraversare la barriera di specie di pollame, suini, cavalli e gli esseri umani. virus aviari riconoscono acido sialico attaccato ad un galattosio penultima da un legame α2-3 (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani preferenzialmente riconoscono acido sialico con un α2-6 linkage (recettori di tipo umano). Per monitorare se i virus aviari si stanno adattando ai recettori di tipo umano, possono essere utilizzati diversi metodi. microarray glycan con diverse librerie di sialosides sintetici sono sempre più utilizzati per valutare recettore specificità. Tuttavia, questa tecnica non è utilizzata per misurare avidità. Misurazione della avidità è solitamente ottenuto valutando il legame di emoagglutinina o virus diluiti serialmente per glycans adsorbita convenzionali polipropilene piastre a 96 pozzetti. In questo saggio, glicani con α2-3 o α2-6 acidi sialici sono accoppiati alla biotina e streptavidina adsorbite piastre, o sono accoppiati poliacrilammide (PAA) che adsorbe direttamente alla plastica. Abbiamo notevolmente miniaturizzato questo test stampando direttamente sialosides PAA-linked e le loro controparti non PAA-linked su vetrini micro-bene. Questo set-up, con 48 matrici su una singola diapositiva, permette analisi simultanee di 6 glycan proteine leganti a 8 diluizioni, interrogando 6 glicani diversi, tra cui due controlli non sialylated. Ciò equivale a 18x piastre a 96 pozzetti nel test tradizionale piatto. Il formato di matrice glycan riduce il consumo di sostanze e prodotti biologici e, quindi, migliora notevolmente l'efficienza.
Introduction
uccelli acquatici selvatici sono il serbatoio naturale per IAV, ma IAV è in grado di attraversare la barriera di specie di pollame e mammiferi, inclusi gli esseri umani. IAV aviaria riconoscono α2-3 acidi sialico legati (aviaria di tipo recettori), mentre i virus umani si legano α2-6 acidi sialico legati (di tipo umano recettori). Per essere in grado di replicare in modo efficiente e trasmettere tra gli esseri umani un IAV aviaria ha bisogno di legarsi ai recettori di tipo umano 1.
IAV sono divisi sulla base di sierologia che caratterizza l'antigenicità della loro emoagglutinina (HA) e glicoproteine busta neuraminidasi (NA). HA si lega agli acidi sialici, considerando NA è l'enzima recettore distruggendo all'altra estremità del ciclo di vita virale e si unirà acido sialico 2. Tutti i virus che infettano umani, tra cui H1N1, H2N2 e H3N2, hanno un origine avicola 3. Negli ultimi due decenni molti aviaria ai crossover umani si sono verificati, con il virus H5N1, H7N7, e H7N9 è il più noto; However, altri sottotipi hanno infettato gli esseri umani più sporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Fortunatamente, sembra che nessuno di questi virus sono stati in grado di adattarsi perfettamente al tipo umano α2-6-linked recettori per l'acido sialico 5-8. Adattamento del virus zoonotici aviaria o di altri per ospitare la replicazione e la trasmissione in ospiti umani potrebbe avere un effetto devastante sulla salute umana. Pertanto, prima la conoscenza di come questi virus si stanno evolvendo di legare i recettori di tipo umano aiuterà sorveglianza in tutto il mondo dei virus influenzali emergenti.
Determinazione della preferenza del recettore è stato chiarito con eritrociti di specie diverse e rimane un test favorito tra i ricercatori di influenza 9-12. La dimostrazione che i virus aviari riconoscono acido sialico α2-3 e virus umani α2-6 collegati acido sialico è stato originariamente basato su un test utilizzando emoagglutinazione di eritrociti enzimaticamente ingegnerizzate per contenere ciascuno dei Linkages 13,14. Anche se la lettura è emoagglutinazione, un test standard per virologi, le strutture glycan sottostanti non sono definite, soltanto il collegamento del terminale. Inoltre, la limitata disponibilità dei sialyltransferases, utilizzati per ri-sialylate cellule, hanno limitato l'uso di questo dosaggio 15-18. Successivamente, sono stati introdotti altri metodi per determinare le preferenze del recettore vincolante utilizzando strutture glycan sialylated legati alla poli-acrilamide (PAA) o strutture poli-glutammato (PGA) in saggi piatto a base di 19,20. Diverse varianti sono possibili rivestimento sia i glicani o virus di micropiastre, ciascuna delle quali si traduce in un robusto, affidabile e molto sensibile ELISA-tipo di saggio 21-23. In alternativa, glicani biotina-linked possono sostituire PAA / PGA e può essere coniugato con piastre rivestite di streptavidina 2,24. Anche se alcuni sieri specifici può essere richiesto, ELISA sono glicani standard e diversi legati alla PAA sono prontamente commerciallY e non disponibile in commercio (Consorzio per Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org)).
Tecnologie di microarray glycan sono emersi come uno strumento prezioso per determinare recettore specificità, come più glicani differenti sono macchiati, e vincolante per una vasta gamma di strutture diverse può essere valutata all'interno di un singolo test 25-29. Il legame di IAV a queste strutture fornisce una migliore comprensione delle strutture glicani che IAV riconosce preferenzialmente 30-33. microarrays glycan richiedono piccole quantità di volume di campione per eseguire un esame di legame e utilizza solo piccole quantità di glicani per spot (2 NL). Tuttavia, queste matrici sono tipicamente utilizzati solo per valutare la specificità di glicani recettori. Analisi del virus multipli, o proteine emoagglutinina, in più intervalli di concentrazione può essere proibitivo a causa del numero di vetrini necessari. Inoltre, ad oggi, nessun test di avidità parente è stato sviluppato utilizzando ar glycantecniche di Ray.
Per combinare il requisito del campione basso offerto dalle tecniche di microarray glycan e la sensibilità dei glicani PAA-linked in saggi ELISA-based, abbiamo cercato di sviluppare una serie glycan multi-bene che consentirebbe per l'analisi high-throughput con una risoluzione simile o migliore rispetto al tradizionale test ELISA basato. Allo stesso tempo, abbiamo voluto ridurre al minimo la quantità di prodotti biologici e prodotti chimici giornalista consumati. Il risultato finale è un test di avidità miniaturizzato, appositamente sviluppato per il monitoraggio IAV specificità ed è ugualmente applicabile per valutare altre proteine di legame glycan. Usando un vetrino separato in 48 micro-pozzi da una maschera di teflon, 6 glicani diversi sono macchiati in 6 replicati per bene. La piattaforma microarray offre le stesse tendenze di legame al recettore visti in formato macro ELISA con diversi vantaggi. Questi includono (I) stampa di composto in 6 replicati, utilizzando campione minimo, contro il rivestimento di più righe ina piatto, con 100 ul per pozzetto; (II) più diversi composti analizzati simultaneamente in un unico bene, compresi i controlli; (III) una massiccia diminuzione del volume di incubazione e; (IV) una gamma dinamica più grande con una lettura fluorescente. Una singola diapositiva può essere calcolato come equivalente a 18x piastre a 96 pozzetti.
Con il seguente protocollo, qualsiasi laboratorio capace di fabbricare e analizzare macchiato microarray dovrebbero essere in grado di produrre questo formato ELISA miniaturizzato.
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Protocol
NOTA: Tutte le fasi sono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.
1. Costruzione Array
- Glycan Preparazione e configurazione Piastra
- Preparare uno stock di buffer di stampa. Prima fare 500 ml di una soluzione 150 mM magazzino di sodio fosfato bibasico. Anche fare 50 ml di una soluzione 150 mM magazzino di soluzione di sodio fosfato monobasico. In un pallone, utilizzando una ancoretta e pHmetro magnetico, titolare lentamente la soluzione di fosfato sodico bibasico con la soluzione monobasico fino a raggiungere un pH di 8,5. Aggiungere Tween-20 0,005%.
- Preparare i campioni glycan. Diluire PAA glicani coniugati, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) devono essere diluiti a 100 microgrammi / ml in stampa buffer dalla step1.1.1. glicani monovalenti,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) a 100μM in tampone di stampa dal punto 1.1.1. Infine, preparare i coloranti ammina-funzionalizzati, da utilizzare come marcatori della griglia / luci di atterraggio. macchie marcatori Dye sono stampati a 1 micron.
NOTA: dye Atto488-NHS è utilizzato nelle nostre stampe. Tuttavia, il colorante ammina-funzionalizzata, leggibile da scanner diapositiva è adatta a questo scopo. - Trasferire 10 microlitri di ciascun campione glicani di micropiastre a 384 pozzetti, utilizzati per il robot stampa. Conservare glicani non utilizzate nella soluzione tampone stampa a -20 ° C in tubi sigillati. Tansfer 10 ml di marcatore colorante per la lastra da stampa.
- Stampa
NOTA: Tutte steps che riguardano toccare o spostare le diapositive deve essere fatto con i guanti.- Posizionare Arrayer perni nella testina di stampa secondo la corretta configurazione del layout. Per questo layout utilizzare uno spillo per stampare tutti i campioni e gli array. Stampa i glicani in blocchi di sei, saltando una caratteristica (una caratteristica viene definita come punto unico di un certo composto), su ciascun lato, in modo che punti dello stesso campione non vengono stampate esattamente accanto all'altro.
NOTA: L'utente finale deve decidere la configurazione. - Estrarre i vetrini da sacchetti, scatole aperte, e rimuovere eventuali particelle di polvere o piccoli pezzi di plastica che potrebbero essere sulla loro superficie soffiando purezza del gas ad altissima azoto in ogni diapositiva. Mettere il numero desiderato di diapositive, lato rivestito verso l'alto, sul palco Arrayer.
- Programmare il Arrayer, utilizzare i parametri di 27 punti per ogni visita alla piastra fonte, usando 3 "pre-spot" su vetrini rivestiti di poli-L-lisina, per rimuovere il liquido in eccesso sulla punta dei perni di stampa
- Accendere MPU (Main Power Unit) e unità di controllo del clima. Aprire il software di analisi rivestimenti sul computer.
- Selezionare il layout per la stampa. Selezionare Opzioni → Pin strumento da utilizzare per la stampa della matrice 1 x 1 strumento di stampa - 1 singolo pin. Selezionare la scheda di destinazione → Strumento Array Definizione → Motivo stampa e aggiungere il passo (spot-a-punto di distanza), il numero di righe e colonne per ospitare i campioni da stampare, e il modello di stampa dei campioni (per questo array un 8 x 8 modello di stampa viene utilizzata a 340 micron passo per 7 campioni totali).
- Selezionare Destinazione → Layout diapositiva e programmare la distanza di blocco a blocco per consentire la stampa di ogni matrice replica nel modello di scorrimento 48 pozzetti (4 x 12). Selezionare Source e aggiungere il numero di pickup di origine (1 per ogni campione quando si utilizza 1 pin) (per questa stampa 7 pickup sorgente verrà utilizzato per ospitare 6 dei campioni e 1 marcatore colorante bene).
NOTA: La sorgente dialogo dovrebbe diventare verde per mostrare che il numerodelle visite di origine partite i campioni da stampare nel modello di stampa. - Selezionare Destinazione → piastra di adattamento e Slide Layout e regolare il numero di diapositiva (5 vetrini vengono stampate in un momento per questa stampa con 1 scivolo pre-macchia).
- Rilasciare il vassoio facendo clic sul pulsante T1 per attivare il vassoio e aggiungere il numero desiderato di diapositive al vassoio, prestando particolare attenzione alle posizioni della slitta pre-spotting (blu) e diapositive "reali".
- Mettere vetrini normali su tutte le porte di vuoto rimanenti per bloccare il vuoto e fare clic su OK per attivare il vuoto. Verificare che tutte le diapositive sono tenuti in posizione e fare clic su OK per tornare il vassoio alla posizione iniziale.
- Caricare la lastra di stampa nel supporto targa e garantire la cremagliera sia impostata correttamente in posizione. Fare clic su Vai e consentire il processo di stampa per procedere.
- Stampare i restanti 24 punti in replicati di 6 punti per matrice (4 array / fonte visita).
- Caricare le piastre da 384 pozzettinella stampante e avviare la stampa. Mantenere umidità relativa, durante la stampa, durante la stampa tra il 55 e il 65%. La stampante si arresta dopo la stampa 5 diapositive.
NOTA: Durante il microarray in questo saggio viene stampato in una specifica 8 x 8 modello, diversi robot stampa microarray richiedono attrezzature programmazione specifica per ottenere il layout desiderato. Spetta all'utente finale per determinare il modello più appropriato dato specifiche loro attrezzature.
- Posizionare Arrayer perni nella testina di stampa secondo la corretta configurazione del layout. Per questo layout utilizzare uno spillo per stampare tutti i campioni e gli array. Stampa i glicani in blocchi di sei, saltando una caratteristica (una caratteristica viene definita come punto unico di un certo composto), su ciascun lato, in modo che punti dello stesso campione non vengono stampate esattamente accanto all'altro.
- Umidificazione / immobilizzare
NOTA: Una volta che le diapositive hanno terminato la stampa, subiscono un passo fermo temporaneo, chiamato anche umidificazione. Umidificazione post-stampa contribuisce a omogeneizzare il fissaggio del campione da ri-bagnare le macchie e di garantire il completo blocco.- Mettere i vetrini in una camera umida 100% subito dopo la stampa per un periodo di 30 min. Costruire la camera collocando asciugamani di carta molto umidi piatte sul fondo di un grande piatto di vetro, ponendo i vetrinisu una sorta di cremagliera, come un rack provetta, stampa verso l'alto, e sigillatura con involucro di plastica per intrappolare l'umidità.
- Numero scivola con un alcool / solvente pennarello resistente e conservare in una scatola di essiccazione. Desiccate durante la notte.
- Numerazione, blocco e archiviazione
- Preparare il tampone di bloccaggio - 50 mm etanolammina in 50 mm tampone borato. Innanzitutto, sciogliere l'acido borico, in DDH 2 O, ad una concentrazione finale di 50 mM in un pallone contenente una ancoretta magnetica. Agitare la soluzione con forza su una piastra di agitazione fino a quando tutti i solidi si è dissolto. Mentre mescolando, aggiungere la giusta quantità di etanolammina da una soluzione di 16.54 m stock di raggiungere il desiderato 50 concentrazione mm. Aggiungere idrossido di sodio concentrato per regolare ad un pH finale di 9,2.
- Immergere i vetrini stampati nella soluzione tampone bloccante per 1 ora.
- Dopo 1 ora, lavare i vetrini in DDH 2 O per rimuovere eventuali tracce in eccesso di tampone di bloccaggio.Smaltire tampone di bloccaggio in un contenitore per i rifiuti appropriato.
- Trasferire i vetrini ai titolari di colorazione di vetro e spin secco. array Dry mettendoli in una centrifuga dotata portatarga oscillanti, ad una velocità di 10 xg per 5 min.
- Una volta che i vetrini sono asciutti, possono essere incubate immediatamente o memorizzati. Condizioni di stoccaggio sono -20 ° C in un sacchetto di plastica sigillato.
2. Analisi Glycan Binding Proteins
- Preparare una camera umidificata in cui le matrici da ibridato si adatta. Una camera semplice consiste di una pirofila, a strati sul fondo con tovaglioli di carta umida e una cremagliera, su cui scorre riposerà.
- Utilizzare lectine biotinilati SNA (Sambuca nigra agglutinine) e ECA (Erythrina agglutinine cristagalli) a 10 mg / ml + 2 mg / ml di streptavidina-dye 555, a sondare tampone (PBS + 0,01% Tween-20). Per HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 e A / KY / 07 H1N1, in questo esempio), l'usouna concentrazione iniziale di 20 ug / ml pre-complessato, come descritto in precedenza 34. In breve, fare una HA: Mouse-α-Strep: miscela di capra-α-Mouse-Alexa647 in tampone di bloccaggio (PBS + 3% BSA + 0,01% Tween-20), in un rapporto di 4: molare 1: 2.
NOTA: La matrice viene sondato con lectine di accertare che glicani sono immobilizzati e rilevabile (Figura 1B). - Trasferire la soluzione mix glycan legame proteina-anticorpo di 20 microlitri di una piastra a 384 pozzetti ed incubare su ghiaccio per 30 min. In serie diluire lectina e campioni HA 1: 1, nel loro tampone appropriato, 8 volte, miscelando 10 ml di campione con 10 microlitri di tampone.
- Dispensare 8 ml di campione sulla superficie micro-bene e incubare nella camera di umidificazione sigillata (100% UR) per 90 min.
- Lavare le diapositive uno alla volta tenendo i bordi e tuffandole quattro volte in una miscela di PBS e 0,05% Tween, poi quattro volte in PBS e infine quattro volte in H 2 O. deionizzata utilizzandolo stesso protocollo di essiccazione descritto nel passaggio di blocco, girare le matrici asciugare in una centrifuga per 5 minuti a 10 x g.
3. Le analisi di scansione e di dati
NOTA: I microarray glycan possono essere esplorati allo impostazioni diverse, a seconda del produttore dello scanner per microarray. Variando la potenza del laser e la risoluzione, lo strumento può produrre un'immagine con altrettanti segnali possibili entro la gamma dinamica (Figura 1C).
- Utilizzare uno scanner di diapositive a fluorescenza e la scansione degli array subito dopo incubazione con le proteine di legame glycan. Fare attenzione al fine di garantire la slitta sia correttamente inserita nello strumento di scansione.
- Il software open scansione. Fare clic su Start per aprire il programma. Connettersi a: Scanner → Connect o il pulsante verde nel menu del pannello di navigazione dello scanner.
- Aprire lo sportello del caricatore automatico dello scanner. Collocare i vetrini in fessure caricatore automatico in un ordine specifico. Chiudere la porta caricatore automatico. Click "leggere loader" nel pannello Strumenti di navigazione per rilevare automaticamente le diapositive nello scanner.
- Parametro scansione Set: parametri Scanner → scansione appropriate per l'esperimento (ad esempio 635 potenza laser alta, aumento di rilevazione 50%). Scansione di diapositive: Scanner → di scansione. Selezione del percorso per la creazione di una cartella in cui salvare le immagini di scansione e di nomi scansioni individuali. Fatelo prima della scansione vera e propria. Ripetere l'operazione per ogni singola diapositiva. Fare clic su OK per avviare la scansione.
- Utilizzare il software dello scanner per impostare lo strumento e la scansione delle diapositive. Impostare lo scanner per eseguire la scansione in modo iterativo alla potenza del laser a bassa (5 mW) con l'aumentare impostazioni di guadagno del 25%, 50% e 75%.
NOTA: Le impostazioni possono essere testati e ottimizzati, ma tenere a mente che ogni scansione può eventualmente ridurre l'output di fluorescenza dei coloranti a causa di photobleaching.- l'acquisizione dei dati aperti e software di analisi come il software MAPIX. Fare clic su Start per aprire il programma. Aperto scansione immagine: File → im apertoetà. Aprire il file GAL: Analizza → griglia aperta e selezionare il file GAL appropriato.
- Entrare in modalità blocchi: Modalità immagine → blocchi per spostare la griglia. Utilizzare i marcatori della griglia per impostare la griglia nella posizione appropriata sulla diapositiva. Regolare singoli blocchi, se necessario, in modo che corrisponda la matrice stampata.
- Entrare in modalità macchie: Immagine → Modalità punti per regolare la posizione e le dimensioni delle macchie individuali all'interno del blocco. Una volta che tutti i blocchi e gli spot vengono regolate e al suo posto, misura intensità di segnale da analizzare → calcoli fotometrici. Salvare il file di output.
- Una volta che le diapositive hanno terminato la scansione, le immagini vengono analizzate per i segnali di legame con il programma di elaborazione delle immagini installata (Figura 1D - G). Per l'analisi delle immagini, caricare un file GAL (Lista Array) l'immagine TIFF digitalizzata sopra.
NOTA: Il file GAL contiene sia il modello di layout posto e le identità di ciascuna posizione posto. file GAL per gli array sono created dal software della stampante utilizzando un file di testo delimitato da tabulazioni che contiene le identità dei campioni e la loro posizione nella piastra di origine 384 pozzetti. - Utilizzare le luci di marcatore / atterraggio griglia stampata sui microarray per posizionare correttamente la griglia GAL. macchie individuali possono avere bisogno di essere spostati individualmente, ma una matrice ben stampata, in genere consentono blocchi all'interno della griglia da posizionare con facilità. Dopo il posizionamento della griglia, raccogliere le intensità del punto dal software e salvato come file di testo delimitato da tabulazioni (.txt).
- Utilizzando il programma foglio di calcolo, aprire il file di output dallo scanner. Aprire il file macro appropriato dalla posizione della cartella. Fare clic su Visualizza → Macro → EseguiMacro.
NOTA: Il pre-scritto copierà i dati in uscita prime, rimuovere le righe e le colonne non necessarie, ordinare i dati di esempio, calcolare i valori di fondo del segnale meno medi medi e riportare i valori risultanti a un foglio di lavoro foglio elettronico contenente i grafici per ogni dei sei SAMPles testato sull'array.
- Utilizzando il programma foglio di calcolo, aprire il file di output dallo scanner. Aprire il file macro appropriato dalla posizione della cartella. Fare clic su Visualizza → Macro → EseguiMacro.
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Representative Results
Stampa, scansione e analisi dei dati
Per garantire una stampa corretta, è fondamentale avere il corretto allineamento della griglia macchiato all'interno della maschera teflon, che delinea ogni matrice sul vetrino. Durante la stampa, a causa della natura del rivestimento in teflon, macchie non sono visibili ad occhio nudo sulle slitte MPX. L'attenzione è rivolta quindi alla comparsa dei pre-macchie sui vetrini poli-L-lisina rivestite. Direttamente dopo la stampa, ciascuna slitta deve essere controllato ad occhio per la presenza di ogni composto trovato che è visibile a causa sali del tampone essiccate in loco. Gli array sono controllati per il corretto allineamento dei punti all'interno dei confini di Teflon e corretto numero di caratteristiche macchiato.
I vetrini vengono analizzati in un processo iterativo di bassa alla più alta potenza di scansione per evitare fotobleaching e consentendo il confronto delle HIGla sua avidità di abbassare vincolante avidità proteine, che hanno segnali di uscita superiore e inferiore, rispettivamente. Dopo la scansione, l'intensità di fluorescenza di ogni spot nelle immagini in uscita vengono misurati utilizzando un programma di imaging. Ogni array è sovrapposto con un file di griglia che corrisponde al numero di caratteristiche stampati sulla superficie array (Figura 1D - G). Utilizzando coloranti fluorescenti stampati, i confini dei glicani stampati sono definiti e una maschera che è integrato con l'identità del campione stampato lassoes ciascuna macchia. La maschera di imaging lazo registrerà tutti gli aspetti del punto riflesso (dimensioni, intensità del segnale, coordinate nella griglia, ecc) e l'uscita di queste informazioni in un file di testo delimitato da tabulazioni. Utilizzando il software di tabulazione (foglio di calcolo), i campioni sono ordinati per l'identità e l'intensità del segnale media meno di fondo è in media più di 4 dei 6 punti per ogni campione, lasciando fuori il più alto e quello più basso del segnale come valori anomali. Un grafico a linee di segnale medio mediaminus sfondo viene tracciata contro le concentrazioni di proteine otto applicati alla matrice e contiene una riga per ogni campione. Il grafico output finale viene livellato con un calcolo di regressione non lineare (Figura 1I).
Glycan proteine leganti
Il PAA-array viene utilizzato per valutare la specificità recettoriale di influenza A emoagglutinine dei virus. Un'ulteriore caratteristica della nostra matrice, non presente nel saggio piatto analogo, è l'inclusione di controlli non sialylated nella stessa micro-bene. Per valutare che i composti stampati sono presenti dopo la stampa, pianta comunemente usato lectine con specificità nota sono stati utilizzati. ECA lega al galattosio terminale collegato al β1-4 N-acetil-glucosamina (Galβ1-4GlcNAc o LacNAc) e non legherà se il terminale di galattosio è ricoperto con acido sialico. ECA rileva solo i glicani non sialylated sul nostro arr glycan miniaturizzatoay (Figura 2A). La mancanza di legame su qualsiasi campioni glicani sialylated indica anche che questi sono completamente ricoperti con acido sialico terminale. Per α2-6 acido sialico legato, SNA è stato usato come controllo lectina (Figura 2B). Come previsto, SNA si lega solo per α2-6 acidi sialici legati, ma con notevoli differenze di affinità per ripetizioni di-LacNAc non PAA-linked PAA-linked. Questa differenza riflette la sensibilità dei glicani PAA-linked e permette la discriminazione delle proteine che possono legarsi con bassa avidità. Per α2-3 legata acido sialico, un emoagglutinina H5 derivato da A / Vietnam / 1203-1204 virus che è noto per riconoscere solo α2-3 acidi sialico legati è stato utilizzato 6. Il profilo legame del H5 HA mostra infatti specificità per α2-3 acidi sialici collegati, con avidità elevata per le strutture PAA collegate (Figura 2C). Infine, l'emoagglutinina H1 da un ceppo H1N1 stagionale umano è stato utilizzato che, come previsto, sololegato a α2-6 strutture di acido sialico contenente collegate (Figura 2D).
Figura 1: stampa, scansione e immagine analisi (A) PAA-coniugato 6SLNLN è mostrato come una struttura glicani rappresentante che viene stampato sui vetrini.. (B) una proteina di legame incubazione glycan sull'array glycan multi-pozzo è visualizzato il volume di 8 microlitri che crea una goccia sulla superficie dell'array. (C) Dopo l'incubazione delle proteine di legame glicani dell'array e la scansione in uno scanner di diapositive fluorescenza confocale, un'immagine rappresentativa viene ottenuta. (D) L'immagine viene sovrapposto con una griglia e, utilizzando i marcatori di griglia per il corretto allineamento, i singoli punti possono essere analizzati. (E) Una stretta di un set completo di 8 matrici, in cui una singola proteina di legame glycanè stato analizzato utilizzando otto 1: 1 diluizioni. (F) Una singola matrice, in un unico pozzo è rappresentata; la matrice è demarked dai marcatori della griglia in alto a destra (3 punti) e in basso a sinistra (2 punti), questa proteina di legame glicani lega un singolo composto sulla matrice come replica di sei è chiaramente visibile. (G) La griglia viene mostrata con lacci che circondano specifici punti individuali. (H) il software Imaging calcola i valori di segnale dal file di immagine e genera un file di dati delimitato da tabulazioni. (I) I dati possono essere tabulati in foglio di calcolo o software stastical per creare un grafico in uscita rappresentante. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: uscita di lectine vegetali (ECA, SNA) e IAV Hemagglutinins con differenti specificità (H5 da A / Vietnam / 1203/04 H1 da A / Kentucky / 07). (A) ECA lega LacNAc terminale o Galb1-4GlcNAc specificamente e rileva la presenza dei composti non-sialylated, usato come controllo per emoagglutinine IAV. (B) SNA riconosce solo glicani recanti un acido sialico α2-6 terminale. (C) L'emoagglutinina ricombinante del virus H5N1 (A / Vietnam / 1203/04) ceppo si lega al α2-3 acidi sialici e fornisce un profilo aviaria legame di tipo recettore. (D) L'emoagglutinina ricombinante di un H1N1 stagionale umana (A / Kentucky / 07) si lega ai recettori solo di tipo umano. intensità del segnale fluorescente è stata misurata per ogni punto, e la media intensità meno significa fondo è stato calcolato utilizzando programma di foglio elettronico. Per ogni glycan, l'intensità del segnale medio è calcolata da 6 repliche macchie. I segnali alti e più bassi delle 6 replicati vengono rimossi e il restante 4 replicates vengono utilizzati per calcolare il segnale media, la deviazione standard (SD), e misura errore standard (SEM). I grafici rappresentano lo sfondo del segnale meno media in media per ogni campione e di errore bar sono il valore SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Valutare IAV recettore specificità è un passo importante per l'analisi potenziale pandemia di virus aviari. riconoscimento acido sialico dal virus è legata a diverse proprietà biologiche quali legandosi e rilascio dalla cellula. La conoscenza di quali sono necessarie mutazioni di aminoacidi per i virus aviari per raggiungere α2-6 vincolante e attraversano la barriera di specie consente preparazione alla pandemia. Diversi test sono utilizzati per determinare la specificità del recettore; Tuttavia, tutti hanno i loro inconvenienti, tra avidità solo misurando e non specificità e viceversa.
Qui si descrive un nuovo strumento miniaturizzato basato sul ampiamente utilizzato e accettato ELISA, che utilizza PAA-linked frammenti terminali di glicani più complesse. Utilizzando 4 lectine ben definiti, 2 della centrale e 2 di influenza A virus di origine, dimostriamo che noi manteniamo la specificità e relativa avidità.
Quando si calcola la quantità di riduzione di sostanze chimiche e BiologiCal utilizzato dalla miniaturizzazione ELISA su un chip glycan array, si raggiunge sorprendentemente grandi differenze. In primo luogo, i prodotti biologici; usiamo 10x meno volume di test e utilizziamo 6 composti di prova in 6 replicati; questo può essere calcolato come equivalente di 36x righe in piastre da 96 pozzetti. Il risultato è che usiamo 360x meno biologici. Passaggi critici includono stampa corretta e il rischio di alti sfondi utilizzando leganti glycan non purificati o poveri anticorpi di rilevazione.
I composti utilizzati in questo test, anche se ancora disponibili, non sono facilmente effettuate per sintesi chemo-enzimatica. Utilizzando la tecnologia microarray-stampa, ogni spot è a soli 2 NL, rispetto ai 100 ml per pozzetto di una micropiastra. Stampa di una singola diapositiva contenente 48 pozzetti e 6 composti, in 6 repliche, consumiamo circa 1.152 nl. La stessa procedura di rivestimento in piastre da 96 pozzetti risultati in rivestimento di un totale di 1.842 pozzi con 100 ml di composto nella stessa concentrazione. Pertanto, magliettesi aggravi rispetto al saggio piatto, raggiungiamo una riduzione notevole di 1,500x. Quindi, in totale, i biologici sono ridotti di 360 volte e il consumo glycan da 1.500 volte. Utilizzando i gestori di liquidi robotici, prevediamo che la maggior parte passi potrebbero essere automatizzati, permettendo l'intero saggio essere utilizzato come uno schermo ad alta produttività.
Anche se microarray di stampa e successive analisi di immagini richiedono macchinari e utensili speciali, questi strumenti non sono rari e sono presenti in molte università e istituti. La stampa è diretta e non richiede alterazioni chimiche. Pertanto, riteniamo che, con questo minima quantità di composti e semplice tecnica di stampa, questo test potrebbe essere più generalmente applicabile. Come si riduce il volume di incubazione, i costi di anticorpi e biologici preziosi, questa tecnica renderà più fattibile per i laboratori con risorse limitate per valutare la specificità di IAV o di altre proteine di legame glycan con alta fedeltà, pur mantenendo un costo inferioreS.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Fondo Scripps Microarray Core e un contratto dai Centers for Disease Control (JCP). RPdV è un destinatario di una borsa di Rubicon e VENI dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO). Il Consorzio per la Glycomics funzionali (http://www.functionalglycomics.org/) finanziato dalla NIGMS concessione GM62116 (JCP) ha fornito diversi glicani utilizzati in questo studio. Questa è la pubblicazione 29113 da The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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