This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.
microscopie électronique Cryo-fracture a été une technique importante dans la recherche ultrastructurale depuis plus de 40 ans. Cependant, le manque de moyens efficaces pour étudier la composition moléculaire des membranes a produit une baisse significative de son utilisation. Récemment, il y a eu un renouveau majeur dans le gel-fracture microscopie électronique grâce au développement des moyens efficaces pour révéler les protéines membranaires intégrales par immunomarquage. Une de ces méthodes est connu comme détergent solubilisé Cryo-fracture Replica immunomarquage (FRIL).
La combinaison de la technique avec FRIL optogénétique permet une analyse corrélative des propriétés structurales et fonctionnelles des synapses centrales. En utilisant cette approche, il est possible d'identifier et de caractériser les neurones à la fois avant et post-synaptiques par leur expression respective d'un channelrhodopsin marqués et des marqueurs moléculaires spécifiques. L'aspect distinctif de la spécialisation de la membrane postsynaptique de glutamatergique synapses permet en outre, lors de l'étiquetage des récepteurs ionotropiques du glutamate, pour quantifier et analyser la répartition intrasynaptic de ces récepteurs. Ici, nous donnons une description étape par étape des procédures requises pour préparer des répliques apparié et comment les immunolabel. Nous allons également discuter des mises en garde et les limites de la technique de FRIL, en particulier ceux associés à des biais d'échantillonnage potentiels. La reproductibilité élevée et la polyvalence de la technique de FRIL, lorsqu'il est combiné avec optogénétique, offre une approche très puissante pour la caractérisation des différents aspects de la transmission synaptique à microcircuits neuronaux identifiés dans le cerveau.
Ici, nous fournissons un exemple comment cette approche a été utilisée pour mieux comprendre les relations structure-fonction des synapses excitateurs à neurones des masses de cellules intercalées de l'amygdale de la souris. En particulier, nous avons étudié l'expression des récepteurs ionotropiques du glutamate au niveau des entrées identifiées ouiginated du intralaminaire postérieur du thalamus et des noyaux géniculés médiales. Ces synapses ont été montrés pour relayer l'information sensorielle pertinente pour l'apprentissage de la peur et de subir des changements en plastique sur la peur conditionné.
La définition de l'architecture fonctionnelle de biomembranes à l'échelle nanométrique a été contestée au cours des dernières années par le développement d'un certain nombre de techniques de immunomarquage appropriés pour la microscopie électronique à transmission. Cependant, ces techniques, par exemple, pré- et post-enrobage immunomarquage, ont un certain nombre de limitations importantes, qui comprennent une mauvaise détection des antigènes et / ou l' évaluation quantitative limitée des protéines membranaires. Ces limitations deviennent particulièrement critique dans l'enquête sur la structure fine du système nerveux, qui se caractérise par un haut degré de diversité de cellules et synapse hétérogénéité. Résultats Cette hétérogénéité de la diversité à la fois structurelle et fonctionnelle dicté par les éléments pré- et post-synaptiques et par l'expression différentielle, l'enrichissement, ou l'interaction des protéines de signalisation, tels que les récepteurs, les transporteurs et les molécules effectrices.
Une nouvelle approche pour immunolabe directeling des protéines membranaires intégrales ou réticulés dans cryofracturation répliques détergentes-solubilisé (FRIL) a été initialement introduit par Fujimoto il y a deux décennies 1. Cette méthode originale avait cependant plusieurs limites, à savoir, la fragmentation sévère des répliques, qui ont entravé les corrélations significatives des molécules marquées avec des cellules mappés individuellement dans des tissus complexes comme le cerveau. Il y a environ 10 ans, Shigemoto et Fukazawa progressivement amélioré la technique 2. Cela a été de pair avec les efforts d'un autre groupe de scientifiques dans les laboratoires Boulder de l'Université d' État du Colorado, qui ont amélioré de manière significative aussi la technique, en particulier pour l'étude des jonctions lacunaires 3.
L'amélioration des protocoles de congélation-fracturation et machines, ainsi que l'introduction de congélation rapide (sous haute pression), permet désormais aux chercheurs de produire des répliques ininterrompue de spécimens de taille relativement grande et salutdes images de qualité gh de la plupart des composants cellulaires sans les limitations et les artefacts produits par de fortes fixations chimiques.
La technique FRIL offre le grand avantage d'une très quantitative identification in situ d'une ou plusieurs protéines (simultanément) dans histologiquement cartographiée et des cellules cytologiquement identifiés dans les tissus complexes , tels que le cerveau, avec l'avantage supplémentaire d'une vue plane de pré- et post – synaptique éléments dans une seule réplique. Par conséquent, la technique de FRIL, malgré ses nombreux obstacles techniques, tient la promesse d'un certain nombre de percées scientifiques très importantes, en particulier pour la corrélation des propriétés structurelles et fonctionnelles des synapses individuelles. Au cours des dernières décennies, un grand nombre d'informations ont été obtenues sur la structure, moléculaire forment, et la fonction physiologique des synapses; encore synapses sont morphologiquement et moléculairement très diverses selon le pa pré et post-synaptiquelouer neurones 4. Seulement pour une poignée de types de synapses étaient des études structure-fonction accomplies jusqu'à présent 5-7. Cela est principalement dû à des contraintes techniques qui ont empêché une identification précise de la nature des éléments pré- et post-synaptiques.
L' analyse ultrastructurale a fourni des renseignements cruciaux sur la variabilité des spécialisations membranaires postsynaptiques à travers des contacts synaptiques distincts à la fois en termes de taille synaptique et contenu dans les récepteurs des neurotransmetteurs 6, qui a un grand impact sur la force et la plasticité de la transmission synaptique. En outre, un grand corps de recherche indique que le nombre de récepteurs ionotropiques du glutamate exprimés à différents types de synapse est régulée de façon afferent- et dépendante de la cible 7-10.
Ici, une méthode est décrite qui permet l'analyse de la composition de la structure et le récepteur des spécialisations membranaires postsynaptiques avec Defined éléments et la fonction présynaptique. Cette approche tire profit de l'expression présynaptique des protéines d'algues développées récemment sensibles à la lumière, tels que Channelrhodopsin2 (CHR2) et de la technique de FRIL pour analyser le schéma d'expression postsynaptique d'α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique l'acide (AMPA-R) et de N-méthyl-D-aspartate (NMDA-R), les récepteurs du glutamate. Cela est démontré au niveau des synapses formées par des axones provenant des postérieurs noyaux géniculés thalamique-médial (PIN / MGN) sur les neurones des masses de cellules intercalées de l'amygdale (ITC). Les neurones de l' ITC sont de petites cellules GABAergiques épineux organisés en grappes entourant le complexe amygdalien basolatéral (BLA) 11, 12. Neurones ITC sont connus pour recevoir des entrées excitateurs de BLA neurones principaux et de cibler le noyau central (ACÉ), fonctionnant ainsi comme une porte inhibitrice pour le flux d' informations entre la BLA et aCÉ 12-15.
Récemment, nous avons démontré que ITNeurones C situés dans le cluster médio-dorsale entre BLA et aCÉ reçoivent également des entrées excitatrices directes et convergentes des régions corticales thalamiques et temporelles sensorielles, qui sont modifiés sur la peur d' apprentissage au cours pavlovien auditive conditionnement de la peur 16. La peur conditionné est l'une des formes les mieux comprises de l'apprentissage associatif en termes de mécanismes cérébraux. En conditionnement de la peur, un stimulus conditionné initialement neutre (CS, par exemple, une tonalité) est associé à un stimulus aversif inconditionnée (Etats – Unis, par exemple, un choc de pied doux) résultant en une association CS-US et conditionnés réaction de peur 17, 18. Excitateurs les entrées des deux régions thalamiques et du néocortex, qui portent des informations représentant le SC et, respectivement, étaient connues pour converger vers les neurones pyramidaux du noyau latéral de l'amygdale (lA) et de subir une plasticité 19. Nos travaux antérieurs ont révélé que des informations d'entrée sensorielle est également en parallèle relayé aux neurones de l'ITC <sup> 16.
En tant que première étape vers une analyse moléculaire mécaniste de l'entrée sensorielle individuelle synapses sur les neurones du CCI, nous avons utilisé un virus adéno-associé (AAV) pour exprimer ChR2 marqué par la protéine fluorescente jaune (YFP). AAV a été injecté dans le PIN / MGN et les terminaisons axonales ont été identifiés par leur expression de CHR2-YFP. Nous avons utilisé les deux faces générées par la technique de FRIL pour évaluer la densité de AMPA-R postsynaptiques et NMDA-R au niveau des synapses formées avec les neurones de l'ITC par les terminaisons axonales PIN / MGN.
microscopie électronique Cryo-fracture a été une technique importante dans la recherche ultrastructurale depuis plus de 40 ans. Cependant, le manque de moyens efficaces pour étudier la composition moléculaire des membranes a produit une baisse significative de son utilisation. Récemment, il y a eu un renouveau majeur dans la microscopie électronique cryofracturation en raison du développement de moyens efficaces pour révéler les protéines membranaires intégrales par marquage immunologique 1, 2, à savoir la technique de FRIL.
La technique de FRIL possède plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes ultrastructurales immunomarquage. Tout d'abord, les protéines sont facilement accessibles aux anticorps augmentant la sensibilité. En second lieu, l'exposition d'une grande partie des spécialisations de la membrane plasmique, tels que la membrane postsynaptique, sur la surface à deux dimensions de la réplique permet l'inspection de la distribution spatiale et de la contiguïté physique de molécules d'intérêt sans reconstruction laborieuse et prend du temps de serisections al ultraminces. En troisième lieu, la disponibilité des deux moitiés de la membrane plasmatique augmente le nombre de protéines qui peuvent être marqués pour chaque structure individuelle, des anticorps appropriés fournis sont disponibles. Lors de la fracturation, la face hydrophobe de la membrane de séparation est revêtue avec du carbone-platine qui enchâsse domaines protéiques restant sur la surface fracturée. Ceci empêche l'accès des anticorps dirigés contre des antigènes dans ces domaines. Par exemple sur le P-face d'une réplique seulement épitopes tournée vers l'espace protoplasmique peuvent être détectés par des anticorps, alors que sur le E-face seulement épitopes face à l'espace exoplasmique peut être lié par des anticorps (voir la figure 2).
D'autre part, la technique de FRIL souffre également de certaines limitations 2. Les fractures se produisent de façon aléatoire, il peut être difficile de cibler des cellules ou des structures spécifiques. Cela peut également conduire à un biais d'échantillonnage, par exemple, dans la collecte de synapse, compte tenu de la probabilité différente de fracturing le long de la membrane des structures avec une courbure différente (par exemple, par rapport à des épines des arbres). En outre, la répartition des protéines de la membrane à une des deux faces est imprévisible. Par conséquent, la distribution d'une protéine à la P-face ou E-face, en particulier pour les études quantitatives, doit être soigneusement examinée en utilisant des anticorps réactifs à des domaines intracellulaires et extracellulaires. Enfin, l'identification dans la réplique de certaines structures, telles que les terminaisons axonales présynaptiques, peut être difficile quand basée uniquement sur des caractéristiques morphologiques. Cependant, l'utilisation d'anticorps spécifiques pour des protéines marqueurs ou la transduction des protéines membranaires intégrales composées ou des canaux en utilisant des vecteurs viraux offre des outils supplémentaires pour faciliter l'identification des membranes fracturés. Par exemple, cette étude a profité de la transduction du ChR2-YFP dans les neurones thalamiques pour identifier leurs efférents axonales dans l'amygdale ou l'étiquetage pour les récepteurs μ-opioïdes pour révéler me postsynaptiquembranes des neurones de l'ITC.
Afin de réaliser la technique de FRIL avec succès, une attention particulière doit être prise au sujet de la fixation des tissus. fixation du tissu Strong (> 2% de paraformaldehyde) peut se traduire par un taux élevé de fractures transversales et une diminution de la sensibilité à l'étiquetage. D'un autre côté, les fixations faibles rendent la manipulation des tissus et la préparation (par exemple, la coupe de sections) difficile. Il est également important de contrôler que l'épaisseur des blocs taillés correspond à l'épaisseur de la bande à double face. Si l'épaisseur de l'échantillon est inférieure à celle de la bande, les surfaces du tissu peuvent ne pas attacher à la surface des deux supports métalliques, par conséquent, les échantillons congelés ne sont pas fracturé. Si le tissu est plus épais, il sera compressé avec des distorsions structurelles inévitables lorsque le sandwich des deux supports en cuivre est effectuée. La température à laquelle l'échantillon est fracturé (dans ce protocole, -115 ° C) joue également un rôle importantsur la structure de la réplique. Des températures plus élevées peuvent produire un taux d'artefacts tels que la condensation ultérieure de la vapeur d'eau sur la surface du tissu avant ou pendant l'évaporation. Des températures plus basses (<-125 ° C) peut augmenter le risque de séparation du matériau lors de la fracturation. Ce matériau peut tomber sur la surface de l'échantillon ou de rester connecté à elle. Ces flocons de matériau sont également revêtu et contrasté produisant des taches sombres sur l'image. Fractures à des températures plus basses peut également affecter la fréquence des fractures transversales particulièrement pour les petites structures fines telles que les épines dendritiques. Une étape critique en outre dans la préparation de répliques est le détergent digestion. Si la digestion est incomplète, le tissu non digérés apparaît comme des taches sombres sur la réplique, confondant l'analyse de la structure au TEM. En outre, le tissu non digérés peut non spécifique des anticorps de piégeage ou se lient, en augmentant l'étiquetage de fond. D'autre part, l'utilisation d'un détergents à la digestion du tissu peut dénaturer les molécules associées à la réplique, modifiant leurs structures secondaires et tertiaires. Par conséquent, pour certains antigènes, il pourrait être nécessaire de diluer progressivement la concentration de SDS avec des étapes de lavage supplémentaires.
Pour les immuno-marquage, la disponibilité de différentes tailles de particules d'or conjuguée à des anticorps secondaires permet de détecter en même temps, mais que de manière qualitative, de multiples protéines, même dans des microdomaines particuliers de la membrane plasmique, tels que la spécialisation postsynaptique. Toutefois, en raison de l'encombrement stérique, les études quantitatives sont généralement limitées à la détection d'une seule molécule. La taille de la particule d'or peut également affecter l'efficacité de marquage.
Pour l'interprétation de l'étiquetage en FRIL, il faut garder à l'esprit que la particule de immunomarquage peut être situé n'importe où dans un hémisphère avec un rayon de 20-25 nm de l'antigène en raison de la forme complexe soupleed par l'anticorps primaire et secondaire 26. Pour de plus amples informations sur la théorie et la pratique de FRIL et techniques connexes, nous renvoyons le lecteur aussi à d' autres articles méthodologiques 27, 28.
La technique de FRIL a récemment été utilisé pour des analyses quantitatives à haute résolution de la localisation des récepteurs du glutamate dans les populations de synapse diverses 29, 30. En outre, la sensibilité de détection de la technique de FRIL pour AMPA-R a été estimée aussi élevée que une particule immunomarquage par une AMPA fonctionnelle canal -R 29. Ainsi, cette approche est globalement très utile de quantifier et d'analyser le profil d'expression postsynaptique de AMPA-R et NMDA-R au niveau des synapses centrales. Ici, nous avons démontré son applicabilité au niveau des synapses PIN / MGN-ITC, un site très probablement important pour nous relayer l'information au cours de conditionnement de la peur. En utilisant un anticorps dirigé contre les résidus d'acides aminés hautement conservés extracellulaires des sous-unités du récepteur de l'AMPA GluA1-GluA4, nous avons trouvé une répartition uniforme des particules d'or dans les grappes IMP correspondant aux spécialisations membranaires postsynaptiques. La densité de AMPA-R dans les épines de l'ITC était significativement plus élevée par rapport aux synapses d'arbre ciblés par PIN / MGN afférences thalamiques. Dans les deux synapses de la colonne vertébrale et de l' arbre, une corrélation positive entre l' étiquetage des AMPA-R et la zone postsynaptique a été détectée, une caractéristique commune à d' autres synapses glutamatergiques 25. La faible variance de la densité de AMPA-R en synapses PIN / MGN-ITC indique une distribution homogène similaire à d' autres synapses formées par efférents thalamiques 7, mais différent de synapses corticales 25. A l'inverse, la densité de NMDA-R était plus variable et ne différait pas entre la colonne vertébrale et l'arbre synapses suggérant une régulation différente de AMPA-R. À l'avenir, la grande reproductibilité de la technique de FRIL permettra non seulement d'évaluer la composition moléculaire basale des synapses centrales, mais peut faciliter la détection de changements en nombre de récepteurs ionotropiques du glutamate et de la distribution subsynaptic après l' apprentissage de la peur, en complément des enregistrements ex-vivo des propriétés pré- et post – synaptiques de ces entrées.
En conclusion, cette approche pourrait être utilisée par d'autres chercheurs pour mieux comprendre les relations structure-fonction des synapses excitateurs spécifiques entrée dans de nombreux autres circuits neuronaux dans lequel démêlage l'origine des entrées et de la nature et la composition des éléments postsynaptiques est cruciale mais problématique .
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
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Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue preparation | |||
Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
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Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High-pressure Freezing | |||
Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
Chamois skin | Household supply store | ||
Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Aceton | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Freeze-fracture and Replication | |||
Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 – 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunolabelling | |||
BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAG5 | |
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAR15 | |
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EM analysis | |||
Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |