Abstract
Freeze-breuk elektronenmicroscopie is een belangrijke techniek in de ultrastructurele onderzoek al meer dan 40 jaar. Echter, het gebrek aan effectieve middelen om de moleculaire samenstelling van membranen bestuderen een significante daling in het gebruik. Onlangs is er een grote opleving vries-breuk elektronenmicroscopie dankzij de ontwikkeling van effectieve manieren om integrale membraaneiwitten openbaren door immunogold labeling geweest. Eén van deze werkwijzen is bekend als detergens gesolubiliseerde Freeze-breuk Replica immunokleuring (FRIL).
De combinatie van de FRIL techniek optogenetics laat een gecorreleerde analyse van de structurele en functionele eigenschappen van de centrale synapsen. Met deze aanpak kan men identificeren en karakteriseren van zowel pre- en postsynaptische neuronen door hun expressie van een gelabeld channelrhodopsin en specifieke moleculaire merkers. De opvallende verschijning van de postsynaptische membraan specialisatie van glutamaterge synapsen maakt verder, bij het kenmerken van ionotrope glutamaatreceptoren, te kwantificeren en analyseren intrasynaptic verdeling van deze receptoren. Hier geven we een stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om gepaarde replica's en hoe ze te immunolabel bereiden procedures. We zullen ook praten over de valkuilen en de beperkingen van de FRIL-techniek, met name die in verband met potentiële sampling vooroordelen. De hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid van de FRIL techniek in combinatie met optogenetics, biedt een zeer krachtige benadering voor de karakterisering van de verschillende aspecten van synaptische transmissie bij die neuronale microcircuits in de hersenen.
Hier geven we een voorbeeld hoe deze benadering werd gebruikt om inzicht in de structuur-functie relatie van exciterende synapsen krijgen op neuronen van de geïntercaleerde celmassa's van de muis amygdala. In het bijzonder hebben we de expressie van ionotrope glutamaatreceptoren onderzocht op geïdentificeerde ingangen ofiginated van de thalamus posterior intra-laminaire en mediale geniculate kernen. Deze synapsen werden getoond aan zintuiglijke informatie doorgeven die relevant zijn voor angst leren en om plastische veranderingen op angst conditionering ondergaan.
Introduction
De definitie van de functionele architectuur van biomembranen op nanometerschaal is de laatste jaren uitgedaagd door de ontwikkeling van een aantal immunokleuring technieken geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. Maar deze technieken, bijvoorbeeld voor en na de inbedding immunogold, hebben een aantal belangrijke beperkingen, die slechte detectie van antigenen en / of beperkte kwantitatieve beoordeling van membraangebonden eiwitten bevatten. Deze beperkingen worden bijzonder kritisch bij het onderzoek van de fijnstructuur van het zenuwstelsel, die wordt gekenmerkt door een hoge mate van cel- diversiteit en heterogeniteit synaps. Deze heterogeniteit resultaten van beide structurele en functionele diversiteit bepaald door de pre- en postsynaptische elementen en de differentiële expressie, verrijking, of interactie van signalering eiwitten, bijvoorbeeld receptoren, transporters en effectormoleculen.
Een nieuwe aanpak voor de directe immunolabeling van integrale of verknoopte membraaneiwitten in detergens gesolubiliseerde vries-breuk replica (FRIL) werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Fujimoto twintig jaar geleden 1. Deze originele methode heeft echter een aantal beperkingen, dat wil zeggen, ernstige fragmentatie replica die betekenisvolle correlaties van gelabelde moleculen met individueel toegewezen cellen in complexe weefsels zoals de hersenen belemmerd. Ongeveer 10 jaar geleden, en Shigemoto Fukazawa geleidelijk de techniek 2 verbeterd. Dit ging gepaard met inzet van een andere groep wetenschappers bij Boulder laboratoria van de Colorado State University, die ook aanzienlijk de techniek verbeterd, met name voor de studie van gap junctions 3.
De verbetering in vorst-breken protocollen en machines, alsmede de invoering van snel invriezen (onder hoge druk), kan nu onderzoekers replica ononderbroken produceren van specimens van relatief grote omvang en high kwaliteit beelden van de meeste cellulaire componenten zonder de beperkingen en artefacten geproduceerd door sterke chemische fixaties.
De FRIL techniek biedt het grote voordeel van een zeer kwantitatieve in situ identificatie van één of meer eiwitten (gelijktijdig) in kaart gebracht histologisch en cytologisch geïdentificeerde cellen in complex weefsels zoals de hersenen, met als bijkomend voordeel een bovenaanzicht van pre- en postsynaptische elementen in een replica. Daarom is de FRIL techniek, ondanks de vele technische obstakels, belooft een aantal zeer belangrijke wetenschappelijke doorbraken, met name voor de correlatie van de structurele en functionele eigenschappen van individuele synapsen. Gedurende de laatste decennia, heeft een groot deel van de informatie is verkregen over de structuur, de moleculaire make-up, en de fysiologische functie van synapsen; Nog synapsen morfologisch en moleculair zeer divers afhankelijk van de pre- en postsynaptische pahuur neuronen 4. Alleen voor een handvol synaps types waren structuur-functie studies tot nu toe 5-7 bereikt. Dit was vooral te wijten aan technische beperkingen die een nauwkeurige identificatie van de aard van de pre- en postsynaptische elementen voorkomen.
Ultrastructurele analyse kritische inzichten opgeleverd in de variabiliteit van postsynaptische membraan specialisaties over verschillende synaptische contacten zowel qua synaptische omvang en inhoud neurotransmitterreceptoren 6, die een grote invloed op de sterkte en de plasticiteit van synaptische transmissie. Verder is een groot aantal onderzoeken blijkt dat het aantal ionotrope glutamaatreceptoren uitgedrukt op verschillende soorten synaps is geregeld in een afferent- en target-afhankelijke manier 7-10.
Hier wordt een methode geschetst dat de analyse van de structuur en de samenstelling van de receptor postsynaptische membraan specialisaties mogelijk maakt met definiërend presynaptische elementen en functie. Deze benadering maakt gebruik van presynaptische expressie van recent ontwikkelde lichtgevoelige algen eiwitten, zoals Channelrhodopsin2 (ChR2), en de FRIL techniek om het patroon van postsynaptische expressie van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic analyseren zuur (AMPA-R's) en N-methyl-D-aspartaat (NMDA-R's) glutamaatreceptoren. Dit blijkt bij synapsen gevormd door axonen afkomstig van het achterste mediale geniculate thalamische kernen (PIN / MGN) op neuronen van de geïntercaleerde celmassa's van de amygdala (ITC). ITC neuronen zijn klein stekelige GABAergic cellen georganiseerd in clusters rond het basolaterale amygdalae complex (BLA) 11, 12. ITC neuronen is bekend dat prikkelende input te ontvangen van BLA hoofdsom neuronen en te richten op de centrale kern (CEA), waardoor het als een remmende gate voor de informatiestroom tussen de BLA en Cea 12-15.
Onlangs hebben we aangetoond dat hetC neuronen gelegen in het medio-dorsale cluster tussen BLA en CEA krijgen ook direct en convergente prikkelende input van sensorische thalamus en temporale corticale gebieden, die worden aangepast aan het leren van angst tijdens Pavlov auditieve vreesconditionering 16. Vreesconditionering is één van de best begrepen vormen van associatief leren qua hersenen mechanismen. In vreesconditionering, een aanvankelijk neutraal geconditioneerde stimulus (CS, bijvoorbeeld een toon) is gekoppeld aan een aversieve ongeconditioneerde stimulus (US, bijvoorbeeld een milde voet shock) resulteert in een CS-Amerikaanse vereniging en geconditioneerde angstreactie 17, 18. Prikkelende inbreng van zowel thalamische en neocortical gebieden, die representeert de KS en VS dragen, respectievelijk, waren bekend te convergeren op piramidale neuronen van de laterale nucleus van de amygdala (LA) en plasticiteit 19 ondergaan. Onze eerdere werk is gebleken dat zintuiglijke informatie is ook in parallel doorgegeven aan ITC neuronen Als eerste stap op weg naar een mechanistische moleculaire analyse van individuele zintuiglijke input synapsen op ITC neuronen, gebruikten we een adeno-geassocieerd virus (AAV) uit te drukken ChR2 gelabeld met de gele fluorescerende eiwit (YFP). De AAV werd geïnjecteerd in de PIN / MGN en de axon terminals werden geïdentificeerd door hun expressie van ChR2-YFP. We gebruikten beide vlakken die door de FRIL techniek om de dichtheid van postsynaptische AMPA-R's en NMDA-Rs beoordeeld op synapsen gevormd met ITC neuronen PIN / MGN axon terminals.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Regierungspraesidium Tübingen, deelstaat Baden-Württemberg, Duitsland, en door de Oostenrijkse Animal Experimentation Ethics Board, en waren in overeenstemming met de EU-richtlijn inzake het gebruik van dieren in het onderzoek.
1. stereotactische injecties van AAV-Channelrhodopsin2-YFP
OPMERKING: Stereotactische injecties volgens een eerder gepubliceerd protocol 20 uitgevoerd.
- Bereid steriele instrumenten door ze te verwarmen op 180 ° C gedurende 1,5 uur.
- Trek scherpe (~ 50 micrometer diameter) glazen pipetten voor injecties met behulp van een horizontale micro-elektrode trekker ingesteld met de volgende parameters: Warmte = Ramp waarde - 20, Pull = 0, Velocity = 100, Time = 200, Druk = 200.
OPMERKING: Ramp waarde moet worden bepaald voor elke partij van gekochte glas pipetten volgens de instructies van de fabrikant micropipet trekker. - Premix 1 pl virusoplossing en 0,2 pl 0,1% snelle groene oplossing (voor een betere zichtbaarheid van de oplossing in de glazen pipet) in steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Vul het glas pipet met behulp van een 10 ul pipet en gel-fil tips. Voor de virale construct, gebruiken rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotype 2/9).
- Verdoven muis met behulp van een klein dier anesthesie-apparaat (3% isofluraan in zuurstof voor inductie). Gebruiken. Voor dit onderzoek gebruiken 3 wild-type muizen ~ 6 weken oud.
- Scheren hoofd tussen de oren en de ogen en te desinfecteren met een povidonjood-gebaseerde oplossing.
- Breng een oogzalf om uitdroging van de ogen tijdens de anesthesie te voorkomen. Subcutaan injecteren muis met analgetische (meloxicam-based, 0,1 ml van een 5 mg / ml oplossing).
- Plaats de muis in stereotactische frame en anesthesie te onderhouden via een gas anesthesie-apparaat (2% isofluraan in zuurstof voor onderhoud). Controleer verdoving diepte door het ontbreken van een ledemaat terugtrekkingreflex voordat u verder gaat.
- Handhaven steriele omstandigheden zo goed mogelijk gedurende de gehele chirurgische procedure. Draag een wegwerp face-masker, een chirurgische toga en handschoenen.
- Maak een incisie in de huid van ongeveer 1 cm op de top van het hoofd met een schaar 20. Trek de huid naar de in met behulp van stompe tang, bevestig met klemmen om de schedel oppervlak en schoon schedel bloot te leggen met H 2 O 2.
- Mark injectieplaatsen op de schedel met behulp van een fijne punt permanent marker. Boor een klein gaatje (ongeveer 1 mm in diameter) in de schedel op de gemarkeerde plaats. Voor eenzijdige PIN / MGN injectie in deze stud, gebruikt u de volgende coördinaten: van bregma (mm): 3,0 posterior, lateraal ± 1,8, ventrale 3.8.
- Mount gevulde glazen pipet op stereotactische kader verbonden met een druk injectie-inrichting en breng de pipet positie bregma.
- Breek het topje van de glazen pipet met behulp van fijne rechte tip tang. Zorg ervoor dat de pipet tip is open op toepastga paar drukpulsen en het observeren van de extrusie van druppels van het virus oplossing.
- Ga naar de gewenste injectie coördinaten en injecteer de helft van de pipet inhoud (~ 0,5 ul) met de volgende instellingen van de druk injectie apparaat: druk 20 psi, gemiddelde pulslengte 30 ms, gemiddelde aantal pulsen 50.
- Laat pipet in de plaats voor ~ 1 min voor langzaam (1 mm / min) het terugtrekken.
- Clean schedel met PBS (pH 7,4) en verwijder de klemmen. Trek de huid samen, en hechtdraad de incisie (3-4 knopen). Toepassen ontsmettingsmiddel (povidonjood basis) rond de wond.
- Stop de anesthesie en niet de muis niet onbeheerd achter te laten tot helemaal wakker. Houd muizen single-gehuisvest. Postoperatief, blijven de gezondheidstoestand te volgen; indien nodig toedienen pijnstiller.
- Houd dieren voor 4 weken voor de hersenen fixatie op het juiste niveau van virale meningsuiting te waarborgen.
2. Specimen Voorbereiding
- Fixatie Brain </ Strong>
- Bereiding van het fixeermiddel
- Voor 1 liter fixatief, weegt 10 g paraformaldehyde en voeg deze toe aan 300 ml gedemineraliseerd H 2 O. Verwarm tot 55-60 ºC voor ~ 10 minuten onder voortdurend roeren.
- Schakel het vuur en voeg 7-8 druppels 4 N NaOH. De oplossing moet helder in ~ 10 minuten geworden.
- Laten afkoelen tot kamertemperatuur, voeg 150 ml van een verzadigde oplossing van Picrinezuur en breng het naar 500 ml met gedeïoniseerd H2O
- Voeg 500 ml 0,2 M fosfaatbuffer (PB). Filter met filter papier. Pas de pH op 7,4 met NaOH.
- Koel de fixerende tot 6 ° C, op te slaan in donkere glazen flessen voor niet meer dan één dag bij 6 ºC.
- transcardiale perfusie
- Verdoven muizen met een intraperitoneale injectie van thiopental (120 mg / kg lichaamsgewicht). Zorg ervoor dat het dier is diep verdoofd door het controleren van het pedaal terugtrekking reflex, die moet worden afwezig. Leg het dier op zijn rug op een perfusie tafel met de vier ledematen vastgebonden.
- Open de buikwand lengterichting met stompe-end schaar en maken twee extra bezuinigingen zijdelings langs de caudale rand van de ribbenkast, het membraan bloot te leggen. Knip het middenrif en snijd de borstwand aan de osteocartilageneous grens aan beide zijden. Til het caudale einde van de centrale plak thoraxwand met het borstbeen naar het hart bloot te leggen.
- Verwijder het pericardium, een kleine nauwkeurige snede in de top van de linkerventrikel de canule van de perfusie inrichting toe. Gebruik een stompe canule met een inwendige diameter van 0,6 mm. Passeert de canule zachtjes door het ventrikel tot de punt in de opgaande aorta verschijnt en zet de canule met een klem. Het bloed en perfusates om uit het bloed mogelijk maken een snede in de rechterboezem.
- Perfuseren muizen transcardiaal behulp van een peristaltische pomp met een stroomsnelheidvan 5 ml / min eerst met PBS (25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4) gedurende ongeveer 1 minuut, gevolgd door ijs gekoelde fixatief 7 min.
- Na fixatie, scheiden de muis hoofd met een schaar en knip dan de huid door de middellijn van nek tot neus. Verwijder de spier aan de schedel volledig bloot te leggen.
- Met behulp van een scherpe schaar, maak een longitudinale snede door de occipitale en interparietal beenderen vanaf het foramen magnum. Met behulp van fijne pincet verwijder deze beenderen om de hele kleine hersenen bloot te leggen. Maak dan een andere longitudinale snede door de pariëtale en frontale beenderen tot het neusbeen en verwijder ze met een pincet om de hele hersenen bloot te leggen.
- Met behulp van een spatel verwijderen van de hersenen zonder het te beschadigen en plaats het in ijskoude 0,1 M PB.
- Bereiding van het fixeermiddel
- Snijden en trimmen van de monsters
- Snijd een coronale blok van ongeveer 5-6 mm met scheermesjes met het aandachtsgebied. Lijm het op de houder vande vibroslicer met een cyanoacrylaatlijm. Richt het weefsel blok, zodat de neocortex wordt geconfronteerd met de vibrerende mes. Segment coronale secties gemaakt met de amygdala, bij 140 urn met de vibroslicer (figuur 1A) in ijskoude 0,1 M PB en verzamelen in een 6-putjes in dezelfde buffer.
- Onder een stereomicroscoop, trim uit de regio van belang (hier, de medio-dorsale paracapsular cluster van de ITC, zie figuur 1B) van de snee. Doe dit in een petrischaal gecoat met siliconen elastomeer en gevuld met 0,1 M PB, middels een oftalmische scalpel. Zorg ervoor dat de bijgesneden blokken passen in het gat van de afstandhouder (ongeveer 1,5 mm) (Figuur 1B).
- Verplaats de getrimde blokken op cryoprotection oplossing (30% glycerol in 0,1 M PB) O / N bij 6 ° C.
3. High Pressure Invriezen
OPMERKING: De FRIL bestaat uit 6 essentiële stappen (Figuur 2): 1) Snelle bevriezing met een hoge druk (bij 2300 - 2600 bar) van het monster. 2) Breken van het monster. Het breukvlak volgt algemeen de centrale hydrofobe kern van bevroren membranen, ze te splitsen in twee halve membraan folders een halfvolle die grenzen aan de protoplasma (P-face) ligt en een half die grenzen aan de extracellulaire of exoplasmatische ruimte ligt (E- gezicht). 3) Replicatie van het monster door middel van vacuüm-afzetting van platina en koolstof. 4) Detergent-digestie van het weefsel. 5) immunogoud labeling. 6) Analyse van de replica met een transmissie elektronen microscoop.
- Bereiding van koper carriers
OPMERKING: Om door de opeenvolgende stadia van de FRIL procedure worden behandeld, moeten monsters op metalen (goud of koper) dragers worden gemonteerd. Deze maatschappijen variëren in grootte en ontwerp volgens de wijze van breken en het type van de machines die gebruikt worden. Hier hebben we gebruik gemaakt van koper dragers (Figuur 1B, E) en een scharnierende "dubbele replica table"; (zie figuur 3B), die bij het openen produceert een trekkracht breuk door de bevroren monster (figuur 2). Hierdoor kunnen behouden en repliceren beide zijden van het gebroken monster.- Poolse koper dragers met een aanslag remover met behulp van een vel gemzen huid.
- Plek dragers bestaan glaspot en schoon tweemaal met een niet-ionisch detergens (pH ~ 1,5) in een sonicatiewaterbad, daarna uitvoerig wassen in kraanwater en vervolgens met gedeïoniseerd water en vervolgens tweemaal spoelen met ethanol.
- Ultrasone trillingen de koper dragers in aceton gedurende 15 min.
- Plaats de dragers op filtreerpapier drogen.
- Bevestig een ring van dubbelzijdige tape om een koperen carrier (figuur 1C), dat als het bedrijf ook de getrimde blokken (opnamedrager) dient.
- Bevriezing van het monster
OPMERKING: ga vloeibare stikstof met zorg en het dragen van een bril.- Zet de hoge druk vrijzing eenheid (Figuur 1F) ten minste 1,5 uur voor aanvang van het model het vriespunt.
- Begin verwarming door op de "LUCHTVERWARMER" knop, en bak uit voor 50 min. Stel luchttemperatuur tot 80 ° C.
- Sluit de stikstof tank naar de hoge druk bevriezing unit en druk op de "STIKSTOF" knop aan de binnenkant Dewar vullen met vloeibare stikstof. De "stikstofgehalte" lampje gaat branden. Begin afkoeling door het indrukken van de "Koelen" knop.
- Druk op de "DRIVE IN" knop wanneer de "stikstofgehalte" dooft. Controleer of het hydraulische systeem beweegt de zuiger heen en weer 3 maal.
- Druk op de knop "AUTO" en de "stikstof" knop. Zodra "READY" gaat branden, de hoge druk bevriezing apparaat klaar is voor hoge druk het vriespunt.
- Plaats een afgeslankte blok in het gat van de dubbelzijdige tape (Figuur 1B) met een platina draadlus die is versmolten aglass pipet.
- Het overtollige van de cryobeschermingsmiddeloplossing filterpapier en een borstel.
Opmerking: Deze procedure is ook belangrijk om luchtbellen die rond het weefsel vormt en die vervorming van het weefsel vorm en / of ultrastructuur kunnen veroorzaken te verwijderen. - Onder een stereomicroscoop, dekken het bedrijf drager met andere drager, zodat het weefsel blok is ingeklemd tussen de twee dragers.
- Plaats de carrier-sandwich in de monsterhouder van de hoge druk bevriezing eenheid (figuur 1D). Schuif de monsterhouder in de hoge druk bevriezing eenheid (tip naar beneden) en zet deze door schroeven in de monsterhouder.
- Start de bevriezing cyclus door op de 'Jet-Auto "knop. zo snel mogelijk te werken, verwijder dan het monster houder en dompel de punt met vloeibare stikstof in een geïsoleerde doos. Dompel de uiteinden van twee paar pincetten in de vloeibare stikstof te koelen.
- Haal the carrier-sandwich van het monster houder en plaats deze in een pre-gekoelde cryovial. Zorg ervoor dat de dragers alleen worden behandeld met vloeibare stikstof gekoeld tang. Cryovials moet worden geperforeerd om de stikstof te laten stromen uit het flesje (figuur 1G).
- Herhaal de stappen 3.2.6 tot 3.2.11 totdat alle gewenste monsters zijn bevroren. Meervoudige draaggolf sandwiches die dezelfde soort monster kan worden opgeslagen in hetzelfde flesje.
- Bewaar de cryovials met de dragers in een cryotank tot replicatie (Figuur 1H).
Figuur 1. Tissue Voorbereiding en Hogedruk Freezing. (A) Vibroslicer gebruikt om het gedeelte weefsel. (B) A resulterend coronale muis sectie hersenen die de amygdala naast elkaar getoond met acOpper carrier uitgerust met een ring van dubbelzijdige tape. De gestippelde box geeft het gebied van belang dat de mediale paracapsular cluster van het ITC bevat. De diameter van het gat in de dubbelzijdige tape ongeveer 1,5 mm. (C) Gereedschap voor de bereiding van koper dragers. Vanaf linksboven met de klok mee: dubbelzijdige tape, pincet, puncher, koper vervoerders, en schaar. (D) Het inbrengen van de carrier-sandwich in de monsterhouder voor hoge druk het vriespunt. De drager-sandwich wordt geplaatst in het gat van de preparaathouder. (E) Koperen dragers zonder en met een ring van dubbelzijdige tape en de 'carrier-sandwich ". (F) Hogedruk vriesunit met tank onder druk toevoeren van vloeibare stikstof aan. (G) A cryovial de bevroren weefsels in voorraad hebben. Let op de gaten in de upper-middle positie van de flacon waardoor stikstofgas uit de flacon (pijlpunt) te stromen.
4. Freeze-breuk en replicatie
- Bereiding van de elektronenkanonnen
- Voordat u de elektronenkanonnen, verwijder het schild met de "deflector plaat". Plaats de "instelling maat" voor het centreren van de gloeidraad in de spantang door de onderste kathode klep.
NB: De grotere diameter einde van de instelmal wordt gebruikt voor de koolstof pistool terwijl het kleinere uiteinde diameter van de platina pistool. - Schuif de nieuwe filament boven de meter tot "de druk laminaten" kunnen de uiteinden van de gloeidraad te klemmen, zodat het filament spoel niet in een hoek heeft liggen.
- Verwijder de instelling meter en steek de koolstof staaf. Fix it vast door de collet as met de verdamper staafhouder, zodat de hoogte van het uiteinde van de stang in het midden van de tweede spoel van de bodem. Voor platina pistool moet de hoogte van het uiteinde van de roede platina in het midden van de tweede filament wikkeling van boven.
- Vervang de deflector plaat en plaats geweren in de bevriezing breuk unit. Maak de kanonnen met een zand-blaster na gebruik.
- Voordat u de elektronenkanonnen, verwijder het schild met de "deflector plaat". Plaats de "instelling maat" voor het centreren van de gloeidraad in de spantang door de onderste kathode klep.
Figuur 2. Illustratie van de belangrijkste stappen van de FRIL Technique.
Overzicht van de verschillende stappen die nodig zijn voor de voorbereiding en analyse van de replica. (1) Hoge druk bevriezen van weefsel. (2) Breken. Tijdens breken van bevroren weefsel wordt de lipide dubbellaag van plasmamembranen in twee helften in de hydrofobe interface. Eiwitten in het plasmamembraan toegewezen op hetzij de exoplasmatische (E-vlak) of protoplasmische membranen (P-face). (3) replicatie. Het verdampen van koolstof (C) vangt lipiden en eiwitten op het oppervlak van de gebroken weefsel. Het materiaal is bekleed met 2 nm platina / kool voor schaduw bij een 60 ° hoek, en daarna met een 15 nm koolstoflaag die de structuur van de replica (C-laag, Pt-shadowing) versterkt. (4) oplossing brengen. Het weefsel niet gevangen door de replica membraan wordt vervolgens opgelost met SDS-oplossing. (5) Labeling. Eiwitten van belang kunnen worden gevisualiseerd op replica met een complex van specifieke primaire antilichamen (primair Ab) en secundaire antilichamen (secundair Ab) geconjugeerd met een gouden deeltjes (Au). Het gebruik van verschillende maten gouddeeltjes kan de aanwezigheid van meer dan één eiwit op dezelfde replica. (6) Na immunokleuring, replica's worden verzameld op koper mesh netten en geanalyseerd met een transmissie-elektronenmicroscoop op 80 -. 100 kV Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Opzetten van freeze breuk eenheid
- Schakel de bevriezing breuk eenheid (figuur 3A) door te draaien MAINS op 1. Voor een gedetailleerde beschrijving van de procedures freeze-fractuur en replicatie, zie de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
- Voorafgaand aan de koeling van de freeze-fractuur apparaat, bakken uit de gehele koelsysteem van het apparaat met warme lucht. Druk op de "ontdooien" knop in het MTC 010 apparaat (temperatuurregelaar) (Figuur 3A) en laat de bak out proces run voor 45 min.
- Activeer het vacuüm station. De bevriezing breuk toestel werkt meestal in een vacuüm reeks van ~ 10 -6 - 10 -7 mbar.
- Vul stikstof tank en sluit deze aan op de bevriezing breuk unit. Controleer of de klep houder is droog en ook de ingang van de tank vóór het inbrengen van de klep houder te reinigen (luchtvochtigheid kunnen interfereren met stofzm en vermelding van N 2 vullen van de tank).
- Gaan koelen door de temperatuur tot -115 ° C. Koeling duurt ongeveer 45 minuten.
- Plaats de elektronenkanonnen en aanpassen stroom en spanning de volgende parameters voor de verdamping bereikt:
Carbon gun: rotatie op, stand 90 °, snelheid van koolstof ophoping 0,1-0,2 nm / sec
Carbon-platina gun: rotatie off, positie 60 °, snelheid van accumulatie 0,06-0,1 nm / sec
OPMERKING: Indien een pistool voor het eerst na de uitwisseling van de koolstof of platina staaf, ontgas gedurende 3 minuten voor gebruik.
- Breken en replicatie
- Plaats bevroren carrier-sandwiches in dubbele replica tabel zorgt ervoor dat alle manipulaties worden gedaan in vloeibare stikstof.
- Transfer dubbele replica tafel om een Dewar vat en bevestig het met het model podium ontvanger onder een hoek van 45 °. De vloeibare stikstof niveau moet altijd boven de dubbele replica tafel. Pak de dubbele replica tafel met de tabel manipulator en plaats deze in de bevriezing breuk-eenheid op de koude fase. Wacht ongeveer 20 minuten zodat de temperatuur van de dubbele replica tabel aanpassen aan -115 ° C.
- Controleer of de vacuum beneden 10 -6 mbar en de temperatuur -115 ° C.
- Breuk van het weefsel door handmatig tegen de klok in rotatie van het wiel is verbonden met de mantel boven de dubbele replica tafel gelegd. Wanneer de lijkwade wordt, het dwingt de dubbele replica tafel te openen, breken het weefsel.
- Druk op de "Hoge spanning" knop in de EVM 030 apparaat (elektronenbundel verdamping controle-eenheid) van de bevriezing breuk eenheid (figuur 3A).
- Kopie van de blootgestelde oppervlakken van de gebroken weefsel (Figuur 3C) door verdamping van koolstof (roteren) door middel van een elektronenkanon geplaatst op een 90 ° hoek met een dikte van 5 nm, gevolgd door een unidirectionele shadowing met platina-koolstof bij een 60 ° hoek met een dikte van 2 nm. Tenslotte af met een 15 nm dikke laag koolstof uit een hoek van 90 ° (draaiende).
- Gebruik de volgende parameters voor de verdamping:
1e carbon: rotatie op, positie 90 °; speed 0,1-0,2 nm / sec; 5 nm
2 carbon-platina: positie 60 °; speed 0,06-0,1 nm / sec; 2 nm
3de koolstof: rotatie op, positie 90 °; speed 0,3-0,5 nm / sec; 15 nm - Verwijder de gerepliceerde specimens van de bevriezing breuk apparaat en overbrengen naar een keramische plaat met 12 putjes (Figuur 4A) gevuld met TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4).
- Met behulp van een platina lus walsdraad, verwijder de gerepliceerde weefsel van het monster carrier (Figuur 4A).
- Herhaal de stappen 4.3.1 tot 4.3.10 totdat alle monsters zijn gerepliceerd.
(A) De bevriezing breuk unit. Het apparaat bevat een aantal controle-eenheden en een monitor. Specimens worden ingebracht in de kamer door een poort aan de linkerkant van de kamer. Een onder druk gebrachte vloeibare stikstof container is verbonden met de bevriezing breuk apparaat op het podium te koelen. Beelden hieronder tonen vergrote aanzichten van twee van de eenheden (UPC 010 en MDC 010) en de monitor parameters het weergeven tijdens het verdampen van de tweede koolstof laag. (B) geopend (links) en gesloten (rechts) uitzicht op de dubbele replica tafel. De "carrier-sandwiches" ingevoegd in de sleuven van de tabel (aangegeven door pijlen). De kleine wapens te voorkomen "carrier-sandwiches" uit kan vallen tijdens de manipulatie. (C) Een gebroken en gerepliceerd monster. Replica weergegeven als zwarte dunne films bovenop het gebroken weefsel.53 / 53853fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- SDS-digestie van de replica
- Overdracht replica een 4 ml glazen flesje gevuld met 1 ml van SDS-digestie buffer (2,5% natriumlaurylsulfaat, 20% sucrose in 15 mM Tris, pH 8,3). Digest gedurende 18 uur bij 80 ° C onder schudden (45 slag / min).
- Replica overdracht naar een nieuwe buis gevuld met SDS-digestiebuffer en bewaar bij kamertemperatuur.
5. immunokleuring
OPMERKING: Alle incubaties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur met zacht schudden, met uitzondering van de incubaties met antilichamen.
- Was de replica gedurende 10 min in zoet SDS-vergisting buffer.
- Was de replica eenmaal met 2,5% BSA (runderserumalbumine) in TBS gedurende 5 min, en vervolgens 3 x 10 minuten met 0,1% BSA in TBS.
- Blok aspecifieke bindingsplaatsen in TBS met 5% BSA gedurende 1 uur.
- Solliciteer primaire antilichamen verdund in 2% BSA-TBS. Voer incubaties in een 30 pl druppel (Figuur 4B) in een vochtige kamer bij 15 ° C gedurende 72 uur (Figuur 4C).
- Voor deze studie, proces zowel replica's van de gebroken weefsel. Incubeer een replica met een cavia polyklonaal antilichaam opgewekt tegen de aminozuren 717-754 van muis GluR1 voor alle AMPA-R subeenheden (verdunning: 1: 200) of een monoklonaal antilichaam opgewekt tegen een recombinant fusie-eiwit die de aminozuren 660 - 811 van de NR1 subeenheid van het NMDA-R (verdunning: 1: 500), en een konijn polyklonaal antilichaam opgewekt tegen het green fluorescent protein (verdunning: 1: 300).
- Incubeer de andere replica met een konijn polyklonaal antilichaam opgewekt tegen een synthetisch peptide dat overeenkomt met aminozuren 384 aminozuren - 398 van de rat μ-opioid receptor (verdunning: 1: 500).
- Wassen in TBS met 0,05% BSA (3 x 5 min.).
- Solliciteer secundaire antilichamen. Voor deze studie use goud (5 nm voor ionotrope glutamaatreceptoren, 10 voor μ-opioïdereceptoren en / of 15 nm voor ChR2-YFP) geconjugeerde antilichamen verdund in TBS met 2% BSA. Verdun secundaire antilichamen 01:30 en incubeer in een 30 ul druppel bij 15 ° CO / N.
- Was 3 x 5 minuten in 0,05% BSA-TBS bij kamertemperatuur.
- Was 2 x 5 min in ultrapuur water.
- Mount replica op formvar-gecoate 100-lijn parallel bar rooster (Figuur 4D).
6. Replica Analyse
- Afbeelding replica met een transmissie elektronenmicroscoop (TEM) bij 80 of 100 kV. Verwerven digitale beelden door middel van een CCD (charge-coupled device) camera.
- Offline, vind corresponderende gebieden op de beelden van beide replica's met behulp van monumenten (Figuur 4E). Analyseren digitale beelden met behulp van Image J. Bepaal postsynaptische stippellijn het aantal met immunogoud gemerkte deeltjes gericht tegen de receptor geanalyseerd.
Figuur 4. immunokleuring van Replica.
(A) Gereedschap voor het manipuleren en het wassen van de replica's. Een keramische 12-well plaat (rechtsboven) en 2 soorten glas pipetten (linksboven). De glazen pipet met ronde punt (linksonder) wordt gebruikt om replica overdracht en de pipet met platina staaf (midden onder) wordt gebruikt om replica ontvouwen. Een replica in wasbuffer (rechtsonder). (B) immunokleuring replica's wordt in druppels (30 ui) geplaatst op een klein stukje parafilm in een putje van een weefselkweekplaat met 6 putjes uitgevoerd. Merk op dat een replica onder een de druppel buffer bevattende antilichamen. Om verdamping te voorkomen, wordt een vochtig stukje tissuepapier aangebracht rond de binnenrand van de put. (C) Incubator voor de immunokleuring stap. Incubaties worden uitgevoerd bij 15 ° C. (D) Een replica gemonteerd op een Formvar beklede 100-lijn parallel bar net. (E) lage vergroting microfoto van een stel replica's. De gestippelde vierkanten geven drie typische plaatsen naar een locatie te identificeren in de overeenkomstige replica's. Schaal bar: 10 pm. Alle gegevens worden getoond als gemiddelde ± SEM Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
De FRIL techniek in combinatie met expressie van optogenetic actuators microbieel 21, dat wil zeggen, kanalen geïntegreerd in het plasmamembraan en effectief anterogradely meegevoerd axonen, maakt het mogelijk om kwantitatief onderzoek de postsynaptische expressie van AMPA-R's en NMDA-Rs op een gedefinieerde subgroep synapsen. Deze is hier te zien voor de axonen afkomstig van verschillende thalamuskernen (bijvoorbeeld PIN / MGN) op ITC neuronen in de amygdala. Deze benadering maakt een moleculaire analyse van individuele sensorische neuronen synapsen op ITC, een groep cellen die tot dusver refractair zijn een gedetailleerde anatomische en moleculaire karakterisering.
Vier weken na stereotactische injectie van de rAAV-ChR2-YFP in de PIN / MGN ChR2-YFP-positieve axonen dichtbevolkte geprikkeld de LA, de amygdalostriatal overgangsgebied (Astria) en de mediale paracapsular I TC cluster in de amygdala, een patroon volledig in overeenstemming met eerdere studies tracing 16, 22. We hebben ook ontdekt intense goud immunokleuring voor ChR2-YFP op de P-face axonen en terminals in vries-breuk replica van rAAV-ChR2-YFP- geïnjecteerde muizen (Figuur 5A), maar niet in replica's van niet-geïnjecteerde muizen. De postsynaptische membraan specialisatie glutamaat synapsen in een replica kan worden waargenomen als een cluster van intramembrane deeltjes (GMP) op het E-vlak van het plasmamembraan 2, 23, en gaat vaak gepaard met de P-zijde van de presynaptische plasma membraan 7 (Figuur 5B-C). Deze kenmerken maken de postsynaptische specialisatie van glutamaat synapsen gevormd door PIN / MGN axon aansluitklemmen (figuur 5 en 6). We gemerkte AMPA-R met een antilichaam dat alle vier subeenheden (GluA1-4) herkent, terwijl NMDA-R's werden gedetecteerd onder toepassing van een antilichaam tegen het essentiële NR1 subeenheid.
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Vanwege het ontbreken van instrumenten voor het opsporen van dezelfde replica of deze synapsen waren met dendritische of schachten van ITC neuronen gelabeld we de overeenkomstige replica gezicht μ opioide receptoren, zoals ITC neuronen tot expressie postsynaptisch hoge niveaus van deze receptoren 24. Dit vereist de identificatie van hetzelfde postsynaptische profielen in beide replica's (Figuur 5C-F en Figuur 6A-D) met een strategie die plekken die werkzaam (Figuur 4E) .
Figuur 5. Detectie van ChR2-YFP en ionotrope glutamaatreceptoren op Replica door immunogold Particles. (A) Een cross-gebroken axon terminal (lichtblauw) en kleine porties van de P-face gemerkt met 15 nm gouddeeltjes detecteren ChR2-YFP. In de terminal, het membraan of tal synaptische blaasjes kan worden waargenomen (sv). Let op de specificiteit van de immunokleuring grotendeels beperkt tot de plasmamembraan. Etikettering van ChR2 identificeert de terminal als afkomstig van de PIN / MGN. De terminal vormt een asymmetrisch synaps met een kern. De postsynaptische membraan specialisatie (PSD) op de E-gezicht toont een karakteristieke cluster van intramembrane deeltjes en gelabeld met 5 nm gouddeeltjes onthullen AMPA-Rs. (B) De P-gezicht van een ChR2 expressie axon (gemerkt met 15 nm gouddeeltjes) weergegeven grenst twee dendrieten, waarvan er twee bezit PSD gelabeld met 5 nm gouddeeltjes onthullen NMDA-Rs. (CD) Tegenover gezichten van de pre- en postsynaptische membranen van een PIN / MGN-ITC synaps. (C) De P-zijde van de terminal tot expressie ChR2 (gemerkt met 15 nm gouddeeltjes) en zich uitstrekt over het E-vlak van twee dendritische assen, waarvan er met twee PSD gelabeld voor AMPA-Rs (5 nm gouddeeltjes). (
Immunoparticles voor AMPA-R's in de PIN / MGN-ITC synapsen werden over de hele IMP cluster gevonden, hetgeen duidt op een homogene verdeling binnen de postsynaptische specialisatie (Figuur 5E). Een significant hoger (ongepaarde t-test p <0,018) dichtheid van AMPA-R labeling werd waargenomen in PIN / MGN synapsen op ITC stekels (715 ± 38 gouddeeltjes / um 2, n = 32) vergeleken met synapsen op ITC dendrieten (590 ± 44 gouddeeltjes / um 2, n = 32). Kortom, de dichtheid van AMPA-R's in PIN / MGN-ITC synapsen toonde een betrekkelijk lagevariantie (Coëfficiënt van variatie, CV = 0,37) in overeenstemming met een homogene verdeling.
Immunoparticles voor NMDA-R's in de PIN / MGN-ITC synapsen werden vaak waargenomen ongelijk verdeeld binnen postsynaptische IMP clusters (Figuur 5B). De dichtheid van NMDA-R labeling was vergelijkbaar (ongepaarde t-test p = 0,39) tussen Pin / MGN synapsen op ITC stekels (1070 ± 153 gouddeeltjes / um 2, n = 8) en ITC dendrieten (812 ± 183 gouddeeltjes / 2 um, n = 9). In tegenstelling tot wat werd waargenomen voor AMPA-R's, de dichtheid van NMDA-R's in PIN / MGN-ITC synapsen een hoge variabiliteit (CV = 0,54).
Figuur 6. AMPA-r's en NMDA-Rs immunokleuring bij Identified PIN / MGN-ITC Synapses.
(AB) Tegenover gezichten van de pre- en postsynaptische membranen van een PIN / MGN-ITCsynaps gemaakt op een dendritische spine waarin de P-zijde van de terminal tot expressie ChR2 (gemerkt met 15 nm gouddeeltjes) en de PSD op een dendritische spine bestemd is voor AMPA-Rs (5 nm gouddeeltjes). (CD) Vergrote uitzicht op de geschetst door de onderbroken lijn gebieden. Deze gebieden zijn gedraaid ongeveer 45 ° tegen de klok in om een beter beeld van de PSD toe te staan. (E) spreidingsdiagrammen het aantal AMPA-R deeltjes versus synaptische gebied ITC stekels en dendrieten. In beide structuren heeft een positieve correlatie waargenomen. (F) spreidingsdiagrammen het aantal NMDA-R deeltjes tegen synaptische gebied ITC stekels en dendrieten. Een significante positieve correlatie werd alleen gedetecteerd in dendritische. Schaal bars. 500 nm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Omdatde P-zijde van de presynaptische plasmamembraan vaak bedekt gedeeltelijk de postsynaptische GMP cluster, kunnen we de synaptische oppervlakte van slechts 30% van de synapsen schatten (stekels gemiddelde oppervlakte 0,032 um 2, gamma: 0,007-0,063 um 2, n = 8; dendrieten: 0,047 micrometer 2, bereik: 0,024-0,166 um 2, n = 11). Deze waren in een vergelijkbare reeks als eerder geanalyseerd telencephalic glutamaat synapsen 25.
Zowel stekels en dendrieten, werd het aantal gouden immunoparticles voor AMPA-Rs in individuele synapsen positief gecorreleerd met de synaptische gebied (Spearman, stekels: r = 0,88, dendrieten: r = 0,60, p <0,0001) (figuur 6E). Omgekeerd, het aantal gouden immunoparticles voor NMDA-R bleek te correleren met de synaptische gebied stekels (Spearman, stekels: r = 0,90, p <0,002), maar niet in dendrieten (r = 0,21, p = 0,29) (Figuur 6F ).
Discussion
Freeze-breuk elektronenmicroscopie is een belangrijke techniek in de ultrastructurele onderzoek al meer dan 40 jaar. Echter, het gebrek aan effectieve middelen om de moleculaire samenstelling van membranen bestuderen een significante daling in het gebruik. Onlangs is er een grote opleving vries-breuk elektronenmicroscopie als gevolg van de ontwikkeling van effectieve manieren om integrale membraaneiwitten openbaren door immunogold labeling 1, 2, namelijk de FRIL techniek.
De FRIL techniek bezit een aantal voordelen ten opzichte van andere immunogoud ultrastructurele methoden. Eerst, eiwitten gemakkelijk toegankelijk voor antilichamen verhogen van de gevoeligheid. Tweede blootstelling van groot deel van plasmamembraan specialisaties zoals de postsynaptische membraan op het tweedimensionale oppervlak van de replica maakt de controle van de ruimtelijke verdeling en de fysieke nabijheid van moleculen van interesse zonder omslachtige en tijdrovende reconstructie van serial ultradunne secties. Ten derde, de beschikbaarheid van beide helften van de plasmamembraan verhoogt het aantal eiwitten die voor elke individuele structuur kan worden gemerkt, mits geschikte antilichamen beschikbaar. Na breken wordt het hydrofobe oppervlak van het gesplitste membraan beklede koolstof bevatten platina eiwitdomeinen die achterblijft op het breukvlak verschanst. Dit voorkomt toegang van antilichamen tegen antigenen in deze domeinen. Bijvoorbeeld op P-gezicht van een replica enige epitopen tegenover het protoplasma ruimte kan worden gedetecteerd met antilichamen, terwijl de E-gezicht alleen epitopen tegenover de exoplasmatische ruimte kan worden gebonden door antilichamen (zie figuur 2).
Anderzijds, de FRIL techniek lijdt ook onder bepaalde beperkingen 2. Breuken willekeurige plaatsen, kan het moeilijk zijn om specifieke cellen of structuren te richten. Dit kan ook leiden tot een steekproef bias, bijvoorbeeld in synaps collectie, gezien de verschillende waarschijnlijkheid van fracturing langs het membraan structuren met verschillende kromming (bijvoorbeeld stekels versus assen). Bovendien is de verdeling van membraaneiwitten naar een van de twee vlakken is onvoorspelbaar. Daarom is de verdeling van een eiwit aan het P-face of E-face, in het bijzonder voor kwantitatieve studies moet zorgvuldigheid worden aangepakt met behulp van antilichamen reactief intracellulaire en extracellulaire domeinen. Tenslotte de identificatie in de replica van bepaalde structuren, zoals axon presynaptische terminals, kan moeilijk zijn indien alleen op morfologische kenmerken. Het gebruik van specifieke antilichamen voor marker proteïnen of transductie van gemerkte integrale membraaneiwitten of kanalen met virale vectoren biedt extra hulpmiddelen voor de identificatie van de gebroken membranen vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, deze studie maakten gebruik van de transductie van ChR2-YFP in thalamische neuronen om hun axonen afferenten te identificeren in de amygdala en de etikettering van μ-opioïde receptoren postsynaptische me onthullenmbranes van ITC neuronen.
Met het oog op de FRIL techniek succes uit te voeren, moet bijzondere zorg worden genomen met betrekking tot weefsel fixatie. Sterke fixatie van het weefsel (> 2% paraformaldehyde) kan leiden tot een hoge mate van cross-breuken en een afname van labeling gevoeligheid. Anderzijds, zwakke fixaties maken het weefsel hanteren en de bewerking (bijvoorbeeld snijden van profielen) moeilijk. Het is ook belangrijk om te controleren of de dikte van de getrimde blokken overeenkomt met de dikte van het dubbelzijdige plakband. Indien de dikte van het monster lager is dan die van de band, zou het oppervlak van het weefsel niet hechten aan het oppervlak van de twee metalen dragers, wordt derhalve het bevroren monster niet gebroken. Als het weefsel dikker is, wordt deze gecomprimeerd onvermijdelijke structurele vervormingen wanneer de sandwich van de twee koperen dragers gemaakt. De temperatuur waarbij het monster is gebroken (in dit protocol, -115 ° C) speelt ook een belangrijke rolde structuur van de replica. Hogere temperaturen kunnen een hoger percentage van artefacten produceren zoals condensatie van waterdamp op het oppervlak van het weefsel voor of tijdens verdamping. Lagere temperaturen (<-125 ° C) kan het risico van splitsing te verhogen off van materiaal tijdens het breken. Dit materiaal kan vallen op het oppervlak van het monster of blijven aangesloten. Deze vlokken van het materiaal zijn ook gecoat en contrast produceren van donkere vlekken op de afbeelding. Breken bij lagere temperaturen kan ook invloed hebben op de frequentie van de cross-breuken in het bijzonder voor kleine fijne structuren zoals dendritische. Een verdere belangrijke stap bij de bereiding van replica's is het detergens-digestie. Als de vertering onvolledig is, de onverteerd weefsel verschijnt als donkere vlekken aan de replica verstorende de analyse van de structuur van de TEM. Bovendien onverteerd weefsel kan niet-specifiek vangen of te binden antilichamen, waardoor de achtergrond labeling. Anderzijds, het gebruik van detergenss voor weefsel spijsvertering kan de moleculen geassocieerd met de replica veranderen van hun secundaire en tertiaire structuren denatureren. Daarom is voor bepaalde antigenen, nodig kan zijn om geleidelijk verdunnen van de concentratie van SDS extra wasstappen.
Voor immunokleuring, de beschikbaarheid van verschillende maten gouddeeltje geconjugeerde secundaire antilichamen maakt het mogelijk om sporen tegelijk, maar kwalitatief verschillende eiwitten, ook in bepaalde microdomeinen van het plasmamembraan, zoals de postsynaptische specialisatie. Echter, als gevolg van sterische hindering, kwantitatieve studies meestal beperkt tot het opsporen van één molecuul. De grootte van de goud deeltjes kunnen ook invloed hebben op de etikettering werkzaamheid.
Voor de interpretatie van de etikettering in FRIL, moet er rekening mee dat de immunogoud deeltje overal kan worden geplaatst binnen een halve bol met een straal van 20-25 nm van het antigeen worden gehouden vanwege de flexibele complexe vormed door de primaire en secundaire antilichaam 26. Voor meer informatie over de theorie en praktijk van FRIL en aanverwante technieken, verwijzen wij de lezer ook naar andere methodologische artikelen 27, 28.
De FRIL techniek is recentelijk voor hoge resolutie kwantitatieve analyses van glutamaat receptor lokalisatie in diverse synaps populaties 29, 30. Bovendien, de detectiegevoeligheid van de FRIL techniek voor AMPA-Rs geschat zo hoog als een immuno- deeltje per één functionele AMPA -R kanaal 29. Daarom is deze benadering is algemeen zeer nuttig te kwantificeren en het patroon van postsynaptische expressie van AMPA-R's en NMDA-Rs bij de centrale synapsen analyseren. Hier hebben we aangetoond dat de toepasbaarheid bij PIN / MGN-ITC synapsen, een site het meest waarschijnlijk van belang zijn voor het doorgeven van de VS informatie tijdens angst conditionering. Toepassing van een antilichaam opgewekt tegen het extracellulaire sterk geconserveerde aminozuurresiduen van de AMPA receptor subunits GluA1-GluA4, vonden we een gelijkmatige verdeling van gouddeeltjes binnen IMP clusters gevonden volgens postsynaptische membraan specialisaties. De dichtheid van AMPA-R's in ITC stekels was significant hoger in vergelijking met de as synapsen doelwit van PIN / MGN thalamus afferenten. Zowel wervelkolom en schacht synapsen, een positieve correlatie tussen etikettering van AMPA-Rs en postsynaptische gebied werd gedetecteerd, een gemeenschappelijk kenmerk van andere glutamaat synapsen 25. De lage variatie in dichtheid van AMPA-R's in PIN / MGN-ITC synapsen duidt op een homogene verdeling vergelijkbaar met andere synapsen gevormd door thalamic afferenten 7, maar verschillend van corticale synapsen 25. Omgekeerd is de dichtheid van NMDA-Rs was variabeler en verschilde niet tussen de ruggengraat en de as synapsen suggereren een andere regeling dan AMPA-Rs. In de toekomst, zullen de hoge reproduceerbaarheid van het FRIL techniek niet alleen toe om de basale moleculaire samenstelling van centrale synapsen beoordelen, maar kan detectie van c gemakkelijkerijzigingen in ionotrope glutamaat receptor nummers en subsynaptic distributie na angst leren, als aanvulling op ex-vivo opnames van pre- en postsynaptische eigenschappen van deze ingangen.
Concluderend kan deze benadering worden gebruikt door andere onderzoekers inzichten in de structuur-functie relaties van de input-specifieke exciterende synapsen krijgen in veel andere neurale circuits waarin ontwarren de oorsprong van de ingangen en de aard en samenstelling van postsynaptische elementen cruciaal maar problematisch .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Stereotactic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
| Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue preparation | |||
| Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
| Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
| Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
| NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
| NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
| 4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
| Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
| GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
| Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
| Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
| Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
| Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
| Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure Freezing | |||
| Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
| Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
| Chamois skin | Household supply store | ||
| Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
| Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
| Acetone | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
| High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
| Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
| Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
| Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
| CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
| CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
| Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
| Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-fracture and Replication | |||
| Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
| Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
| Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
| Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
| Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
| Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
| Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
| SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
| Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
| TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
| Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunolabelling | |||
| BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
| Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
| Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
| Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
| Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
| EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody | BBInternational, UK | EM.GAG5 | |
| EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody | BBInternational, UK | EM.GAR15 | |
| Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
| Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
| Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
| Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
| Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EM analysis | |||
| Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
| Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
| iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |
References
- Fujimoto, K. SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application. Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).
- Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).
- Rash, J. E., Yasumura, T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis. Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).
- Emes, R. D., Grant, S. G. Evolution of synapse complexity and diversity. Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).
- Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).
- Rollenhagen, A., Lübke, J. H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function. Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).
- Tarusawa, E., et al. Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses. J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).
- Nusser, Z., et al. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).
- Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus. Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).
- Nicholson, D. A., Geinisman, Y. Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala. Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).
- Duvarci, S., Pare, D. Amygdala microcircuits controlling learned fear. Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).
- Jüngling, K., et al. Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala. Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).
- Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Sigurdsson, T., et al. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Bienvenu, T. C. M., et al. Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information. J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).
- Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes. Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).
- Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction. Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).
- Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).
- Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
- Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).
- Tanaka, J., et al. Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum. J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).
- Mansouri, M., et al. Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex. Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).
