Abstract
Freeze-fraktur elektron mikroskopi har vært en stor teknikk i ultra forskning i over 40 år. Men mangelen på effektive midler for å studere den molekylære sammensetning av membraner fremstilt en betydelig nedgang i bruken. Nylig har det vært en stor vekkelse i frysebruddelektronmikroskopi takket være utviklingen av effektive måter for å vise integrerte membranproteiner av immunogold merking. En av disse metodene er kjent som vaskemiddel-solubilisert Freeze-brudd Replica Immunolabeling (FRIL).
Kombinasjonen av FRIL teknikken med optogenetics tillater en korrelert analyse av de strukturelle og funksjonelle egenskaper sentrale synapser. Ved hjelp av denne metode er det mulig å identifisere og karakterisere både pre- og postsynaptiske neuroner ved deres respektive ekspresjon av et tagget channelrhodopsin og spesifikke molekylære markører. Den karakteristiske utseendet på postsynaptiske membranen spesialisering av glutamaterge synapser tillater videre, ved merking av ionotrope glutamatreseptorer, for å kvantifisere og analysere intrasynaptic fordelingen av disse reseptorene. Her gir vi en steg-for-steg beskrivelse av de krav som stilles for å forberede parvise kopier og hvordan du immunolabel dem. Vi vil også diskutere begrensninger og begrensninger i FRIL teknikk, særlig de som er forbundet med potensielle prøvetaking skjevheter. Den høye reproduserbarhet og allsidighet av FRIL teknikk, når kombinert med optogenetics, og tilbyr en svært kraftig metode for karakterisering av ulike aspekter av synaptisk overføring på identifiserte nevrale kretser i hjernen.
Her gir vi et eksempel hvordan denne tilnærmingen ble brukt til å få innsikt i struktur-funksjon relasjoner av eksitatoriske synapser på nevroner i interkalerte celle masser av musen amygdala. Spesielt har vi undersøkt ekspresjon av ionotrope glutamatreseptorer ved identifiserte innganger elleriginated fra thalamus bakre intralaminar og mediale leddet kjerner. Disse synapser ble vist til stafett sensorisk informasjon som er relevant for frykt læring og gjennomgå plast endringer på frykt condition.
Introduction
Definisjonen av funksjonell arkitektur av biomembraner i nanometerskala har blitt utfordret i de senere år ved utvikling av en rekke immunolabeling teknikker som er egnet for transmisjonselektronmikroskopi. Men disse teknikkene, for eksempel før og etter embedding immunogold, har en rekke viktige begrensninger, som inkluderer dårlig deteksjon av antigener og / eller begrenset kvantitativ vurdering av membranbundne proteiner. Disse begrensningene blir spesielt kritisk i etterforskningen av den fine strukturen i nervesystemet, som er preget av en høy grad av celle mangfold og synapse heterogenitet. Denne heterogenitet resultater fra både strukturell og funksjonell diversitet diktert av pre- og postsynaptiske elementene og ved den differensielle ekspresjonen, berikelse, eller interaksjon av signaliseringsproteiner, slik som reseptorer, transportører, og effektor molekyler.
En ny tilnærming for direkte immunolabeling av integrerte eller tverrbundet membran proteiner i vaskemiddel-solubilisert fryse-fraktur kopier (FRIL) ble opprinnelig introdusert av Fujimoto to tiår siden en. Denne originale metode hadde imidlertid flere begrensninger, dvs. betydelig fragmentering av kopier, som hemmet meningsfull korrelasjon av merkede molekyler med individuelt tilordnede celler i komplekse vev slik som hjernen. Omtrent 10 år siden, Shigemoto og Fukazawa gradvis forbedret teknikken 2. Dette ble Parallelt med innsats fra en annen gruppe forskere ved Boulder laboratorier av Colorado State University, som også betydelig forbedret teknikken, særlig for studiet av gap veikryss 3.
Forbedringen i fryse fraktureringsteknikker protokoller og maskiner, samt innføring av hurtig frysing (under høyt trykk), kan nå undersøkere for å frembringe ubrutt kopier av prøvestykker av forholdsvis stor størrelse og hikvalitetsbilder gh av de fleste cellulære komponenter uten begrensninger og gjenstander produsert av sterke kjemiske bindinger.
Den FRIL teknikk har den store fordelen av en meget kvantitativ in situ identifikasjon av ett eller flere proteiner (samtidig) i histologisk kartlagt og identifisert cytologisk celler i løpet av komplekse vev slik som hjernen, med den ekstra fordelen av et planriss av pre- og postsynaptisk elementer i en enkelt kopi. Derfor er det FRIL teknikk, til tross for sine mange tekniske hindringer, holder løftet for en rekke meget viktige vitenskapelige gjennombrudd, spesielt for korrelasjonen av strukturelle og funksjonelle egenskaper hos de enkelte synapser. I løpet av de siste tiårene, har en god del informasjon er innhentet på strukturen, molekylær sminke, og fysiologiske funksjon av synapser; ennå synapser er morfologisk og molekylært svært varierte avhengig av pre og postsynaptiske paleie nevroner 4. Bare for en håndfull av synapse typer var struktur-funksjon studier oppnådd så langt 5-7. Dette var hovedsakelig på grunn av tekniske begrensninger som hindret en presis identifisering av arten av de pre- og postsynaptiske elementer.
Ultra analyse har gitt kritisk innsikt inn i variasjonen av postsynaptiske membran fordypninger på tvers adskilte synaptiske kontakter både i form av synaptiske størrelse og innhold i nevrotransmitterreseptorer 6, som har en stor innvirkning på styrken og plastisitet av synaptisk transmisjon. Videre, en stor mengde forskning viser at antall ionotrope glutamat reseptorer uttrykt på ulike typer synapse er regulert i en afferent- og target-avhengig måte 7-10.
Her er en fremgangsmåte beskrevet som tillater analyse av strukturen og sammensetningen av reseptoren postsynaptiske membran fordypninger med definered presynaptiske elementer og funksjon. Denne fremgangsmåten utnytter presynaptisk ekspresjon av nylig utviklede lysfølsomme alge proteiner, slik som channelrhodopsin2 (ChR2), og av den FRIL teknikk for å analysere mønsteret av postsynaptiske ekspresjon av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-Rs) og N-metyl-D-aspartat (NMDA-Rs) glutamatreseptorer. Dette er demonstrert ved synapser dannes av aksoner som stammer fra de bakre thalamic-mediale leddet kjerner (PIN / MGN) på nerveceller i interkalerte celle masser av amygdala (ITC). ITC nevroner er små pigg gabaergic celler organisert i klynger rundt basolateral amygdaloid kompleks (BLA) 11, 12. ITC nevroner er kjent for å motta eksitatoriske innspill fra BLA viktigste nevroner og å målrette den sentrale kjernen (CEA), og dermed fungerer som en hemmende gate for informasjonsflyt mellom BLA og CEA 12-15.
Nylig har vi demonstrert at ITC nevroner lokalisert i medio-dorsal cluster mellom BLA og CEA også motta direkte og konvergent eksitatoriske innspill fra sensoriske thalamic og time kortikale regioner, som er modifisert på frykt læring under Pavlovian auditiv frykt conditioning 16. Frykt condition er en av de best forståtte former for assosiativ læring i form av hjernemekanismer. I frykt condition, en i utgangspunktet nøytral betinget stimulus (CS, for eksempel, en tone) er sammenkoblet med en motvilje ubetinget stimulus (US, for eksempel en mild foten sjokk) som resulterer i en CS-amerikanske foreningen og betinget frykt respons 17, 18. Eksitatoriske innspill fra både thalamic og neokortikale områder, som bærer informasjon som representerer CS og USA, henholdsvis, ble kjent for å konvergere med pyramidale nevroner av den laterale kjernen i amygdala (LA), og for å gjennomgå plastisitet 19. Vår tidligere arbeid avdekket at sanseinntrykk informasjonen er også parallelt videreformidlet til ITC nevroner Som et første skritt mot en mekanistisk molekylær analyse av individuelle sanseinntrykk synapser på ITC nevroner, brukte vi en adeno-assosiert virus (AAV) for å uttrykke ChR2 merket med gul fluoriserende protein (YFP). AAV ble injisert i PIN-kode / MGN og axon terminalene, ble identifisert ved deres ekspresjon av ChR2-YFP. Vi brukte begge sider genereres av FRIL teknikk for å vurdere tettheten av postsynaptiske AMPA-R og NMDA-R på synapser dannet med ITC nevroner av PIN / MGN axon terminaler.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Regierungspraesidium Tübingen, State of Baden-Württemberg, Tyskland, og av den østerrikske forsøk med dyr Etikk Board, og var i samsvar med EU-direktiv om bruk av dyr i forskning.
1. Stereotactic Injeksjoner av AAV-Channelrhodopsin2-YFP
MERK: Stereo injeksjoner ble utført i henhold til en tidligere utgitt protokoll 20.
- Forbered sterile verktøy ved å varme dem ved 180 ºC i 1,5 timer.
- Trekk skarpe (~ 50 mikrometer diameter) glass pipetter for injeksjoner ved hjelp av en horisontal microelectrode avtrekker satt med følgende parametre: Varme = Ramp verdi - 20, Pull = 0, Velocity = 100, tid = 200, Trykk = 200.
MERK: Ramp verdi må bestemmes for hvert parti av innkjøpte glass pipetter i henhold til instruksjonene fra mikropipette avtrekker produsenten. - Premiks 1 mL av virus løsning og 0,2 ul av 0,1% fast grønn oppløsning (for bedre synlighet av løsningen i glasset pipette) i steril fosfatbuffer-saltvann (PBS; 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Fyll glasset pipetten ved hjelp av en 10 mL pipette og gel-Fil tips. For viral konstruere, bruke rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotype 2/9).
- Bedøve mus ved hjelp av et lite dyr anestesi anordningen (3% isofluran i oksygen for induksjon). Bruk. For denne studien, bruke 3 villtype mus i alderen ~ 6 uker.
- Barbere hodet mellom ørene og øynene og desinfisere med en povidonjodid basert løsning.
- Påfør et øye salve for å hindre uttørking av øynene under anestesi. Subkutant injisere mus med analgetisk (meloksikam basert, 0,1 ml av en 5 mg / ml oppløsning).
- Plassere musen i stereotaktisk ramme og opprettholde anestesi via en gassanestesi anordning (2% isofluran i oksygen for vedlikehold). Sjekk anestesi dybde av mangel på en lem tilbaketrekkingreflex før du fortsetter.
- Opprettholde sterile betingelser så godt som mulig under hele kirurgiske prosedyren. Bruk en engangs ansiktsmaske, en kirurgisk kappe og hansker.
- Lag en hud snitt på ca 1 cm på toppen av hodet med saks 20. Trekk huden til siden med butte pinsett, fikse med klemmer for å avsløre skallen overflaten og ren hodeskalle med H 2 O 2.
- Marker injeksjonssteder på skallen med en fin spiss permanent markør. Bore et lite hull (ca. 1 mm i diameter) inn i skallen på det merkede området. For ensidig PIN / MGN injeksjon i denne stud, kan du bruke følgende koordinater: fra bregma (mm): bakre 3.0, lateral ± 1,8, ventral 3.8.
- Mount fylt glass pipette på stereotaktisk ramme forbundet med en trykkinjiseringsanordningen og bringe pipetten til bregma stilling.
- Bryt av tuppen av glass pipetten hjelp av gode rette tippe tang. Kontroller at pipettespissen er åpen ved applyinga få trykk pulser og observere ekstrudering av dråper av virus løsning.
- Gå til de ønskede injeksjons koordinater og injisere halvparten av pipetten innhold (~ 0,5 mL) med følgende innstillinger på trykket injeksjonsutstyr: trykk 20 psi, gjennomsnittlig puls lengde 30 ms, gjennomsnittlig antall pulser 50.
- La pipette i stedet for ~ 1 min før langsomt (1 mm / min) trekke den.
- Ren skull med PBS (pH 7,4) og fjerne klemmene. Dra forsiktig huden sammen, og sy innsnitt (3 - 4 knop). Anvende desinfeksjonsmiddel (povidon-jod basert) rundt såret.
- Stopp anestesi og ikke la musen uten tilsyn før helt våken. Hold mus single-huset. Postoperativt fortsette å overvåke helsetilstanden; om nødvendig administrere smertestillende.
- Holde dyr i 4 uker før hjernen fiksering for å sikre riktige nivåer av viral uttrykk.
2. Prøve preparering
- Brain fiksering </ Strong>
- Utarbeidelse av fiksativ
- For en liter fiksativ, veier 10 g paraformaldehyde og legge den til 300 ml avionisert H 2 O. Varm opp til 55 - 60 ºC for ~ 10 min med kontinuerlig omrøring.
- Slå av varmen og tilsett 7 - 8 dråper 4 N NaOH. Løsningen skal bli klart i ~ 10 min.
- La den avkjøles til romtemperatur, tilsett 150 ml av en mettet løsning av pikrinsyre og bringe den til 500 ml med avionisert H 2 O.
- Legg 500 ml 0,2 M fosfatbuffer (PB). Filter med filterpapir. Juster pH til 7,4 med NaOH.
- Avkjøl fiksativ til 6 ºC, må den oppbevares i mørke glassflasker for ikke mer enn en dag på 6 ºC.
- Transcardiac perfusjon
- Bedøve mus med en intraperitoneal injeksjon av tiopental (120 mg / kg kroppsvekt). Pass på at dyret er dypt bedøvet ved å sjekke pedalen tilbaketrekking reflex, som bør være fraværende. Plasser dyret på ryggen på en perfusjon tabell med de fire ekstremiteter bundet ned.
- Åpner bukveggen i lengderetningen med butt-ende saks og gjøre to ytterligere kutt sideveis langs hale kant av brystkassen, for å utsette membranen. Skjær bort membranen og kutte brystveggen ved osteocartilageneous grensen på begge sider. Løft kaudal ende av den sentrale skive av brystvegg som inneholder sternum for å blottlegge hjertet.
- Fjern pericardium, foreta en liten nøyaktig kutt i tuppen av venstre ventrikkel for å innrømme kanylen av perfusjon anordningen. Bruke en butt kanyle med en indre diameter på 0,6 mm. Før kanylen forsiktig gjennom ventrikkelen til tuppen vises i den stigende aorta og fest kanylen med en klemme. Å tillate blod og perfusates å gå ut av blodet, gjør et kutt i høyre atrium.
- Perfuse mus tran ved hjelp av en peristaltisk pumpe ved en strømningshastighetpå 5 ml / min ved først med PBS (25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4) i ca. 1 minutt, etterfulgt av is-avkjølt fikseringsmiddel i 7 min.
- Etter fiksering, bryte musen hodet med en saks og deretter kutte huden gjennom midtlinjen fra halsen til nesen. Fjern muskelen til fullt avsløre skallen.
- Ved hjelp av skarpe sakser, lag et langsgående snitt gjennom occipital og interparietal bein start fra foramen magnum. Ved hjelp av gode pinsett fjerne disse bein å eksponere hele lillehjernen. Deretter foreta en langsgående kutt gjennom parietal og frontale bein til nesebenet og fjerne dem med pinsett for å avsløre hele hjernen.
- Ved hjelp av en slikkepott fjerne hjernen uten å skade den, og legg den i iskaldt 0,1 M PB.
- Utarbeidelse av fiksativ
- Seksjonering og trimming av prøvene
- Skjær en koronal blokk på ca 5-6 mm med barberblader som inneholder det aktuelle området. Lim den på holderenden vibroslicer med en cyanoakrylatlim. Orientere vevsblokk slik at neocortex vender mot vibrerende blad. Skive koronale seksjoner, som inneholder amygdala, ved 140 um med vibroslicer (figur 1A) i iskald 0,1 M PB, og samle dem i en 6-brønners skål i den samme buffer.
- Under en stereomikroskop, trim ut den regionen av interesse (her, medio-rygg paracapsular klynge av ITC, se figur 1B) fra stykket. Gjøre dette i en petriskål belagt med silikon-elastomer og fylt med 0,1 M PB, ved hjelp av et oftalmisk skalpell. Kontroller at trimmet blokker passer inn i hullet på avstands (ca. 1,5 mm) (figur 1B).
- Flytt trimmet blokker i kryobeskyttelse løsning (30% glycerol i 0,1 M PB) O / N på 6 ºC.
3. Høytrykks Frysing
MERK: FRIL består av 6 essensielle trinn (figur 2): 1) Rask frysing med høyt trykk (på 2300 - 2600 bar) av prøven. 2) Frakturering av prøven. Bruddflaten vanligvis følger den sentrale hydrofobe kjerne av frossen membraner, dele dem inn i to halv-membran brosjyrer: en halv som ligger ved siden av protoplasma (P-ansikt) og et halvt som ligger ved siden av ekstracellulære eller exoplasmic plass (E- ansikt). 3) Replikasjon av prøven ved vakuum-avsetning av platina og karbon. 4) Detergent-fordøyelse av vevet. 5) immunogold merking. 6) Analyse av kopien ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop.
- Utarbeidelse av kobber bærere
MERK: Hvis du vil bli håndtert gjennom de påfølgende stadier av FRIL prosedyren, prøver må monteres på metall (gull eller kobber) bærere. Slik fungerer varierer i størrelse og design i henhold til modusen for oppsprekking og type maskiner som brukes. Her har vi brukt kobber bærere (figur 1B, E) og en hengslet "double replikattabell"; (se figur 3B), som når den åpnes gir en strekkbrudd gjennom de frosne prøven (figur 2). Dette gjør det mulig å beholde og replikere begge sider av frakturerte prøven.- Polske kobber bærere med en anløpe remover å bruke et ark med pusseskinn huden.
- Plasser operatører i et glass gryte og ren to ganger med en ikke-ionisk detergent (pH ~ 1,5) i en sonicating vannbad, deretter grundig vaskes i vann fra springen, fulgt av avionisert vann og deretter skylles to ganger med etanol.
- Sonikere kobber bærere i aceton i 15 minutter.
- Plasser bærere på filter papir for å tørke.
- Fest en ring av dobbeltsidig tape til en kobber bærer (figur 1C), som vil tjene som holder godt for trimmet blokken (holder carrier).
- Frysing av prøven
MERK: Håndteres flytende nitrogen med omhu og bruk riktige briller.- Slå på høytrykks gratisZing enhet (figur 1 F) i minst 1,5 timer før start med prøven frysing.
- Begynn oppvarming ved å trykke på "AIR HEATER" -knappen, og bake ut for 50 min. Still lufttemperatur til 80 ° C.
- Koble nitrogentanken til høytrykksfryseenhet og trykk på "Nitrogen" -knappen for å fylle innsiden Dewar med flytende nitrogen. De "NITROGEN LEVEL" lampe lyser. Begynn kjøling ved å trykke på "Cooling" -knappen.
- Trykk på "DRIVE IN" knappen når "NITROGEN LEVEL" går ut. Sjekk at det hydrauliske systemet beveger stempelet frem og tilbake 3 ganger.
- Trykk på "AUTO" -knappen, og "Nitrogen" -knappen. Så snart "READY" lyser, er høytrykksfryse enheten klar for høytrykks frysing.
- Plasser en trimmet blokk i hullet på dobbeltsidig tape (figur 1B) ved hjelp av en platinatråd sløyfe som har blitt smeltet inn aglass pipette.
- Fjerne overskuddet av cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen ved hjelp av filterpapir eller en børste.
NB: Denne fremgangsmåten er også viktig å fjerne luftbobler som kan dannes rundt vev, og som kan føre til forvrengning av vevet form og / eller ultrastruktur. - Under et stereomikroskop, dekker holde bæreren med en annen transportør, slik at vevet blokken er klemt mellom de to bærere.
- Sett bærelagene inn i prøveholderen av høytrykksfryseenhet (figur 1D). Sett prøveholder inn i høytrykksfryseenhet (spissen ned) og fest den ved å skru på prøveholderen.
- Initiere frysesyklus ved å trykke på "Jet-Auto" -knappen. Arbeider så raskt som mulig, fjern prøveholder og senk spissen med flytende nitrogen i en isolert boks. Dyppe spissene av to par tenger i flytende nitrogen for å avkjøle dem.
- fjerne th nøyee carrier-sandwich fra prøveholderen og legg den i en pre-kjølt kryoampulle. Sørg for at operatører kun behandles med flytende nitrogen kjølte tang. Cryovials bør være perforert for å tillate nitrogen å strømme ut fra ampullen (figur 1G).
- Gjenta trinn 3.2.6 til 3.2.11 til alle ønskede prøvene har vært frosset. Flere bære-smørbrød inneholdende den samme type av prøve kan lagres i den samme beholderen.
- Oppbevar cryovials inneholder operatører i en kryotanken til replikering (figur 1 H).
Figur 1. Tissue Forberedelse og Høytrykks Frysing. (A) Vibroslicer brukes § vevet. (B) En resulterende koronale mus hjernen delen inneholder amygdala vist side ved side med acopper bærer utstyrt med en ring av dobbeltsidig tape. Den stiplede boksen angir området av interesse som inneholder den mediale paracapsular klynge av ITC. Diameteren av hullet i den dobbeltsidige tapen er omtrent 1,5 mm. (C) Verktøy for tillaging av kobber bærere. Fra øverst til venstre med klokken: dobbeltsidig tape, pinsett, puncher, kobber bærere, og saks. (D) Innsetting av bærelagene inn i prøveholderen for høyt trykk frysing. Bæreren lagene er plassert i hullet i prøveholderen. (E) Kobber bærere uten og med en ring av dobbeltsidig tape og "carrier-sandwich". (F) Høytrykk fryseinnretningen med trykksatt tank mating av flytende nitrogen til den. (G) En kryoampulle å lager de frosne vev. Merk hullene i øvre midtstilling på hetteglasset slik at nitrogengass å strømme ut av hetteglasset (pilspiss).
4. Freeze-brudd og Replication
- Utarbeidelse av elektronstrålekanoner
- Før du setter elektronstråle våpen, fjerne skjoldet med "ledeplaten". Plasser "-innstillingen måler" for å sentrere filament i chucken gjennom den nedre katoden dekselet.
MERK: større diameter slutten av sette måleren brukes for karbon pistolen, mens den mindre end diameteren er for platina pistolen. - Skyv det nye filament over malen inntil "trykket lamina» kan klemme fast endene av filamentet, slik at filamentet spolen ikke ligger på skrå.
- Fjern innstillingen måleren og sette inn karbon stang. Fikse det ved å stramme coklumpen chuck av fordamperen stangholderen, slik at høyden på enden av stangen er ved midten av den annen spole fra bunnen. For platina gun, bør høyden på enden av platina stangen være på midten av den andre filament spolen ovenfra.
- Sett på ledeplaten og sett våpen inn i fryse brudd enhet. Rengjør våpen med en sand-blaster etter bruk.
- Før du setter elektronstråle våpen, fjerne skjoldet med "ledeplaten". Plasser "-innstillingen måler" for å sentrere filament i chucken gjennom den nedre katoden dekselet.
Figur 2. Illustrasjon av de viktigste trinnene i FRIL Technique.
Oversikt over de ulike trinnene som kreves for forberedelse og analyse av kopi. (1) under høyt trykk frysing av vev. (2) Frakturering. Under frakturering av frosset vev, blir det ytre lipid bilaget av plasmamembraner delt inn i to halvdeler ved den hydrofobe grensesnittet. Proteiner i plasmamembranen er fordelt på enten exoplasmic (E-ansikt) eller protoplasmic membraner (P-ansiktet). (3) Replication. Fordampningen av karbon (C) feller lipider og proteiner på overflaten av det frakturerte vev. Materialet er belagt med 2 nm platina / karbon for skygging ved en 60 ° vinkel, og deretter med en annen 15 nm lag av kull som styrker strukturen av replika (C-laget, Pt-skygging). (4) Solubilisering. Vevet ikke fanget opp av replika membranen blir deretter solubilisert med SDS-løsning. (5) Merkings. Proteiner av interesse kan visualiseres på replika ved hjelp av et kompleks som består av spesifikke primære antistoffer (Primary AB) og sekundære antistoffer (Secondary AB) konjugert med en gullpartikkel (Au). Bruken av forskjellige størrelser av gullpartiklene tillater påvisning av mer enn ett protein på samme kopi. (6) Etter immunolabeling, er kopier samlet på kobber mesh nett og analysert med en transmisjonselektronmikroskop ved 80 -. 100 kV Vennligst CLICk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Sett opp av fryse fraktur enhet
- Slå på fryse brudd enheten (figur 3A) ved å slå strømnettet til 1. For en detaljert beskrivelse av fryse-brudd og replikering prosedyrer, se bruksanvisningen fra produsenten.
- Før avkjøling av den frysebruddanordning, bake ut hele kjølesystemet for enheten med varm luft. Trykk på "Tining" -knappen i MTC 010-enheten (temperaturstyringsenhet) (figur 3A) og la den bake ut prosessen kjøres i 45 min.
- Aktiver vakuum stasjonen. Frys brudd enheten opererer vanligvis i et vakuum spekter av ~ 10 -6 til 10 -7 mbar.
- Fyll nitrogen tank og koble den til den fryse brudd enhet. Kontroller at ventilholderen er tørr og også rense oppføring av tanken før innsettingen av ventilholderen (fuktighet kan forstyrre vacuum og angivelse av N2 fylling av tanken).
- Begynn kjøling ved å sette temperaturen til -115 ° C. Kjøling tar ca 45 min.
- Sett elektronstråle våpen og justere strøm og spenning for å nå følgende parametre for fordampning:
Carbon pistol: rotasjon på, posisjon 90 °, frekvensen av karbon opphopning 0,1 til 0,2 nm / sek
Carbon-platinum gun: rotering, posisjon 60 °, frekvensen av opphopning 0,06 til 0,1 nm / sek
MERK: Hvis en pistol brukes for første gang etter utvekslingen av karbon eller platina stang, avgassing i 3 minutter før bruken.
- Frakturering og replikering
- Sett frosne carrier-smørbrød til dobbel replikattabell gjør at alle manipulasjoner er gjort i flytende nitrogen.
- Overfør dobbel replika bord i et Dewar-kar, og feste den til prøvetrinnet mottakeren i en vinkel på 45 °. Den flytende nitrogen nivå skal alltid være over dobbelt replikattabell. Plukk opp den doble replikattabell med tabellen manipulator og sett den inn i fryse brudd enheten på den kalde scenen. Vent i omtrent 20 minutter slik at temperaturen av den doble replikattabell for å justere til -115 ° C.
- Kontroller at vakuum er under 10 -6 mbar og temperaturen er -115 ° C.
- Frakturere vevet ved manuell mot urviseren rotasjon av hjulet som er koblet til dekselet plasseres over den doble replikattabell. Når liksvøpet svinger, tvinger det dobbel kopi tabellen for å åpne, oppsprekking vevet.
- Trykk på "Høy spenning" -knappen i EVM 030-enheten (elektronstråle fordampning kontrollenhet) av fryse fraktur enheten (figur 3A).
- Replikere de eksponerte overflater av det frakturerte vev (figur 3C) ved fordampning av karbon (roterende) ved hjelp av en elektronstrålekanon plassert i en 90 ° vinkel til en tykkelse på 5 nm, etterfulgt av en ensrettet Shadovinge med platina-karbon ved en 60 ° vinkel til en tykkelse på 2 nm. Til slutt legges en 15 nm tykt lag av karbon fra en 90 ° vinkel (roterende).
- Bruk følgende parametere for fordampning:
Første karbon: rotasjon på, posisjon 90 °; hastighet 0,1 til 0,2 nm / sek; 5 nm
Andre karbon-platinum: posisjon 60 °; speed 0,06 til 0,1 nm / sek; 2 nm
Tredje karbon: rotasjon på, posisjon 90 °; hastighet 0,3 til 0,5 nm / sek; 15 nm - Fjern de replikerte prøvene fra frysebruddenheten og overføre dem til et keramisk 12-brønns plate (figur 4A) som er fylt med TBS (Tris-bufret saltoppløsning, pH 7,4).
- Ved hjelp av en platina loop wire stang, fjern replikert vev fra prøvebærer (Figur 4A).
- Gjenta trinn 4.3.1 til 4.3.10 før alle prøvene har blitt kopiert.
(A) Det fryse brudd enhet. Maskinen inneholder flere styreenheter og en skjerm. Prøver som innføres i kammeret gjennom en port på venstre side av kammeret. En trykksatte flytende nitrogen beholder er koblet til frysebruddenhet for å kjøle scenen. Bildene under viser forstørret utsikt over to av enhetene (UPC 010 og MDC 010) og skjermen viser parametre under fordampning av andre karbon lag. (B) Åpnet (til venstre) og lukket (høyre) utsikt over dobbelt kopi bordet. De "carrier-sandwiches" er satt inn i sporene i bordet (angitt med pilene). De små armene hindre "carrier-smørbrød" faller ut under manipulasjon. (C) En brukket og replikert prøven. Kopier vises som tynne sorte filmer på toppen av brukket vev.53 / 53853fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- SDS-fordøyelse av replika
- Overføring replika til et 4 ml glassflaske fylt med 1 ml av SDS-fordøyelse buffer (2,5% natriumlaurylsulfat, 20% sukrose i 15 mM Tris, pH 8,3). Digest i 18 timer ved 80 ° C med risting (45 slag / min).
- Overføring kopier til et nytt rør fylt med SDS-fordøyelsen buffer og oppbevar ved romtemperatur.
5. Immunolabeling
NOTE: Alle inkubasjoner utføres ved romtemperatur med forsiktig risting, med unntak av inkubasjoner med antistoffer.
- Vask replika i 10 minutter i frisk SDS-fordøyelsen buffer.
- Vask replika en gang med 2,5% BSA (bovint serumalbumin) i TBS i 5 minutter, og deretter 3 x 10 minutter med 0,1% BSA i TBS.
- Blokk ikke-spesifikke bindingsseter i TBS med 5% BSA i 1 time.
- Påfør primære antiorganer fortynnet i 2% BSA-TBS. Utføre inkubasjoner i en 30 ul dråpe (figur 4B) i et fuktighetskammer ved 15 ° C i 72 timer (figur 4C).
- For denne studien prosessen både kopier fra brukket vev. Inkuber en kopi med et marsvin-polyklonalt antistoff dannet mot aminosyrene 717 - 754 av musen GluR1 felles for alle AMPA-R-subenheter (fortynning: 1: 200) eller et monoklonalt antistoff fra mus fremstilt mot et rekombinant fusjonsprotein som omfatter aminosyrer 660 - 811 av den NR1-subenheten av den NMDA-R (fortynning 1: 500), og et kanin polyklonalt antistoff dannet mot grønt fluorescerende protein (fortynning 1: 300).
- Inkuber den andre replika med et kanin polyklonalt antistoff dannet mot et syntetisk peptid tilsvarende aminosyrene 384 - 398 av rotte μ-opioid-reseptor (fortynning 1: 500).
- Vask i TBS med 0,05% BSA (3 x 5 min.).
- Påfør sekundære antistoffer. For denne studien use gull (5 nm for ionotrope glutamatreseptorer, 10 for μ-opioidreseptorer og / eller 15 nm for ChR2-YFP) konjugerte antistoffer utvannet i TBS med 2% BSA. Fortynn sekundære antistoffer 01:30 og inkuberes i et 30 ul dråpe ved 15 ° CO / N.
- Vask 3 x 5 minutter i 0,05% BSA-TBS ved romtemperatur.
- Vask 2 x 5 min i ultrarent vann.
- Mount kopi på formvar-belagt 100-linje skranke nettet (figur 4D).
6. Replica Analysis
- Bilde kopier med et transmisjonselektronmikroskop (TEM) ved 80 eller 100 kV. Tilegne seg digitale bilder gjennom en CCD (CCD) kamera.
- Offline, finne tilsvarende områder på bilder fra begge kopier ved hjelp av landemerker (figur 4E). Analyser digitale bilder ved hjelp av Image J. Bestem postsynaptiske området og antallet immungullmerkede partikler rettet mot reseptoren analysert.
Figur 4. Immunolabeling av Replica.
(A) Verktøy for å manipulere og vask av kopier. En keramisk 12-brønns plate (øverst til høyre) og 2 typer glass pipetter (øverst til venstre). Glasset pipette med rund spiss (nederst til venstre) blir brukt til å overføre replika, og pipetten med platina stang (nederst i midten) anvendes for å brette ut kopier. En replika i vaskebuffer (nederst til høyre). (B) Immunolabeling av replikaene blir utført i dråper (30 ul) plassert på et lite stykke parafilm i en brønn i en vevskultur 6-brønns plate. Legg merke til at en kopi er dekket av et slipp av buffer inneholdende antistoff. For å forhindre fordampning, er et fuktet stykke silkepapir montert rundt den indre kant av brønnen. (C) Inkubator for immunolabeling trinnet. Inkuberinger ble utført ved 15 ° C. (D) En kopi montert på en formvar belagt 100-linjen skranke rutenett. (E) lav forstørrelse mikrografer fra et par kopier. De stiplede firkantene angir tre typiske landemerker til å identifisere en plassering i tilsvarende kopier. Skala: 10 mikrometer. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Den FRIL teknikk, når det kombineres med ekspresjon av optogenetic aktuatorer av mikrobiell opprinnelse 21, dvs. i kanaler i plasmamembranen og effektivt transporteres anterogradely langs aksoner, gjør det mulig å undersøke kvantitativt den postsynaptiske ekspresjon av AMPA-R og NMDA-R ved en definert undergruppe av synapser. Dette er vist her for aksoner som stammer fra distinkt thalamic kjerner (for eksempel PIN / MGN) på ITC nevroner i amygdala. Denne tilnærmingen muliggjør en molekylær analyse av enkeltsanseinntrykk synapsene til ITC-neuroner, en gruppe av celler som har vært motstandsdyktige overfor en detaljert anatomisk og molekylær karakterisering hittil.
Fire uker etter at stereo injeksjon av rAAV-ChR2-YFP inn PIN / MGN, ChR2-YFP-positive axoner tett innervated LA, det amygdalostriatal overgangsområdet (Astria) og den mediale paracapsular jeg TC klyngen i amygdala, et mønster helt i tråd med tidligere tracing studerer 16, 22. Vi har også oppdaget intens gull immunolabeling for ChR2-YFP på P-ansikt av axoner og terminaler i fryse brudd kopi fra rAAV-ChR2-YFP- injiserte mus (figur 5A), men ikke i replikaer fra ikke-injiserte mus. Den postsynaptiske membran spesialisering av glutamaterge synapser i en replika kan observeres som en klynge av intramembrane partikler (IMP) på E-overflate av plasmamembranen 2, 23, og er ofte ledsaget av P-flate av dens presynaptiske plasmamembranen 7 (Figur 5B-C). Disse funksjonene lov til å identifisere den postsynaptiske spesialisering av glutamaterge synapser dannet av PIN / MGN axon klemmene (figur 5 og 6). Vi merket AMPA-R med et antistoff som gjenkjenner alle de fire subenheter (GluA1-4), mens NMDA-R ble påvist ved anvendelse av et antistoff mot det vesentlige NR1-subenheten.
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> På grunn av manglende verktøy for å oppdage på samme replika om disse synapsene ble gjort med dendrittutløperne eller skaft av ITC nevroner, merket vi det tilsvarende kopi ansiktet for μ -opioid reseptorer, som ITC nerveceller uttrykker postsynaptisk høye nivåer av disse reseptorene 24. Dette gjorde det nødvendig å identifisere de samme postsynaptiske profilene i de to kopier (figur 5C-F og figur 6A-D) ved hjelp av en strategi som benytter landemerker (figur 4E) .
Figur 5. Påvisning av ChR2-YFP og ionotrope glutamatreseptorer på replika av en immun Particles. (A) En kryss-frakturert axon terminal (lys blå) og små deler av sin P-ansikt merket med 15 nm gull-partikler som detekterer ChR2-YFP. I terminalen, membranen of mange synaptiske vesikler kan observeres (sv). Legg merke til spesifisiteten av immunolabeling i stor grad begrenset til plasmamembranen. Merking for ChR2 identifiserer terminalen som stammer fra PIN / MGN. Terminalen danner en asymmetrisk synapse med en ryggrad. Den postsynaptiske membran spesialisering (PSD) på E-ansikt viser en karakteristisk klynge av intramembrane partikler og er merket med 5 nm gullpartikler avslørende AMPA-R. (B) P-ansiktet til en ChR2-uttrykke axon (merket med 15 nm gullpartikler) er vist grenser to dendritter, en av dem som innehar to PSD merket med 5 nm gullpartikler avslørende NMDA-R. (CD) motsatt ansikter av pre- og postsynaptiske membraner av en PIN / MGN-ITC synapse. (C) P-overflate av terminalen uttrykker ChR2 (merket med 15 nm gull-partikler) og strekker seg over E-ansiktet av to dendrittiske aksler, en av dem inneholdende to PSD merket for AMPA-R (5 nm gullpartikler). (
Immunoparticles for AMPA-R i PIN / MGN-ITC synapser ble funnet over hele IMP klyngen, noe som tyder på en homogen fordeling innenfor den postsynaptiske spesialisering (figur 5E). En signifikant høyere (uparet t-test p <0,018) tetthet av AMPA-R merking ble observert i PIN / MGN synapser på ITC pigger (715 ± 38 gullpartikler / mikrometer 2, n = 32) sammenlignet med synapser bort på ITC dendritter (590 ± 44 gullpartikler / um 2, n = 32). Totalt sett tettheten av AMPA-R i PIN / MGN-ITC synapser viste en relativt lavvarians (Koeffisient for varians, CV = 0,37) var i overensstemmelse med en homogen fordeling.
Immunoparticles for NMDA-Rs i PIN / MGN-ITC synapser ble ofte observert ujevnt fordelt i postsynaptiske IMP klynger (Figur 5B). Tettheten av NMDA-R-merking var lik (uparet t-test p = 0,39) mellom PIN / MGN synapser på ITC pigger (1070 ± 153 gull partikler / um 2, n = 8) og ITC dendritter (812 ± 183 gullpartikler / um 2, n = 9). I motsetning til hva som ble observert for AMPA-R, tettheten av NMDA-Rs i PIN / MGN-ITC synapser var svært variabel (CV = 0,54).
Figur 6. AMPA-R og NMDA-Rs Immunolabeling på Identifiserte PIN / MGN-ITC synapser.
(AB) motsatt ansikter av pre- og postsynaptiske membraner av en PIN / MGN-ITCsynapse gjort på en dendritisk ryggraden i hvilken P-overflate av terminalen uttrykker ChR2 (merket med 15 nm gull-partikler) og PSD på en dendritisk ryggrad er merket for AMPA-R (5 nm gullpartikler). (CD) Forstørrede utsikt over de områdene skissert av den stiplede linjen. Disse områdene har blitt rotert ca 45 ° mot klokken for å tillate en bedre visning av PSD. (E) Scatterplots av antallet AMPA-R partikler versus synaptisk område i ITC pigger og dendritter. I begge strukturene har en positiv korrelasjon ble observert. (F) Scatterplots av antall NMDA-R-partiklene mot synaptisk område i ITC pigger og dendritter. En signifikant positiv korrelasjon ble oppdaget bare i dendrittutløperne. Skala barer. 500 nm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
FordiP-overflate av presynaptiske plasmamembranen ofte overlagt delvis den postsynaptiske IMP klyngen, kan vi anslå den synaptiske område på bare 30% av synapsen (piggene: bety området 0,032 mikrometer 2, Område: 0,007 til 0,063 um 2, n = 8, dendritter: 0,047 mikrometer 2, range: 0,024 til 0,166 mikrometer 2, n = 11). Disse var i en lignende område som tidligere analysert telencephalic glutamatergic synapser 25.
I begge pigger og dendritter, ble antall gull immunoparticles for AMPA-R i enkelte synapser positivt korrelert med den synaptiske området (Spearman, pigger: r = 0,88, dendritter: r = 0,60, p <0,0001) (figur 6E). Motsatt ble antall gull immunoparticles for NMDA-Rs funnet å korrelere med den synaptiske området i pigger (Spearman, spines: r = 0,90, p <0,002), men ikke i dendritter (r = 0,21, p = 0,29) (figur 6F ).
Discussion
Freeze-fraktur elektron mikroskopi har vært en stor teknikk i ultra forskning i over 40 år. Men mangelen på effektive midler for å studere den molekylære sammensetning av membraner fremstilt en betydelig nedgang i bruken. Nylig har det vært en stor vekkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopi på grunn av utviklingen av effektive måter for å vise integrerte membranproteiner av en immunmerking 1, 2, nemlig FRIL teknikk.
Den FRIL teknikk besitter flere fordeler fremfor andre immungullultra metoder. Først proteinene er lett tilgjengelig for antistoffer øker følsomheten. For det andre, eksponering av stor del av plasmamembran fordypninger, slik som den postsynaptiske membranen, på den to-dimensjonale overflate av replika tillater inspeksjon av den romlige fordelingen og fysisk contiguity av molekyler av interesse uten arbeidskrevende og tidkrevende rekonstruksjon av serial supertynne seksjoner. For det tredje, tilgjengeligheten av begge halvdeler av plasmamembranen øker antall proteiner som kan merkes for hver enkelt struktur, forutsatt at egnede antistoffer er tilgjengelige. Ved frakturering, er den hydrofobe overflate av splitten membran belagt med karbon-platina som entrenches proteindomener igjen på brukket overflaten. Dette forhindrer adgang av antistoffer mot antigener i disse domenene. For eksempel på P-ansiktet til en kopi kun epitoper som vender mot protoplasmiske plass kan detekteres ved antistoffer, mens på den E-ansikt bare epitoper som vender mot exoplasmic plass kan være bundet av antistoffer (se figur 2).
På den annen side, FRIL teknikk lider også av visse begrensninger 2. Som frakturer oppstår tilfeldig, kan det være vanskelig å målrette bestemte celler eller strukturer. Dette kan også føre til en samplings forspenning, for eksempel i synapse samling, gitt forskjellig sannsynlighet for FRActuring langs membranen av strukturer med forskjellig krumning (f.eks, pigger versus sjakter). Dessuten er fordelingen av membranproteiner til en av de to flater uforutsigbar. Derfor er fordelingen av et protein til P-ansikt eller E-ansikt, særlig for kvantitative analyser, bør være nøye undersøkt ved hjelp av antistoffer som er reaktive mot intracellulære og ekstracellulære domener. Til slutt, identifikasjon i replika av visse strukturer, slik som presynaptiske terminaler axon, kan være vanskelig når kun basert på morfologiske egenskaper. Imidlertid er bruk av spesifikke antistoffer for markørproteiner eller transduksjon av merket integrerte membranproteiner eller kanaler ved hjelp av virale vektorer og tilbyr flere verktøy lette identifisering av de frakturerte membraner. For eksempel denne studien tok fordel av transduksjon av ChR2-YFP i thalamic nevroner å identifisere sine aksonal efferents i amygdala eller merking for μ-opioidreseptorer å avsløre postsynaptiske megmbranes av ITC nevroner.
For å utføre den FRIL teknikken med hell, bør det tas spesielt hensyn angå vev fiksering. Sterk vev fiksering (> 2% paraformaldehyd) kan resultere i en høy grad av tverr frakturer og en reduksjon i følsomhet merking. På den annen side, svake bindinger gjøre vevet håndtering og forberedelse (f.eks skjæring av snitt) vanskelig. Det er også viktig å kontrollere at tykkelsen av den trimmede blokkene samsvarer med tykkelsen av dobbeltsidig tape. Dersom tykkelsen av prøven er lavere enn det sted på båndet, kan overflatene av de vev ikke fester seg til overflaten av de to metallbærere, er følgelig de frosne prøven ikke fraktureres. Når vevet er tykkere, vil den bli sammenpresset med uunngåelige struktur forvrengninger når sandwich av de to kobber bærere er gjort. Den temperatur ved hvilken prøven blir brukket (i denne protokollen, -115 ° C) spiller også en viktig rollepå strukturen av replika. Høyere temperaturer kan gi en høyere grad av gjenstander slik som kondensasjon av vanndamp på overflaten av vevet før eller under fordampning. Lavere temperaturer (<-125 ° C) kan øke risikoen for avspaltning av materiale under frakturering. Dette materialet kan falle på overflaten av prøven, eller være koblet til den. Disse flak av materialet er også belagt og kontras produsere mørke flekker på bildet. Frakturering ved lavere temperaturer kan også påvirke hyppigheten av tverr frakturer særlig for mindre fin struktur som for eksempel dendrittutløperne. Et ytterligere kritisk trinn i fremstillingen av kopier er detergent-fordøyelse. Hvis fordøyelsen er ufullstendig, vises ufordøyd vev som mørke flekker på replika, konfunderende analyse av strukturen i TEM. Dessuten kan ufordøyd vev ikke-spesifikt felle eller binder antistoffer, noe som øker bakgrunnsmerking. På den annen side, bruk av vaskemiddels for vevsfordøyelse kan denaturere molekylene er knyttet til den kopi endre deres sekundære og tertiære strukturer. Derfor, for visse antigener kan det være nødvendig å gradvis fortynne konsentrasjonen av SDS med ekstra vasketrinn.
For immunolabeling, tilgjengeligheten av forskjellige størrelser av gull partikler konjugert til sekundære antistoffer gjør det mulig å detektere på samme tid, men bare kvalitativt, multiple proteiner, til og med i bestemte mikroområder av plasmamembranen, slik som den postsynaptiske fordypning. Men på grunn av sterisk hindring, kvantitative studier er generelt begrenset til deteksjon av bare ett molekyl. Størrelsen på gull partikkelen kan også påvirke den merking effekt.
For tolkningen av merkingen i FRIL, bør det tas i betraktning at en immun partikkel kan være plassert hvor som helst innenfor en halvkule med en radius på 20-25 nm fra antigenet på grunn av den fleksible kompleks formed ved den primære og sekundære antistoff 26. For ytterligere informasjon om teori og praksis av FRIL og relaterte teknikker, henviser vi leseren også til andre metodiske artikler 27, 28.
Den FRIL teknikken har nylig blitt brukt for høyoppløselige kvantitative analyser av glutamat reseptor lokalisering i ulike synapse populasjoner 29, 30. Videre følsomhet av FRIL teknikk for AMPA-R ble anslått så høyt som en immunogold partikkel per en funksjonell AMPA -R kanal 29. Dermed er denne tilnærmingen generelt svært nyttig å kvantifisere og analysere mønster av postsynaptiske uttrykk for AMPA-R og NMDA-R på sentrale synapser. Her viste vi at dette også gjelder på PIN / MGN-ITC synapser, et nettsted mest sannsynlig viktig for videresending US informasjon under frykt condition. Ved hjelp av et antistoff dannet mot høyt konserverte ekstracellulære aminosyrerester av AMPA-reseptor-underenhetene GluA1-GluA4, har vi funnet en jevn fordeling av gullpartiklene i IMP klynger svarende til postsynaptiske membran fordypninger. Tettheten av AMPA-R i ITC pigger var betydelig høyere sammenlignet med aksel synapser målrettet av PIN / MGN thalamic afferente. At både rygg og aksel synapser, ble en positiv korrelasjon mellom merking for AMPA-Rs og postsynaptiske området oppdaget, en funksjon som er felles for andre glutamaterge synapser 25. Den lave variasjon i tetthet av AMPA-R i PIN / MGN-ITC synapser indikerer en homogen fordeling lik andre synapser dannes ved thalamic efferents 7, men forskjellig fra kortikale synapser 25. Motsatt, tettheten av NMDA-R var mer variable og skilte seg ikke mellom rygg og aksel synapser foreslå en annen regulering enn AMPA-R. I fremtiden vil det høy reproduserbarhet av FRIL teknikk ikke bare tillater å bedømme den basale molekylære sammensetningen av sentrale synapser, men kan legge til rette for deteksjon av cHanges i ionotrope glutamatreseptorer tall og subsynaptic fordeling etter frykt læring, supplerer ex-vivo opptak av pre- og postsynaptiske egenskapene til disse inngangene.
Som konklusjon, kan denne tilnærmingen brukes av andre forskere for å få innsikt i struktur-funksjon relasjoner på innsatsspesifikke eksitatoriske synapser i mange andre nevrale kretser hvor løsrive opprinnelsen av inngangene og arten og sammensetningen av postsynaptiske elementene er avgjørende, men problematisk .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Stereotactic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
| Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue preparation | |||
| Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
| Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
| Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
| NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
| NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
| 4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
| Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
| GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
| Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
| Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
| Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
| Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
| Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-pressure Freezing | |||
| Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
| Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
| Chamois skin | Household supply store | ||
| Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
| Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
| Acetone | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
| High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
| Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
| Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
| Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
| CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
| CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
| Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
| Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-fracture and Replication | |||
| Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
| Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
| Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
| Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
| Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
| Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
| Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
| SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
| Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
| TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
| Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunolabelling | |||
| BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
| Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
| Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
| Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
| Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
| EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody | BBInternational, UK | EM.GAG5 | |
| EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody | BBInternational, UK | EM.GAR15 | |
| Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
| Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
| Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
| Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
| Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EM analysis | |||
| Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
| Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
| iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |
References
- Fujimoto, K. SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application. Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).
- Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).
- Rash, J. E., Yasumura, T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis. Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).
- Emes, R. D., Grant, S. G. Evolution of synapse complexity and diversity. Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).
- Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).
- Rollenhagen, A., Lübke, J. H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function. Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).
- Tarusawa, E., et al. Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses. J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).
- Nusser, Z., et al. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).
- Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus. Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).
- Nicholson, D. A., Geinisman, Y. Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala. Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).
- Duvarci, S., Pare, D. Amygdala microcircuits controlling learned fear. Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).
- Jüngling, K., et al. Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala. Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).
- Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Maren, S. Neurobiology of Pavlovian fear conditioning. Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Sigurdsson, T., et al. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Bienvenu, T. C. M., et al. Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information. J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).
- Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes. Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).
- Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction. Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).
- Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).
- Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
- Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).
- Tanaka, J., et al. Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum. J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).
- Mansouri, M., et al. Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex. Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).
