This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.
Freeze-fraktur elektron mikroskopi har vært en stor teknikk i ultra forskning i over 40 år. Men mangelen på effektive midler for å studere den molekylære sammensetning av membraner fremstilt en betydelig nedgang i bruken. Nylig har det vært en stor vekkelse i frysebruddelektronmikroskopi takket være utviklingen av effektive måter for å vise integrerte membranproteiner av immunogold merking. En av disse metodene er kjent som vaskemiddel-solubilisert Freeze-brudd Replica Immunolabeling (FRIL).
Kombinasjonen av FRIL teknikken med optogenetics tillater en korrelert analyse av de strukturelle og funksjonelle egenskaper sentrale synapser. Ved hjelp av denne metode er det mulig å identifisere og karakterisere både pre- og postsynaptiske neuroner ved deres respektive ekspresjon av et tagget channelrhodopsin og spesifikke molekylære markører. Den karakteristiske utseendet på postsynaptiske membranen spesialisering av glutamaterge synapser tillater videre, ved merking av ionotrope glutamatreseptorer, for å kvantifisere og analysere intrasynaptic fordelingen av disse reseptorene. Her gir vi en steg-for-steg beskrivelse av de krav som stilles for å forberede parvise kopier og hvordan du immunolabel dem. Vi vil også diskutere begrensninger og begrensninger i FRIL teknikk, særlig de som er forbundet med potensielle prøvetaking skjevheter. Den høye reproduserbarhet og allsidighet av FRIL teknikk, når kombinert med optogenetics, og tilbyr en svært kraftig metode for karakterisering av ulike aspekter av synaptisk overføring på identifiserte nevrale kretser i hjernen.
Her gir vi et eksempel hvordan denne tilnærmingen ble brukt til å få innsikt i struktur-funksjon relasjoner av eksitatoriske synapser på nevroner i interkalerte celle masser av musen amygdala. Spesielt har vi undersøkt ekspresjon av ionotrope glutamatreseptorer ved identifiserte innganger elleriginated fra thalamus bakre intralaminar og mediale leddet kjerner. Disse synapser ble vist til stafett sensorisk informasjon som er relevant for frykt læring og gjennomgå plast endringer på frykt condition.
Definisjonen av funksjonell arkitektur av biomembraner i nanometerskala har blitt utfordret i de senere år ved utvikling av en rekke immunolabeling teknikker som er egnet for transmisjonselektronmikroskopi. Men disse teknikkene, for eksempel før og etter embedding immunogold, har en rekke viktige begrensninger, som inkluderer dårlig deteksjon av antigener og / eller begrenset kvantitativ vurdering av membranbundne proteiner. Disse begrensningene blir spesielt kritisk i etterforskningen av den fine strukturen i nervesystemet, som er preget av en høy grad av celle mangfold og synapse heterogenitet. Denne heterogenitet resultater fra både strukturell og funksjonell diversitet diktert av pre- og postsynaptiske elementene og ved den differensielle ekspresjonen, berikelse, eller interaksjon av signaliseringsproteiner, slik som reseptorer, transportører, og effektor molekyler.
En ny tilnærming for direkte immunolabeling av integrerte eller tverrbundet membran proteiner i vaskemiddel-solubilisert fryse-fraktur kopier (FRIL) ble opprinnelig introdusert av Fujimoto to tiår siden en. Denne originale metode hadde imidlertid flere begrensninger, dvs. betydelig fragmentering av kopier, som hemmet meningsfull korrelasjon av merkede molekyler med individuelt tilordnede celler i komplekse vev slik som hjernen. Omtrent 10 år siden, Shigemoto og Fukazawa gradvis forbedret teknikken 2. Dette ble Parallelt med innsats fra en annen gruppe forskere ved Boulder laboratorier av Colorado State University, som også betydelig forbedret teknikken, særlig for studiet av gap veikryss 3.
Forbedringen i fryse fraktureringsteknikker protokoller og maskiner, samt innføring av hurtig frysing (under høyt trykk), kan nå undersøkere for å frembringe ubrutt kopier av prøvestykker av forholdsvis stor størrelse og hikvalitetsbilder gh av de fleste cellulære komponenter uten begrensninger og gjenstander produsert av sterke kjemiske bindinger.
Den FRIL teknikk har den store fordelen av en meget kvantitativ in situ identifikasjon av ett eller flere proteiner (samtidig) i histologisk kartlagt og identifisert cytologisk celler i løpet av komplekse vev slik som hjernen, med den ekstra fordelen av et planriss av pre- og postsynaptisk elementer i en enkelt kopi. Derfor er det FRIL teknikk, til tross for sine mange tekniske hindringer, holder løftet for en rekke meget viktige vitenskapelige gjennombrudd, spesielt for korrelasjonen av strukturelle og funksjonelle egenskaper hos de enkelte synapser. I løpet av de siste tiårene, har en god del informasjon er innhentet på strukturen, molekylær sminke, og fysiologiske funksjon av synapser; ennå synapser er morfologisk og molekylært svært varierte avhengig av pre og postsynaptiske paleie nevroner 4. Bare for en håndfull av synapse typer var struktur-funksjon studier oppnådd så langt 5-7. Dette var hovedsakelig på grunn av tekniske begrensninger som hindret en presis identifisering av arten av de pre- og postsynaptiske elementer.
Ultra analyse har gitt kritisk innsikt inn i variasjonen av postsynaptiske membran fordypninger på tvers adskilte synaptiske kontakter både i form av synaptiske størrelse og innhold i nevrotransmitterreseptorer 6, som har en stor innvirkning på styrken og plastisitet av synaptisk transmisjon. Videre, en stor mengde forskning viser at antall ionotrope glutamat reseptorer uttrykt på ulike typer synapse er regulert i en afferent- og target-avhengig måte 7-10.
Her er en fremgangsmåte beskrevet som tillater analyse av strukturen og sammensetningen av reseptoren postsynaptiske membran fordypninger med definered presynaptiske elementer og funksjon. Denne fremgangsmåten utnytter presynaptisk ekspresjon av nylig utviklede lysfølsomme alge proteiner, slik som channelrhodopsin2 (ChR2), og av den FRIL teknikk for å analysere mønsteret av postsynaptiske ekspresjon av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-Rs) og N-metyl-D-aspartat (NMDA-Rs) glutamatreseptorer. Dette er demonstrert ved synapser dannes av aksoner som stammer fra de bakre thalamic-mediale leddet kjerner (PIN / MGN) på nerveceller i interkalerte celle masser av amygdala (ITC). ITC nevroner er små pigg gabaergic celler organisert i klynger rundt basolateral amygdaloid kompleks (BLA) 11, 12. ITC nevroner er kjent for å motta eksitatoriske innspill fra BLA viktigste nevroner og å målrette den sentrale kjernen (CEA), og dermed fungerer som en hemmende gate for informasjonsflyt mellom BLA og CEA 12-15.
Nylig har vi demonstrert at ITC nevroner lokalisert i medio-dorsal cluster mellom BLA og CEA også motta direkte og konvergent eksitatoriske innspill fra sensoriske thalamic og time kortikale regioner, som er modifisert på frykt læring under Pavlovian auditiv frykt conditioning 16. Frykt condition er en av de best forståtte former for assosiativ læring i form av hjernemekanismer. I frykt condition, en i utgangspunktet nøytral betinget stimulus (CS, for eksempel, en tone) er sammenkoblet med en motvilje ubetinget stimulus (US, for eksempel en mild foten sjokk) som resulterer i en CS-amerikanske foreningen og betinget frykt respons 17, 18. Eksitatoriske innspill fra både thalamic og neokortikale områder, som bærer informasjon som representerer CS og USA, henholdsvis, ble kjent for å konvergere med pyramidale nevroner av den laterale kjernen i amygdala (LA), og for å gjennomgå plastisitet 19. Vår tidligere arbeid avdekket at sanseinntrykk informasjonen er også parallelt videreformidlet til ITC nevroner <sopp> 16.
Som et første skritt mot en mekanistisk molekylær analyse av individuelle sanseinntrykk synapser på ITC nevroner, brukte vi en adeno-assosiert virus (AAV) for å uttrykke ChR2 merket med gul fluoriserende protein (YFP). AAV ble injisert i PIN-kode / MGN og axon terminalene, ble identifisert ved deres ekspresjon av ChR2-YFP. Vi brukte begge sider genereres av FRIL teknikk for å vurdere tettheten av postsynaptiske AMPA-R og NMDA-R på synapser dannet med ITC nevroner av PIN / MGN axon terminaler.
Freeze-fraktur elektron mikroskopi har vært en stor teknikk i ultra forskning i over 40 år. Men mangelen på effektive midler for å studere den molekylære sammensetning av membraner fremstilt en betydelig nedgang i bruken. Nylig har det vært en stor vekkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopi på grunn av utviklingen av effektive måter for å vise integrerte membranproteiner av en immunmerking 1, 2, nemlig FRIL teknikk.
Den FRIL teknikk besitter flere fordeler fremfor andre immungullultra metoder. Først proteinene er lett tilgjengelig for antistoffer øker følsomheten. For det andre, eksponering av stor del av plasmamembran fordypninger, slik som den postsynaptiske membranen, på den to-dimensjonale overflate av replika tillater inspeksjon av den romlige fordelingen og fysisk contiguity av molekyler av interesse uten arbeidskrevende og tidkrevende rekonstruksjon av serial supertynne seksjoner. For det tredje, tilgjengeligheten av begge halvdeler av plasmamembranen øker antall proteiner som kan merkes for hver enkelt struktur, forutsatt at egnede antistoffer er tilgjengelige. Ved frakturering, er den hydrofobe overflate av splitten membran belagt med karbon-platina som entrenches proteindomener igjen på brukket overflaten. Dette forhindrer adgang av antistoffer mot antigener i disse domenene. For eksempel på P-ansiktet til en kopi kun epitoper som vender mot protoplasmiske plass kan detekteres ved antistoffer, mens på den E-ansikt bare epitoper som vender mot exoplasmic plass kan være bundet av antistoffer (se figur 2).
På den annen side, FRIL teknikk lider også av visse begrensninger 2. Som frakturer oppstår tilfeldig, kan det være vanskelig å målrette bestemte celler eller strukturer. Dette kan også føre til en samplings forspenning, for eksempel i synapse samling, gitt forskjellig sannsynlighet for FRActuring langs membranen av strukturer med forskjellig krumning (f.eks, pigger versus sjakter). Dessuten er fordelingen av membranproteiner til en av de to flater uforutsigbar. Derfor er fordelingen av et protein til P-ansikt eller E-ansikt, særlig for kvantitative analyser, bør være nøye undersøkt ved hjelp av antistoffer som er reaktive mot intracellulære og ekstracellulære domener. Til slutt, identifikasjon i replika av visse strukturer, slik som presynaptiske terminaler axon, kan være vanskelig når kun basert på morfologiske egenskaper. Imidlertid er bruk av spesifikke antistoffer for markørproteiner eller transduksjon av merket integrerte membranproteiner eller kanaler ved hjelp av virale vektorer og tilbyr flere verktøy lette identifisering av de frakturerte membraner. For eksempel denne studien tok fordel av transduksjon av ChR2-YFP i thalamic nevroner å identifisere sine aksonal efferents i amygdala eller merking for μ-opioidreseptorer å avsløre postsynaptiske megmbranes av ITC nevroner.
For å utføre den FRIL teknikken med hell, bør det tas spesielt hensyn angå vev fiksering. Sterk vev fiksering (> 2% paraformaldehyd) kan resultere i en høy grad av tverr frakturer og en reduksjon i følsomhet merking. På den annen side, svake bindinger gjøre vevet håndtering og forberedelse (f.eks skjæring av snitt) vanskelig. Det er også viktig å kontrollere at tykkelsen av den trimmede blokkene samsvarer med tykkelsen av dobbeltsidig tape. Dersom tykkelsen av prøven er lavere enn det sted på båndet, kan overflatene av de vev ikke fester seg til overflaten av de to metallbærere, er følgelig de frosne prøven ikke fraktureres. Når vevet er tykkere, vil den bli sammenpresset med uunngåelige struktur forvrengninger når sandwich av de to kobber bærere er gjort. Den temperatur ved hvilken prøven blir brukket (i denne protokollen, -115 ° C) spiller også en viktig rollepå strukturen av replika. Høyere temperaturer kan gi en høyere grad av gjenstander slik som kondensasjon av vanndamp på overflaten av vevet før eller under fordampning. Lavere temperaturer (<-125 ° C) kan øke risikoen for avspaltning av materiale under frakturering. Dette materialet kan falle på overflaten av prøven, eller være koblet til den. Disse flak av materialet er også belagt og kontras produsere mørke flekker på bildet. Frakturering ved lavere temperaturer kan også påvirke hyppigheten av tverr frakturer særlig for mindre fin struktur som for eksempel dendrittutløperne. Et ytterligere kritisk trinn i fremstillingen av kopier er detergent-fordøyelse. Hvis fordøyelsen er ufullstendig, vises ufordøyd vev som mørke flekker på replika, konfunderende analyse av strukturen i TEM. Dessuten kan ufordøyd vev ikke-spesifikt felle eller binder antistoffer, noe som øker bakgrunnsmerking. På den annen side, bruk av vaskemiddels for vevsfordøyelse kan denaturere molekylene er knyttet til den kopi endre deres sekundære og tertiære strukturer. Derfor, for visse antigener kan det være nødvendig å gradvis fortynne konsentrasjonen av SDS med ekstra vasketrinn.
For immunolabeling, tilgjengeligheten av forskjellige størrelser av gull partikler konjugert til sekundære antistoffer gjør det mulig å detektere på samme tid, men bare kvalitativt, multiple proteiner, til og med i bestemte mikroområder av plasmamembranen, slik som den postsynaptiske fordypning. Men på grunn av sterisk hindring, kvantitative studier er generelt begrenset til deteksjon av bare ett molekyl. Størrelsen på gull partikkelen kan også påvirke den merking effekt.
For tolkningen av merkingen i FRIL, bør det tas i betraktning at en immun partikkel kan være plassert hvor som helst innenfor en halvkule med en radius på 20-25 nm fra antigenet på grunn av den fleksible kompleks formed ved den primære og sekundære antistoff 26. For ytterligere informasjon om teori og praksis av FRIL og relaterte teknikker, henviser vi leseren også til andre metodiske artikler 27, 28.
Den FRIL teknikken har nylig blitt brukt for høyoppløselige kvantitative analyser av glutamat reseptor lokalisering i ulike synapse populasjoner 29, 30. Videre følsomhet av FRIL teknikk for AMPA-R ble anslått så høyt som en immunogold partikkel per en funksjonell AMPA -R kanal 29. Dermed er denne tilnærmingen generelt svært nyttig å kvantifisere og analysere mønster av postsynaptiske uttrykk for AMPA-R og NMDA-R på sentrale synapser. Her viste vi at dette også gjelder på PIN / MGN-ITC synapser, et nettsted mest sannsynlig viktig for videresending US informasjon under frykt condition. Ved hjelp av et antistoff dannet mot høyt konserverte ekstracellulære aminosyrerester av AMPA-reseptor-underenhetene GluA1-GluA4, har vi funnet en jevn fordeling av gullpartiklene i IMP klynger svarende til postsynaptiske membran fordypninger. Tettheten av AMPA-R i ITC pigger var betydelig høyere sammenlignet med aksel synapser målrettet av PIN / MGN thalamic afferente. At både rygg og aksel synapser, ble en positiv korrelasjon mellom merking for AMPA-Rs og postsynaptiske området oppdaget, en funksjon som er felles for andre glutamaterge synapser 25. Den lave variasjon i tetthet av AMPA-R i PIN / MGN-ITC synapser indikerer en homogen fordeling lik andre synapser dannes ved thalamic efferents 7, men forskjellig fra kortikale synapser 25. Motsatt, tettheten av NMDA-R var mer variable og skilte seg ikke mellom rygg og aksel synapser foreslå en annen regulering enn AMPA-R. I fremtiden vil det høy reproduserbarhet av FRIL teknikk ikke bare tillater å bedømme den basale molekylære sammensetningen av sentrale synapser, men kan legge til rette for deteksjon av cHanges i ionotrope glutamatreseptorer tall og subsynaptic fordeling etter frykt læring, supplerer ex-vivo opptak av pre- og postsynaptiske egenskapene til disse inngangene.
Som konklusjon, kan denne tilnærmingen brukes av andre forskere for å få innsikt i struktur-funksjon relasjoner på innsatsspesifikke eksitatoriske synapser i mange andre nevrale kretser hvor løsrive opprinnelsen av inngangene og arten og sammensetningen av postsynaptiske elementene er avgjørende, men problematisk .
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue preparation | |||
Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High-pressure Freezing | |||
Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
Chamois skin | Household supply store | ||
Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Aceton | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Freeze-fracture and Replication | |||
Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 – 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunolabelling | |||
BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAG5 | |
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAR15 | |
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EM analysis | |||
Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |