This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.
동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 immunogold 라벨링함으로써 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경 덕분에 큰 부활되고있다. 이러한 방법 중 하나는 세제 용해 동결 골절 복제 Immunolabeling (FRIL)로 알려져있다.
optogenetics와 FRIL 기술의 조합은 중앙 시냅스의 구조 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 식별 및 태깅 channelrhodopsin 각각 식 특정 분자 표지로 사전 및 시냅스 후 뉴런 모두를 특성화 할 수있다. glutamat의 시냅스 막 전문의 독특한 외관ergic 정량화 이들 수용체의 intrasynaptic 분포를 분석하기 위해, 상기 시냅스 이온 성 글루타메이트 수용체의 라벨링시에 허용한다. 여기서 우리는 페어 복제 방법을 immunolabel하는 방법을 준비하는 데 필요한 절차를 단계별 설명을 제공합니다. 우리는 또한 잠재적 인 샘플링 편견과 관련된 특히 사람들을 FRIL 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. optogenetics와 결합 할 때 FRIL 기술의 높은 재현성과 다양성은 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로의 시냅스 전달의 다양한 측면의 특성에 대한 매우 강력한 접근 방식을 제공합니다.
여기서는 이러한 접근은 마우스 편도의 인터 세포 질량의 뉴런에서 흥분성 시냅스의 구조 – 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 특히,이 확인 입력에서 이온 성 글루타메이트 수용체의 발현을 조사 하였다하거나시상 후방 intralaminar와 중간 geniculate 핵에서 iginated. 이 시냅스는 두려움 학습을위한 관련 감각 정보를 중계하고 공포 조건화에 플라스틱 변화를 겪는 것으로 나타났다.
나노 미터 크기의 생체막의 기능적 구조의 정의는 투과 전자 현미경에 적합한 immunolabeling 기술 다수의 발달로 최근에는 도전되었다. 그러나, 이러한 기술은, 예를 들면 전후의 매립 immunogold을, 항원 및 / 또는 막 결합 단백질의 양적 제한 평가 불량한 검출 포함 중요한 제한들을 갖는다. 이러한 제한은 셀 다양성과 시냅스 이질성 높은 것을 특징으로하는 신경 조직의 미세 구조의 연구에 특히 중요해진다. 사전 및 시냅스 소자 차동 식 농축, 또는 수용체 전송기 및 이펙터 분자로서 시그널링 단백질의 상호 작용에 의해 결정 구조적 및 기능적 다양성이 이질성 결과.
직접 immunolabe에 대한 새로운 접근 방식세제 용해 동결 골절 복제 (FRIL)의 통합 또는 가교 막 단백질의 링은 원래 20 년전 1 후지모토에 의해 소개되었다. 이 원래의 방법이 있었다, 그러나 몇 가지 제한 사항, 즉, 같은 두뇌와 같은 복잡한 조직에서 개별적으로 매핑 된 셀 라벨 분자의 의미있는 상관 관계를 방해 복제의 심각한 분열. 약 10 년 전, Shigemoto와 카자는 점진적으로 기술이 향상되었습니다. 이것은 또한 크게 갭 접합 (3)의 연구, 특히 기술을 향상 콜로라도 주립 대학의 볼더 연구소, 과학자의 또 다른 그룹의 노력이 병행되었다.
동결 파쇄 프로토콜 및 시스템의 개선뿐만 아니라, (고압) 빠른 냉동의 도입은 지금 하이 연구자들은 상대적으로 큰 크기의 시험편의 단절 복제본을 생성 할 수 있도록한계와 강한 화학 고착에 의해 생성 된 유물없이 대부분의 세포 성분의 GH 품질의 이미지.
FRIL 기술은 사전 및 시냅스의 평면도의 또 다른 장점으로, 이러한 뇌 복잡한 조직 내의 하나 이상의 매핑 학적에서 (동시에) 단백질 및 미세 침 흡인 세포 검사 식별 세포 동일계 식별에 고 정량의 큰 장점을 제공한다 하나의 복제 요소. 따라서, FRIL 기술은 많은 기술적 장애에도 불구하고, 특히 각각의 시냅스의 구조적 및 기능적 특성의 관계에 대해 매우 중대한 과학적 돌파구로 사용하는 가능성을 보유하고있다. 지난 몇 년 동안, 많은 정보는 분자 구성, 구조에 획득하고 있으며, 시냅스의 생리 기능; 아직 시냅스는 형태 학적 및 분자 매우 다양한 사전 및 시냅스 파에 따라 있습니다임대 뉴런 4. 시냅스 만 종류의 소수에 대한 구조 – 기능 연구가 지금까지 5-7 수행 하였다. 이는 사전 및 시냅스 요소의 특성에 대한 정확한 식별을 방지 기술적 제약에 대부분이었다.
미세 분석은 시냅스 전달의 강도와 소성에 큰 영향을 미치는 신경 전달 물질 수용체 6 별개의 시냅스 접촉에 걸쳐 모두 시냅스 크기와 내용면에서 시냅스 막 전문의 변동성에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 또한, 많은 연구 기관은 시냅스의 종류 발현 이온 성 글루타메이트 수용체의 수는 afferent- 및 목표 의존적 7-10으로 조절되는 것을 나타낸다.
여기에서, 방법은 정의와 시냅스 막 전문의 구조와 수용체의 조성 분석을 허용하는 개략되어D 시냅스 요소 및 기능. 이 방법은 channelrhodopsin2 (ChR2)와 같은 최근 개발 된 감광성 조류 단백질의 연접 식을 활용하고 FRIL 기술의 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic의 시냅스 발현의 패턴을 분석 산 (AMPA-RS) 및 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA-RS) 글루타메이트 수용체. 이는 편도 (ITC)의 인터 셀 대중의 신경 세포에 후방 시상 – 중간 geniculate 핵 (PIN / MGN)에서 발생하는 축색 돌기에 의해 형성된 시냅스에서 시연된다. ITC 뉴런은 기저 amygdaloid 복합 (BLA) (11), (12)을 둘러싼 클러스터 구성 작은 가시 GABA 성 세포이다. ITC 신경 세포가 BLA 주요 신경 세포에서 흥분성 입력을 수신하고 (CEA)를 중심 핵을 대상으로하는 것으로 알려져있다, 따라서 억제 게이트 역할을 정보에 대한 BLA와 CEA 12 ~ 15 사이에 흐른다.
최근에, 우리는 IT 시연BLA와 CEA의 메디 – 지느러미 클러스터에있는 C 뉴런은 두려움 파블로프 청각 공포 조건화 16시 학습에 수정 감각 시상 및 시간 대뇌 피질의 영역에서 직접 수렴 흥분성 입력을받을 수 있습니다. 공포의 조절은 뇌 메커니즘의 관점에서 연관 학습의 가장 좋은 이해 형태 중 하나입니다. 공포 에어컨, 초기 중립 조건 자극 (CS, 예를 들면, 톤)에서 CS-US 협회 초래하는 혐오 무조건 자극 (US, 예를 들면, 가벼운 발 충격)와 짝과 공포 응답 (17), (18)를 조절한다. 흥분성을 연사 및 미국을 대표하는 정보를 전달 시상 및 신피질 영역 모두에서 입력은 각각 편도 (LA)의 측면 핵의 피라미드 뉴런에 수렴 및 소성 (19)를 받아야하는 것으로 알려져 있었다. 우리의 이전 작품은 감각 입력 정보가 ITC의 신경 세포에 전달 병렬도 밝혀 <s> 16입니다.
각각의 감각 입력의 기계적인 분자 분석을 향한 첫 번째 단계는 ITC의 신경 세포에 시냅스, 우리는 ChR2는 노란색 형광 단백질 (YFP) 태그로 표현하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)을 사용했다. AAV는 PIN / MGN에 주입하고, 축삭 단자는 ChR2 – YFP의 발현에 의해 확인되었다. 우리는 PIN / MGN 엑손 단말기들에 의해 ITC 뉴런 형성 시냅스 시냅스 AMPA-RS와 NMDA-RS의 밀도를 평가하기 FRIL 기술에 의해 생성 된 양면을 사용했다.
동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 인해 immunogold 라벨 (1, 2), 즉 FRIL 기술에 의해 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경의 주요 부활되고있다.
FRIL 기술은 다른 immunogold 미세 방법에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 첫째, 단백질은 감도를 증가 항체에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 둘째, 복제의 2 차원 표면 등 시냅스 막으로서 세포막 전문, 큰 부분의 노출 세리의 힘들고 시간 소모적 재구성없이 관심 분자의 공간적 분포 및 물리적 연속성의 검사를 허용알 얇은 섹션. 셋째, 세포막의 양쪽 절반의 이용은 각각의 구성에 대해 표시 할 수 단백질의 수가 제공 적합한 항체를 사용할 수를 증가시킨다. 파쇄시 분할 멤브레인의 소수성 표면은 골절 표면에 잔류 된 단백질 도메인을 구축하고 그리고 탄소, 백금으로 코팅된다. 이것은 이러한 도메인의 항원에 대한 항체의 접근을 방지 할 수 있습니다. 복제의 P-얼굴 인스턴스의 원형질 공간 대향 만 에피토프 반면 단지 항체에 의해 결합 될 수있는 공간 exoplasmic 대향 에피토프 전자 표면에 항체가 검출 될 수있다 (도 2 참조).
한편, FRIL 기법은 특정 제한이 앓고. 골절이 무작위로 발생, 특정 세포 또는 구조를 대상으로 어려울 수 있습니다. 이것은 또한 FRA의 다른 확률이 주어진, 시냅스 컬렉션, 예를 들어 샘플링 바이어스로 이어질 수 있습니다다른 곡률 (샤프트 대 예를 들어, 등뼈)와 구조의 멤브레인을 따라 cturing. 또한, 상기 두면 중 한 막 단백질의 배치를 예측할 수있다. 따라서, P-E-얼굴이나 얼굴 단백질의 분포는 특별히 정량적 연구에 신중 될 세포와 세포 외 도메인에 대한 반응성 항체를 사용하여 검사한다. 유일한 형태 적 특징에 기초 할 때 마지막으로, 시냅스 축삭 단자로서 특정 구조의 복제본의 식별이 어려울 수있다. 그러나, 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 사용하거나 태그 세포막 단백질 또는 추가 도구 바이러스 벡터를 제공하여 채널의 전달은 골절 막의 식별을 용이하게한다. 예를 들어,이 연구는 시냅스 날 공개 μ-오피오이드 수용체의 편도 또는 라벨에 자신의 축삭의 efferents를 식별하기 위해 시상 신경 세포에 ChR2 – YFP의 전달을 이용했다ITC 뉴런의 mbranes.
성공적 FRIL 기술을 수행하기 위해 특별한주의가 조직 정착 관한주의해야한다. 강 조직을 고정 (> 2 % 파라 포름 알데히드)를 교차 골절 고속 라벨링 감도의 감소를 초래할 수있다. 한편, 약한 고착 티슈 운반 제제 (예 : 부분 절단)을 어렵게 만든다. 이 트리밍 된 블록의 두께는 양면 테이프의 두께와 일치하는지 제어하는 것도 중요하다. 시편의 두께는 테이프보다 낮은 경우, 조직의 표면은 두 개의 금속 담체의 표면에 부착 할 수있는, 따라서 고정 된 시편을 파단되지 않는다. 조직이 두꺼운 경우 두 구리 캐리어 샌드위치이 이루어질 때, 그것은 불가피 구조적 왜곡으로 압축 될 것이다. 시험편이 파단되는 온도 (이 프로토콜에서, -115 ° C)도 중요한 역할을복제의 구조. 높은 온도는 이전 또는 증발 동안 조직의 표면에 수증기 축합 생성물로의 더 높은 레이트를 생성 할 수있다. 낮은 온도 (<-125 ° C) 골절 중 물질의 오프 분할의 위험을 증가시킬 수있다. 이 물질은 시료의 표면에 떨어지거나 연결된 숙박 할 수 있습니다. 재료의이 조각은 코팅 된 이미지에 어두운 반점을 생산 대조된다. 낮은 온도에서 파쇄도 특히 돌기 쪽이 작은 미세 구조물 간 골절의 주파수에 영향을 미칠 수있다. 복제의 제조에서 또 다른 중요한 단계는 세제 소화이다. 소화가 완료되지 않으면, 소화 조직은 TEM의 구조 분석을 교란 복제본에 어두운 패치 나타난다. 또한, 소화 조직 배경 라벨링 증가 비특이적으로 결합하는 항체 또는 트랩을 할 수있다. 세제 한편, 사용조직 소화의 자신의 2 차 및 3 차 구조를 변경 복제에 관련된 분자를 변성 수 있습니다. 따라서, 특정 항원 서서히 추가 세척 단계 SDS 농도를 희석 할 필요가있을 수도있다.
immunolabeling 들어, 이차 항체에 접합 된 금 입자의 크기가 서로 다른 가능성이 동시에 검출 할 수 있지만, 단지 성적, 심지어 시냅스 특성화와 세포막의 특정 마이크로 도메인에 여러 단백질. 그러나, 입체 장해로 정량 연구는 일반적으로 단지 하나의 분자의 검출에 한정된다. 금 입자의 크기는 또한 라벨 효능에 영향을 미칠 수있다.
FRIL에서 라벨의 해석 들어, 인해가요 복잡한 형태로 immunogold 입자는 항원 20-25 nm의 반경을 갖는 반구 내의 어딘가에 위치 할 수 있음을 명심해야한다일차 및 이차 항체 (26)에 의해 에드. 이론과 FRIL 및 관련 기술의 연습에 대한 자세한 내용은, 우리는 다른 방법 론적 기사 (27), (28)에 또한 독자를 참조하십시오.
FRIL 기술은 최근 30. 또한, AMPA-RS에 대한 FRIL 기술의 검출 감도는 하나의 기능 AMPA 하나씩 immunogold 입자 높이로 추정 다양한 시냅스 인구 29에서 글루타메이트 수용체 지역화 고해상도 정량 분석에 사용 된 -R 채널 29. 따라서,이 방법은 정량화 및 중앙 시냅스에서 AMPA-RS 및 NMDA-R과의 시냅스 표현의 패턴을 분석하기 위해 전반적으로 매우 유용합니다. 여기, 우리는 PIN / MGN-ITC 시냅스에서의 적용 가능성, 공포 조건화 동안 미국의 정보를 중계 가능성이 중요한 사이트를 보여 주었다. AMPA 수용체 아 단위의 Glu의 고도로 보존 된 세포 외 아미노산 잔기에 대해 발생하는 항체를 사용하여A1-GluA4, 우리는 시냅스 막 전문 분야에 해당하는 IMP 클러스터 내에서 금 입자의 고른 분포를 발견했다. ITC의 등뼈에서 AMPA-RS의 밀도는 PIN / MGN 시상 구 심성의 대상이 축 시냅스에 비해 유의하게 높았다. 모두 척추와 샤프트 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 표시와 시냅스 영역 사이에 양의 상관 관계는 다른 글루타메이트 성 시냅스 (25)에 공통 기능을 검출 하였다. PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 낮은 분산은 대뇌 피질의 시냅스 (25)에서 시상 efferents (7)에 의해 형성된 다른 시냅스와 유사하지만 서로 다른 균일 한 분포를 나타냅니다. 반대로, NMDA-RS의 밀도보다 변수이고 AMPA-RS는 상이한 규제 건의 척추 축 시냅스 차이가 없었다. 미래에, FRIL 기법의 재현성는 중심 시냅스 기저 고분자 조성물을 평가하는 것을 허용하지 않지만 (C)의 검출을 용이하게 할 수있다공포 학습 후 이온 성 글루타메이트 수용체의 숫자와 subsynaptic 분포 hanges, 이러한 입력의 사전 및 시냅스 속성의 전 생체 내 녹음을 보완.
입력의 기원과 시냅스 후 소자의 특성 및 조성 disentangling 것은 중요하지만, 문제가되는 결론적으로,이 방법은 많은 다른 신경 회로에 입력 특정 흥분성 시냅스의 구조 – 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 연구자들에 의해 사용될 수있는 .
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectants |
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointments |
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue preparation | |||
Paraformaldehyde EM grade | Agar Scientific Ltd., United Kingdom | AGR1018 | |
Saturated picric acid solution | Sigma-Aldrich, USA | P6744-1GA | |
Na2HPO4-2H20 | Merck Millipore, Germany | 1065860500 | |
NaH2PO4-2H2O | Merck Millipore, Germany | 1063451000 | |
NaCl | Merck Millipore, Germany | 1064041000 | |
4N NaOH | Carl Roth, Germany | T198.1 | |
Thiopental | Sandoz, Austria | 5,133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, USA | G5516-500ML | |
GenPure ultrapure water system | Thermo Fisher Scientific, USA | 50131235 | |
Peristaltic pump | ISMATEC, Germany | ISM 930C | |
Filter Paper | MACHEREY-NAGEL, Germany | MN 615 1/4 | |
Vibroslicer, VT1000S | Leica Microsystems, Austria | ||
Ophthalmic scalpel | Alcon Laboratories, USA | can be replaced by other ophthalmic scalpels | |
Perfusion cannula | Vieweg, Germany | F560088-1 | can be replaced by similar items from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High-pressure Freezing | |||
Copper carriers | Engineering Office M. Wohlwend, CH | 528 | |
Sidol Polish | Henkel, Germany | can be replaced by same item from other companies | |
Chamois skin | Household supply store | ||
Hole punch, 1,5mm | Stubai, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Denatured ethanol | Donauchem, Austria | can be replaced by same item from other companies | |
Aceton | Roth, Germany | 9372.5 | CAUTION! |
High Pressure Freezing Machine HPM 010 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | HPM010 | not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100 |
Stereo-microscope | Olympus, Japan | SZX10 | |
Liquid nitrogen | CAUTION! | ||
Cryo-vials | Roth, Germany | E309.1 | can be replaced by same item from other companies |
CryoCane | Nalge Nunc International,USA | 5015-0001 | can be replaced by same item from other companies |
CryoSleeve | Nalge Nunc International,USA | 5016-0001 | can be replaced by same item from other companies |
Liquid nitrogen storage vessel | Cryopal, France | GT38 | can be replaced by same item from other companies |
Non-ionic detergent (Lavocid) | Werner & Mertz Professional, Germany | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Freeze-fracture and Replication | |||
Sandblaster, Mikromat 200-1 | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | SANDURET 2-K | can be replaced by same item from other companies |
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 – 21µ | JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany | 955932 | |
Freeze Fracture System BAF 060 | BalTec, CH; now Leica Microsystems | BAF060 | |
Ceramic 12 well plate | Gröpel, Austria | 14511 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma base | SIGMA, USA | T1503 | can be replaced by same item from other companies |
Trizma hydrochloride | SIGMA, USA | T3253 | can be replaced by same item from other companies |
Sodium chloride | Merck, Germany | 1,064,041,000 | can be replaced by same item from other companies |
SDS, Sodium lauryl sulfate | Roth, Germany | 5136.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Sucrose | Merck, Germany | 1,076,871,000 | can be replaced by same item from other companies |
TRIS | Roth, Germany | 5429.3 | can be replaced by same item from other companies |
Universal Hybridization Oven | Binder, Germany | 7001-0050 | can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunolabelling | |||
BSA | SIGMA, USA | A9647 | can be replaced by same item from other companies |
Anti-GFP Antibody | Molecular Probes, USA | A11122 | |
Anti-pan-AMPAR Antibody | Frontier Institute, Japan | pan AMPAR-GP-Af580-1 | |
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1 | Merck Millipore, Germany | MAB363 | |
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody | ImmunoStar, USA | 24216 | |
EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAG5 | |
EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody | BBInternational, | EM.GAR15 | |
Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody | AURION, Netherlands | DAR 10nm | |
Copper grids, 100 Parallel Bar | Agar scientific, UK | G2012C | |
Incubator | Major Science, USA | MO-RC | can be replaced by same item from other companies |
Pioloform Powder | Agar scientific, UK | R1275 | |
Chloroform | Roth, Germany | 3313.1 | CAUTION! ; can be replaced by same item from other companies |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EM analysis | |||
Philips CM120 TEM | Philips/FEI | ||
Morada CCD camera | Soft Imaging Systems, Germany | ||
iTEM Ver. 5.2, imaging software | Soft Imaging Systems, Germany |