Summary
基因转录的微调调控underlies胚胎细胞命运决定。在此，我们描述了用于研究干细胞和小鼠胚胎的心脏发育的两个心脏分化的表观遗传调控染色质免疫沉淀测定法。
Abstract
具体的基因转录是一个重要的生物学过程，在胚胎发育过程中underlies细胞命运决定。生物过程是通过其结合基因组的调节区，包括增强子和心组成的基因的启动子的转录因子介导的。的DNA是围绕经受化学修饰组蛋白包裹。组蛋白的修饰进一步导致压抑，激活或泰然自若的基因转录，从而使基因转录微调调控的另一个层次。胚胎干细胞（ES细胞）概括胚状体（ 即 ，细胞聚集体）内，或在2D培养心脏发育的早期步骤。它们提供原则上足够的材料为染色质免疫沉淀（ChIP），一个技术广泛用于鉴定基因的调节区。此外，人ES细胞代表心脏发生的人类细胞的模型。在发育的后期阶段，小鼠胚胎组织允许调查测定细胞特性所需的特定后生景观。在此，我们描述然后进行PCR或使用胚胎干细胞，胚状体和心肌特异性胚胎地区的ChIP测序沉淀，顺序芯片的协议。这些协议允许调查心脏基因转录的表观遗传调控。
Introduction
心脏是要形成的第一器官，并成为在胚胎功能。的心脏是从来自第一和第二胚胎心脏字段1出现许多细胞谱系建造。从受精后的囊胚阶段到心脏形，胚胎细胞具有从而使许多细胞命运的决定。基因转录是在时间和空间依赖性管制，是胚胎发育过程中underlies细胞命运决定的关键生物过程。这样的方法是由基因组，包括增强子和心组成的基因的启动子中的绑定调节区特异性转录因子介导的。的DNA是围绕经受修饰例如乙酰化，甲基化，泛素化和/或磷酸化组蛋白包裹。组蛋白修饰导致取决于压抑，活化或蓄势基因转录在其上的组蛋白的赖氨酸残基被修饰2。
jove_content“>染色质免疫沉淀（芯片）已经成立年前3，是目前最广泛使用的技术，以确定任何修饰组蛋白或转录因子4。随着组蛋白或转录因子的免疫目标，结合的DNA可或者通过聚合酶链式反应（PCR）扩增或测序。芯片有技术上克服更具挑战性凝胶阻滞测定法5。然而芯片不意味着直接的转录因子的DNA，凝胶阻滞分析的优点的结合。在另一方面，沉淀结合DNA测序已开通的基因调节的新的全基因组的角度。胚胎干细胞（ES细胞）的胚状体中的概括（ 即 ，细胞聚集），或在二维培养心脏发育6的早期步骤，并在原则上足够的材料芯片提供。此外，人ES细胞分别表示Ca人细胞模型rdiogenesis虽然他们的心源性潜力取决于它们的表观遗传签名7。在开发的后期阶段，小鼠胚胎组织允许调查测定细胞特性所需的特定后生景观。然而，基因组在一个时间和细胞类型特异性方式8转录。基因转录的表观遗传调控具有局部区域内进行研究。在此，我们描述接着用胚胎干细胞，胚状体和心肌特异性胚胎地区PCR或测序沉淀，顺序芯片的协议。这些协议允许调查心脏基因转录的表观遗传调控。
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Protocol
1. DNA-蛋白质交联
- 从ES细胞和胚胎的心脏组织中产生的固定在15ml管中收获-ES细胞（2×10 6个细胞进行常规的ChIP，2×10 5个细胞的微芯片），胚状体（EB）从E9.5小鼠胚胎解剖（房室管，使用在PBS中的1％甲醛细胞或胚胎组织中透PB2缓冲器流出道和心室）。放置在轨道摇床管在室温下以60rpm的速度恰好10分钟。
- 通过加入甘氨酸至125毫的终浓度停止交联反应，并在60 rpm的速度孵育在上轨道摇床室温下5分钟。
2.细胞裂解和染色质碎片
- 洗两次悬浮于10交联的细胞毫升的PBS 1x或胚胎组织重新悬浮于1ml PB2。离心机在1000×g离心在4℃下5分钟。弃去上清液。</ LI>
- 添加蛋白酶抑制剂来缓冲PB1或PB2（2微克/毫升亮肽素，1μg/ ml的抑酶肽，和0.1mM PMSF）中（ 表1）。重悬从步骤2.1细胞沉淀或胚胎组织在1ml缓冲PB1或PB2的分别。吸管上下和重悬的细胞或组织。用1ml注射器用21号针头匀浆的细胞或组织。孵育10分钟4℃（在车轮上）。
- 降速在3000×g离心5分钟，4℃，弃上清。
- 重悬沉淀300μl的在一个干净的试管补充有蛋白酶抑制剂的各自的SB缓冲器（ 表1）的（认证无RNA酶，DNase-，和无热原的），以防止任何DNA降解。孵育在冰上15至30分钟。
- 超声处理的样品在4℃下以剪切使用根据表2中的每个的材料列出的程序超声波仪的染色质。根据下一个应用程序调整超声时间（<EM>即PCR或排序）。剪切DNA大小应为约500 bp的PCR的和300bp的测序。
- 离心机超声处理细胞裂解物10分钟，在6000 xg离心在4℃下，在一个干净的1.5毫升管转移上清液（染色质）弃沉淀。
- 稀释溶液与水的10倍的染色质（上清液缓冲液B），并评估用1.5微升在纳米分光光度计的光密度。获得使用以下公式中微克/微升的蛋白质的浓度：1.55点¯xOD 280 - 0.76点¯xOD 260。
| 缓冲 | 采用 | 组成 | 物料 | |||
| 一个 | 透 | PB1：5毫摩尔PIPES pH值8; 85米米氯化钾; 0.5％NP40 | 所有 | |||
| PB2：15mM的HEPES pH 7.6中，15毫摩尔NaCl，4mM的氯化镁60毫米氯化钾，0.5％Triton X-100 | 胚胎组织 | |||||
| 乙 | 裂解/超声 | SB1：1％SDS中的10mM EDTA;的50mM的Tris-HCl pH为8 | 退出 | |||
| SB2：50mM的HEPES-KOH pH7.9; 140毫米; 1mM的EDTA; 0.1％的脱氧胆; 0.1％SDS中 | 胚 | |||||
| SB3：15毫米的HEPES pH7.6的，15毫米氯化钠; 60毫米氯化钾，1mM的EDTA，0.5毫米EGTA; 1％Triton X-100，0 .1％SDS，0.5％十二烷基肌氨酸 | 胚胎组织 | |||||
| C | 沉淀缓冲 | 150毫摩尔NaCl;的50mM的Tris-HCl pH为7.5; 5mM EDTA的; 0.5％NP40; 1％Triton X-100。 | 所有 | |||
| ð | DNA /蛋白质洗脱 | D1：1％SDS 100毫米碳酸氢钠 D2：50毫摩尔Tris pH值7.6 / 5mM EDTA的，15毫摩尔DTT，2％SDS中 | ||||
| Ë | DNA结合珠的制备 | E：20％PEG 8000; 2.5 M氯化钠;的10mM的Tris-HCl pH值8; 1mM的EDTA | ||||
表1.内部缓冲器 。
| 材料 | 超声方案 |
| 胚胎干细胞 | 30秒，以15次和30秒关闭 |
| 胚体 | 30秒ON的30个循环和30秒关闭 |
| 胚胎组织 | 30秒对21周期和30秒关闭 |
表2.超声程序。
3.免疫沉淀和淘
- 洗3次蛋白A结合珠缓冲液C。取100微升珠在干净的1.5 ml管中，加入1毫升缓冲液C（ 表1）。然后将管转移到一个磁铁;等待1分钟，吸出上清液。重复洗涤步骤两次。
- 孵育20微升洗涤蛋白的缀合珠子和1ml缓冲液C在一个干净的1.5毫升管补充有蛋白酶抑制剂产生抗修饰组蛋白或转录因子（ 表3中列出的浓度）抗体。在4℃下设置在旋转器上的样品在40rpm下为至少2小时。
- 洗抗体珠复合3次用1毫升缓冲液C（3.1操作说明）。
- 准备2管，一个包含150染色质和抗体 - 珠子复合物微克和含有150染色质微克和20μl洗涤珠的其它管;加入1ml缓冲液C补充有蛋白酶抑制剂，以每管并在4℃下以40rpm孵育在旋转轮上的样品过夜。
注：染色质的浓度必须至少为300微克免疫沉淀转录因子或用于顺序沉淀。
| 标准 | 浓度（ng /μL） | 体积（微升） | 总DNA浓度（ng） |
| 一个 | 10.0 | 1 | 10.0 |
| 乙 | 5.00 | 1 | 5.00 |
| C | 2.50 | 1 | 2.50 |
| ð | 1.25 | 1 | 1.25 |
| Ë | 0.625 | 1 | 0.625 |
| F | 0.3125 | 1 | 00.3125 |
| G | 0.156 | 1 | 0.156 |
| H | 0.0 | 1 | 0.0 |
表3.标准的浓度。
4. DNA洗脱，交叉链接和逆转蛋白酶K消化
- 在磁性架设置样品。回收含有未结合的抗体染色质上清。
注：样品可以在该步骤液氮快速冷冻并储存在-80℃。染色质可以与其它抗体其他免疫沉淀实验中使用。用1ml缓冲液C（之前描述的操作）洗涤各样品3次。 - 通过加入150微升缓冲D1或D2的洗脱抗体结合的蛋白质，如果连续的芯片具有要完成（ 表1），以洗涤沉淀材料和在加热块在50℃孵育样品20分钟。
- 取下管加热块，把样品中的磁性架，回收上清液在一个干净的1.5毫升管（认证无RNA酶，DNase-，和无热原的），丢弃该珠子。
- 使用上清液顺序芯片2体积的缓冲液C中加入1到第二抗体的3微克或反向通过加入5M的氯化钠，得到的200mM的终浓度交联。
- 在一个干净的1.5毫升管制备染色质的输入样本（认证无RNA酶，DNase-，和无热原的）拍摄染色质的相同量，在150微升的水最终体积知识产权样品（150微克）的（RNA酶的DNA酶游离水）。添加5M NaCl至200mm的最终浓度。在65℃孵育样品过夜。
- 第二天，从加热块中移除样品中，添加250毫摩尔EDTA，得到12.5毫和蛋白酶K的最终浓度，以获得在芯片材料250微克/ ml的终浓度，并在55℃消化在2小时加热块。
- 珠准备
- 开始，使在室温下将珠粒至少30分钟，涡流珠子非常彻底。珠安定下来，所以当吹打工作速度快。传输1毫升珠干净的1.5 ml管（认证RNA酶，DNase-和无热原的）。
- 坐落于磁铁，等待2 - 3分钟的解决方案，以澄清，弃上清。从磁铁取出，加入1ml 0.5M的EDTA，并通过短暂的震荡混匀。
- 重复步骤5.1.2两次，并在最后丢弃上清液。
- 从磁铁取出，加入1毫升缓冲液E和悬浮慢慢珠。传送整个混合物（在缓冲液E珠）于50ml缓冲大肠杆菌地点振荡器上，并让它在室温下慢慢地搅拌1小时。
- 测试DNA结合珠以下以下，使用3实验条件描述的纯化方案：将50μl珠子/ 50微升的DNA（1体积/ 1体积），100微升的小珠/ DNA的50微升（2体积/ 1体积）和125微升的小珠/ DNA的50微升（2.5体积/ 1体积）。让迁移上的1.5％琼脂糖凝胶纯化的DNA，以检查片段（ 图1A）的大小。
- DNA纯化
- 添加DNA的425微升（2.5倍体积）的磁珠结合每一个DNA样本（约170微升）。通过上下吹打（约10倍）缓慢重悬并在室温下孵育10分钟。
- 上磁体放置5分钟，然后吸出上清液并弃去（在磁铁）。
- 加入600微升新鲜出炉的80％的乙醇在管上的磁铁，等待1分钟，吸上清并丢弃，然后重复前面的步骤一次。
- 举一个快速旋转，5秒（微量），放置在磁铁管取出乙醇的最后一滴。让干在室温下1分钟
- 通过加入20μlDNA酶无RNase水洗脱DNA。从磁铁取出，涡旋样品。
- 孵育在室温下3分钟，然后放置试样上磁铁。抽吸洗脱的DNA进新管中（认证无RNA酶，DNase-，和无热原的）。
- 运行上的1.5％琼脂糖凝胶的输入级分的DNA的检查的DNA片段（ 图1B）的大小。
6. DNA定量用荧光检测仪
- 在水中1微克DNA（1kb梯）串联稀释，得到共7稀释液加无DNA的点（聚集在表3稀释）。
- 制备的PCR Green I的染料的溶液中，足以对所有样品（纯化的DNA和标准稀释AH）：稀释10000在1×TE缓冲液的青染料。
- 加入1μl每个DNA样品（纯化的DNA和标准稀释AH），以10微升1个绿色染料混合毛细血管比色皿，以在488纳米波长的荧光读取。对于无DNA分析，使用1微升1×TE缓冲液中。
- 建立使用校准曲线的图形软件和确定的相对浓度的DNA样品以ng /微升的范围内。该DNA然后准备用于PCR或使测序文库。
7. PCR
- 引物的选择
- 感兴趣的设计引物询问感兴趣的基因组区域。设计引物以扩增用UCSC基因组浏览器的基因的增强子区。增强剂使用H3K4me1或P300芯片起在GEO数据组可用9数据进一步预测。
- PCR
- 在25微升绿色染料混合，2纳克DNA和0.5微升引物混合使用实时PCR热循环45个周期（8秒95℃，8秒60℃，8秒72°C）的PCR反应（20 μM原液）10。
- 富集分析
- 计算绝对富集假设核小体的至多1％的免疫沉淀11。
- 求索- [R为丰富，如果相比于0.1纳克的DNA模板时10毫微克IP样品显示更大的富集的基因组。
- 表达结果作为富集通过非富集的区域正常化到输入和调整用非特异性对照样品后增加倍数。
- 考虑输入DNA为100（稀释倍数或DF）稀释。
- 的Ct [输入量x DF] -使用以下等式2-ΔCt×100％，其中-ΔCt=的Ct [IP]正常化输入。
- 使用下面的等式调整控制（ΔCT[IP]-ΔCt[NS]）其中NS为非特异性样品（无抗体的IP，或IgG的IP）。
- 计算出样品的倍富集为2-ΔΔCT。包括与公式计算的所有步骤，其中只有每个PCR样品可输入将便于结果的分析的文件。
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Representative Results
图1A首先说明了DNA结合珠和使用不同尺寸（1kb梯）的DNA质量控制的准备。 0NE，珠子2和2.5体积（1至3）加入到样品中纯化高和低分子量大小的DNA片段的一个卷。
图1 B，C，D是从分别从小鼠ES细胞，胚状体或心脏胚胎区域（池25 E9.5心室）萃取整个声振的DNA的DNA凝胶的典型例子。
当胚胎干细胞分化首先向心肌细胞的命运，他们过境一mesendodermal，然后中胚层状态。这样的发展旅程包括步骤：由上皮细胞要经历一个epithelio间质转变
图2
分化的基因功能二价染色体域在胚胎干细胞12。他们的5'UTR接近其发起人地区的确是由双方的H3K4me3染色质活化标记和H3K27me3，一个压抑的标志占据。当细胞被形态发生如BMP2 7质疑这些标记将被修改。这些标记是变量但是根据人类胚胎干细胞系Ş可能是因为他们从无差别，甚至当获取原始的胚泡（ 图3）。
以上所述的协议适用于甚至从材料的低量开始沉淀测序的ChIP实验从AVC提取染色质进行，OFT和为了揭露的新基因和增强子打在确定这些特定心肌区域的身份的角色E9.5小鼠胚胎的心室。 图4示出了在心肌基因2基因组区由乙酰化H3K27和一个起搏器特有的丰富了鼠标E9.5心室（ 即 ，不心室）基因不被乙酰化H3K27丰富。
图1. 电泳数据 ：DNA结合珠检查和超声瓦尔idation。 （A）的DNA的DNA结合珠粒纯化，1体积的珠/ 1体积的DNA（1）和2体积的珠/ 1体积的DNA（2）和2.5体积的珠/ 1体积的DNA（3）。小鼠ES细胞（B）的输入部分，胚状体（C）的逆交联后获得的DNA片段的大小，和胚胎心脏组织（D）。该样品在2％琼脂糖电泳凝胶上运行。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 芯片的数据分析。（A）H3K27ac后生标记对E-cadherin的增强子/启动富集 （A -电子区）（B）H3K4me1，H3K36me3和H3K9me2 epige富集。在扭曲增强/启动NETIC标志（AC区域）。基因组区域是通过qPCR扩增来测量组蛋白富集VS以下的ChIP输入。结果是平均值±SEM从3个实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.连续芯片染色质是由4人胚胎干细胞系中提取和芯片使用抗H3K4me3的，然后抗H3K27me3抗体顺序执行的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。
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Discussion
表观遗传学已成为发育生物学研究的一个重要领域。如何遗传程序在胚胎细胞被激活以允许细胞胚胎谱系中获取的特定身份已经长时间为发育生物学家的一个关键问题。
芯片具有在过去几年内被广泛使用，并结合到DNA测序按照测序分辨率的改善。这已成为以在基因组中广泛依赖性进行调查细胞或特定的胚胎和成年组织的后生景观的强大技术。芯片分析缓冲和超声条件得到极大改善，让生物材料的少量试验。这包括通过显微切割或通过表达荧光报告蛋白的FACS分选的细胞得到胚胎心脏的特定区域。事实上，芯片上的异质细胞群13 14可进行导致一些难以解释误导的结果。表观遗传标记签名非常精确的细胞群。该签名赋予它们分化的特定潜力，并决定他们的命运。它用纯化（排序）的细胞群或解剖胚胎组织的工作是重要的。
我们为了实现这些目标，上述可靠的协议描述。我们已用在芯片7，10或芯片测序（ 图4，手稿中制备），这些协议的ChIP-PCR沉淀。之所以坚固性规定上都得到了优化，以确保完整的细胞和核裂解和染色质高效的超声通透性和细胞裂解液。该协议可以因此可用于胚胎组织的量小。
这些协议的局限性所固有的芯片上。更具体地，空间分辨率不是很高与约500 bp的DNA尺寸。怎么样曾经，它允许我们调查二价染色体域的动态在分化的胚胎干细胞7和揭示野生型或基因突变的细胞的EMT基因调控区的组蛋白修饰富集的差异。 （ 图2）。免疫沉淀的DNA（ 图4）的深度测序部分克服了这一限制。
的转录因子的特定基因组区域以下免疫沉淀的富集不指示为肯定的因子直接结合的DNA。它只能是复杂的工厂结合到DNA的一部分。这就是要了解关于一个重要的一点。与此相反，凝胶阻滞分析可以用来解决这一问题。
在其手中深度测序相结合的技术允许监控全基因组由转录因子或特定的组蛋白标记占据的基因组区域。该技术正在改善，并允许询问只SMALL细胞群15。因此，它在胚胎发育过程中打开特定景观后生的动力新的途径。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
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