Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

שימוש עיני ארנב ב פרמקוקינטיקה מחקרים של סמי תוך עיניים

Published: July 23, 2016 doi: 10.3791/53878
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 1,2, 1,2,4, 5, 6, 1,2, 1,2
1Department of Ophthalmology, Seoul National University Bundang Hospital, 2Department of Ophthalmology, College of Medicine, Seoul National University, 3Department of Ophthalmology, Hanyang University Hospital, 4Department of Ophthalmology, Seoul Metropolitan Government-Seoul National University Boramae Medical Center, 5Department of Clinical Pharmacology, Seoul National University Hospital, 6Department of Clinical Pharmacology, Seoul National University Bundang Hospital

Abstract

המסלול התוך עיני של והתרופות מאפשרת אספקה ​​של ריכוזים גבוהים של תרופות טיפוליות, תוך מזעור ספיגה סיסטמית שלהם. ניתן להיעזר בתרופות שונות ניתנות ההחדרה או זגוגי הקדמי, ואת זריקת התוך העינית הייתה יעילה בריפוי מחלות תוך עיניים שונות. עיני ארנב היו בשימוש נרחבת למחקר עיניים, כמו החיה היא קלה לטפל חסכונית יחסית ליונקים אחרים, ואת הגודל של עין ארנב הוא דומה לזו של עין אנושית. באמצעות מחט 30 G, ניתן להזריק תרופות לתוך חללי intracameral ו intravitreal עיני ארנב. העיניים אז הם קפואים עד לניתוח, וניתן לחלק את ההומור המימי, זגוגי, ואת הרשתית / דמה. הדגימות זגוגי רשתית / דמו יכולות להיות הומוגני ו solubilized לפני הניתוח. לאחר מכן, ניתן לבצע immunoassays למדידת ריכוזים של תרופות תוך עיני בכל תא. מודלי pharmacokinetic מתאימים יכולים להיותאנו מבססים את חישוב מספר פרמטרים, כגון זמן מחצית החיים ואת הריכוז המרבי של התרופה. עיני ארנב יכולות להיות מודל טוב מחקר פרמקוקינטיקה של תרופות תוך עיניים.

Introduction

לפני הופעתו של אספקת סמים תוך עיניים, הדאגה העיקרית של טיפול רפואי למחל תוך עיניות הייתה את היעילות שבה התרופה יכולה לחדור לתוך העין. מחסום דם-עינית מונעת מחומרים רבים, כולל תרופות, מן לשדר לתוך העין. לכן, ריכוזים של תרופות שהן מעל רמות טיפוליות לא ניתן להשיג בקלות. שיטת ותרופות התוך העינית, כולל זריקות intracameral ו intravitreal, יכול ישירות לעקוף את המחסום עיני-דם 1-3, כך ריכוזיים טיפולי של תרופות יכולות להיות מושגת בעין 4,5.

בהתאם לכך, משלוח הסמים intravitreal הפך שיטה פופולרית של טיפול למחלות רבות תוך עיניים 5,6. לדוגמה, הזרקת intravitreal מתבצע נרחב עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטינופתיה סוכרתית, חסימות וריד הרשתית, וזיהומים תוך עיני 7-10. בפרט, מאזכניסתה של תרופות אנטי VEGF, תדירות זריקות intravitreal גדל להפליא לטיפול במחלות רשתית. לכן, חשוב להבין את הפרמקוקינטיקה התוך עיני של תרופות כאלה על מנת לאמוד את היעילות והבטיחות של טיפול רפואי.

למרות שהממשל התוך עיני בסמים נחשב פריצת דרך משמעותית בטיפול הרפואי למחלות עיניים, ניטור ריכוז התרופה בתוך גלגל העין הוא תובענית מבחינה טכנית. בגלל עיניים אנושיות מכילות כמויות קטנות בלבד של הומור מימי (כ -200 μl) זגוגי (כ -4.5 מיליליטר, טבלת 1), קשה מבחינה טכנית כדי להשיג כמויות מספיקות של נוזלים עיניים למדוד את ריכוז התרופה. יתר על כן, שיטות המשמשות כדי לקבל את נוזל העין, כגון הקשה זגוגי או ניקור הלשכה הקדמית, עלולה לגרום נזק לרקמות העין ולגרום לסיבוכים רציניים, כגון קטרקט, endophthalmitis, אוהיפרדות רשתית 11,12. בהתאם לכך, במודלים של בעלי החיים משמשים מחקר פרמקוקינטיקה של תרופות תוך עיניים נפוצות 13. בין במודלים של בעלי חיים אלה, ארנבות או קופים הם חיות הנפוצות ביותר בשימוש.

ארנבים, אשר יונקים קטנים של הסדר ארנבאים במשפחה ארנביים, נמצאים בכמה חלקים של העולם. בגלל ארנבונים הם לא אגרסיביים, הם קלים לטפל, השתמשו בניסוי, ולהתבונן. עלות נמוכה יותר, זמינותם של החיה, גודל עין דומה לבני אדם, מאגר גדול של מידע עבור לטובת השוואת ביצוע מחקרית פרמקוקינטיקה באמצעות עיני ארנב. במאמר זה, פרוטוקול מחקרי פרמקוקינטיקה של תרופות תוך עיניים בעיני ארנב מתואר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול שלנו מלווה את ההנחיות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) של החולים Bundang האוניברסיטה הלאומית בסיאול, שאישרה את כל הליכי חיה ושיטות טיפול בבעלי חיים המובאים בפרוטוקול זה. IACUC הוא תוך ציות מלא את המהדורה השמינית של מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (2011). כל הנהלים בוצעו עם דבקות הנחיות האיגוד לחקר משפט חזון עיניים לשימושם של בעלי חיים עיניים ומחקר חזון בחיות. כלובי פרט שמשו לדיור הארנבים. נוסף ניתוח או הכנה לפני ביצוע הניסוי הזה (כלומר, עיקור) לא ייתכן שיידרש.

1. הזרקת תוך עינית של הסמים לתוך עיני ארנב

  1. להרדים ארנבות ניו זילנד לבנה בריאה במשקל 1.5-2 ק"ג עם זריקה תוך שרירית של תערובת של hydrochloride ו zolazepam tiletamineהידרוכלוריד (15 מ"ג / ק"ג) ו hydrochloride xylazine (5 מ"ג / ק"ג). ודא הרדמה על ידי ניטור palpebral (מצמוץ) רפלקס או על ידי צביטה באוזן.
    הערה: אם תרופת תוך עינית נקשרה פיגמנטים עיני, מידת המחייב בכוחה להניע שינוי של הפרמקוקינטיקה העינית של התרופה. לדוגמה, זמן מחצית החיים של תרופה מחייב הפיגמנט ליחות זגוגי מימית של ארנבים פיגמנט ניתן להעלות בהשוואה לזה ארנבים לבנים 14. במקרה זה, הנתונים המתקבלים עיני ארנב פיגמנט עשויים להיות דומים יותר וישימים אל עיניים אנושיות כמו שיש עיניים אנושיות מידה שונה של עיני פיגמנטציה ארנב לבקן לא יכול לייצג עמיתיהם אדם. לפיכך, בהתחשב בין תרופתי-פיגמנט, שימוש ארנבים פיגמנט או לבקנים יש לשקול בזהירות את התוצאות יש לפרש יחד עם הזן (פיגמנטציה) שפן. עם זאת, ארנבים לבנים מומלצים לשימוש מחקרים שהשוו בין מאפייני pharmacokinetic כמו דאינטראקציה שטיח-פיגמנט עשויה להיות גורם בלבול בהשוואה.
    1. החל הרדמה מקומית עם 1% hydrochloride proparacaine טיפות עיניים עיניים. השתמש במשחת וטרינר (2% methylcellulose Hydroxypropyl) כדי למנוע יובש בעיניים עד התאוששות מן ההרדמה.
      הערה: אין להשאיר את הארנב ללא השגחה בעת מורדמת.
  2. להרחיב את התלמיד עם טיפות אחד או שניים של hydrochloride phenylephrine ו tropicamide.
  3. להכנה כירורגית לפני זריקת התוך העינית, להחיל 5-10% povidone יוד לעור periocular עם מקלון צמר גפן 5. מניחים טיפה אחת של 5-10% povidone יוד על הלחמית של העין.
  4. נהל את התרופות התוך עיני או intravitreally או intracamerally שימוש בטכניקות aseptic 5.
    הערה: התרופה נספגה במחזור מערכתי עלולה גם לחדור לעין הבחור. כאשר התרופה ניתנת לשני בעיניים, ריכוז התרופה בעין אחת עשוי להיות מושפע התרופה מוזרקתבעין השנייה. אם הוא אשר כי ההשפעה של הזריקה הנגדית יכולה להיות מוזנחת כמו התרופה במחזור מערכתי לא יכול לחדור את העין השנייה, השימוש בשני עיני זריקות תוך עיניות יכול להיחשב, כפי שהוא חסכוני ממזער את מספר בעלי החיים להקריב המחקרים pharmacokinetic. לצורך המחקר pharmacokinetic על ריכוז מערכתי לאחר הזרקת תוך עינית, השימוש רק עין אחת הוא מתאים.
    1. עבור זריקות intravitreal, להזריק את התרופה intravitreally 1 מ"מ מאחורי לימבוס כירורגית ברבע superotemporal באמצעות מחט G 30 ואו מסחריים 1 מיליליטר מזרקים, מזרקי אינסולין, או מזרקי זכוכית בניצב למשטח scleral 5.
      הערה: היקף התרופה המשמש להזרקת intracameral ו intravitreal משתנה בהתאם התרופות תחת חקירה. בניסויי pharmacokinetic על תרופות אנטי VEGF באמצעות עיני ארנב, מחקרים קודמים השתמשו 0.025, 0.05 (הנפוצים ביותר), או 0.1 מ 'l של bevacizumab או ranibizumab עבור הזרקת intracameral או intravitreal. במחקרים קודמים שלנו על הפרמקוקינטיקה התוך עיני של פקטור הגדילה של אנדותל אנטי-וסקולרית, 0.05 מ"ל של bevacizumab 15, 0.025 מ"ל של ranibizumab, או 0.03 מ"ל של מלכודת VEGF 16 היו בשימוש. ההיקף הבטוח הגדול ללא ניקור הוא האמין להיות 0.1 מיליליטר, אם כי יש כבר ראיות קטנות כדי לתמוך 17 זה. אם נפח מוגזם מוזרק או intracamerally או intravitreally, לחץ תוך עיני הוא גדל מאוד. בנוסף לנזק לעצב הראייה שנגרם במישרין על ידי לחץ תוך עיני מוגבר (IIOP), כלומר נזק לעצב הראייה גלאוקומה, ובמקרים קיצוניים IIOP מוביל זלוף עינית פגומים חסימה בעורק הרשתית המרכזי, שהוא מקביל ללטף במוח.
    2. עבור זריקות intracameral, להזריק את התרופה לתוך החדר הקדמי על ידי החדרת מחט G 30 דרך לימבוס corneoscleral עם שיפוע עד וקידומה parallel למישור איריס כדי למזער את הסיכון של טראומה הקשתית או העדשה.
      הערה: בהתאם גיבוש הסמים, ומחטים גדולות מ -30 G יכול לשמש. התנאים המחייבים מחט מד גדול כוללים תרופות microspheres המכיל, תרופות גדולה של חלבון מרוכז, ניסוחים צמיגים גבוהים.
    3. לאחר הזרקה, לדחוס את הזריקה עם מוליך כותנת טיפ סטרילי כדי לקדם ריפוי פצע.
      הערה: בדרך כלל, 30 שניות הן מספיק לריפוי פצעים, כאשר מחט 30 G משמש להזרקה תוך עינית. עם זאת, אם מחט מד גדול משמש להזרקה תוך עינית, זמן רב יותר מן ראוי פצע איטום למזעור הזליגה מפצע sclerotomy. כדי לבדוק אם קיים דליפת פצע sclerotomy חשוב לוודא כי כמות התרופה תוך עיניים להשתמש מייד לאחר הזרקת התוך העינית היא זהה לכמות המוזרקת, במיוחד אם מחט מד גדול משמש.
  5. שים הארנבים המטופלים מדי יום עבורשבוע, ופעם בשבוע לאחר מכן, עבור כל סימן של דלקת תוך עינית חמורה (הזרקה לחמית ו hypopyon) עד המתת חסד.
    הערה: משככי כאבים לאחר ההזרקה אינם נדרשים כמו הזרקת תוך עינית באמצעות מחט 30 G היא הליך זעיר-פולשני שאינו מלווה בכאב לאחר ניתוח. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי החיים האחרים עד התאושש לחלוטין.

לדוגמא כנה 2.

  1. עבור enucleation, להרדים את ארנבות בנקודות זמן שונות (למשל., 1 hr או 1, 2, 5, 9, 14, או 30 ימים) לאחר הזרקת סמים תוך עיני.
    הערה: נקודות זמן אלה תלויות תרופת הריבית לבין פרופילי pharmacokinetic הידועים. עבור כל נקודת זמן, השתמש לפחות שני גלגלים 13. לקבלת איכות נתונים אמינה, דגימת זמן צריכה להיות שנבחרה בקפידה, לפחות ארבע נקודות זמן עם דגימה מאוזנת לפחות תוחלת זמן של שני זמן מחצית חיים של התרופה 13 18, בפרט, יותר מ 1 זמן נקודות במהלך 24 השעות הראשונות הן קריטיות. לפיכך, עבור מקרומולקולות (> 1,000 Da) 18, תקופת דגימה כגון 1 שעה ו 1, 2, 5, 9, 14, ו -30 ימים 19 יכולה להיות אפשרות טובה. עבור מולקולות קטנות (≤1,000 Da), 1, 2, 4, ו -8 שעות ו 1, 3, ו -7 ימים יכול להיות אופציה אחת 20. בהתאם למשקל המולקולרי, תקופת הדגימה ניתן לשנות עוד יותר.
    1. המתת חסד, לנהל 10 מ"ל של 15% KCl תוך ורידי במהירות לאחר הרדמה ארנבות עם זריקה תוך שרירית של תערובת של hydrochloride tiletamine, hydrochloride zolazepam (15 מ"ג / ק"ג), ו hydrochloride xylazine (5 מ"ג / ק"ג).
  2. פתח את הסדק palpebral עם מפשק עפעפיים. הפוך 360 מעלות חתך בלחמית 2-3 מ"מ האחורי לימבוס ולהרחיב אותו בדיעבד באמצעות פירוק גonjunctiva הקפסולה של שֶׁגֶם מן העולם.
  3. חותך את שרירי extraocular קרובים הכניסה שלהם לתוך העולם. הצמד את עצב הראייה עם מלקחיים מעוקלים ולאחר מכן לחתוך את העצב בין מלקחי הגלובוס. הסר את גלגל העין עצמו תוך השארת הרקמות הסובבות ללא פגע. לאחר enucleation, מיד להקפיא את העיניים ולאחסן אותם ב -80 ° C.
    הערה: ייתכנו שתי אפשרויות להקפאה מיידית. אם ריכוז התרופה נמדד לפי שלב מאוד מוקדם (כלומר. פחות מ 1 שעה), חנקן נוזלי עשוי להיות מתאים יותר כדי להבטיח הקפאה בזמן טוב יותר על פני שטח העין. עם זאת, עבור בתקופות עוקבות, קרח יכול לשמש כדי לקרר את גלגל העין באופן מיידי, ולאחר מכן הקפאה עמוקה ניתן להשתמש כדי לאחסן את העיניים ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר קבל את העיניים לכל מועדים לפי השעון, להפריד את העיניים קפואות לשלושה מדורים, הזגוגית, ההומור המימי, לבין הרשתית / דמה. פרד תאים אלה לפני defrosטינג.
    הערה: הנקודה החשובה ביותר להפרדה לשלושה מדורים היא המהירות של ההליך. גלגל העין יש להפריד מהר מאוד לפני הפשרה ואת ההליך יכול להתבצע על הקרח כדי לעכב הפשרה.
    1. כדי לפתוח את הגלובוס, עושה חתך בבית לימבוס הקרני (300 ° או יותר) עם להב סכין מנתחים. השג את התא הקפוא מול הקשתית, ההומור המימי.
    2. הסר את איריס עדשה הקפואות מושך נוזף באמצעות מלקחי רקמות. כאשר הזגוגית הופכת לנגישה, להשיג הזגוגית הקפואה ומפריד בינה לבין הרקמות שנותרו (רשתית / דמה / בלובן העין).
    3. באמצעות סכין אזמל מס '15, להפריד את רקמת הרשתית / דמתה מן בלובן העין הבסיסית.
  5. לקבלת immunoassays, להפשיר דגימות ההומור המימיות, ולמדוד את עוצמת הקול של כל דגימה. מדדו את המשקל של דגימות קפואות על ידי הפחתת משקל של צינור ריק מזו של t המכיל צינורהוא קפוא מדגם.
    הערה: בגלל המשקל הסגולי של דגימות קפואות הוא כ 1, המשקל של כל דגימה שניתן להשתמש בהם כדי לחשב את היקף המדגם.
  6. לשקול את הדגימות זגוגי, להפשיר את הדגימות, solubilize אותם 1.0 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט שנאגר המכיל אלבומין 1% שור על כתף הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. ואז, צנטריפוגה דגימות ב 387 XG במשך 10 דקות 21.
  7. לשקול את הדגימות קפואות רשתית / דמו עבור המגון. הוסף מגיב מיצוי חלבון עם יחס של רקמות מגיבות של 1:10 (1 גרם של רקמות / 10 מיליליטר של ריאגנט). Homogenize רקם באמצעות microhomogenizer מראש צוננת. צנטריפוגה מדגם lysed במשך 10 דקות ב 12,000-20,000 XG ולהעביר את supernatant לצינור EPP צונן.

3. Immunoassay

הערה: מתודולוגיות אנליטיות כמה יכולות לשמש למדידת ריכוז חלבון. בחר שיטת כמותית מתאימה, דepending על טווח הגילוי. בקצרה, במצב ניטור יון הנבחר HPLC יכול לזהות רמות picogram של מולקולה, ואילו LC-MS / MS יכול לזהות רמות ננוגרם ו picogram של חלבון לאפיון עם מצב MRM / PRM, בהתאמה. את גבול הגילוי של ELISA נחשב ברמת picogram.

  1. עבור מבחני immunosorbent אנזים צמוד העקיפים (ELISAs) כדי למדוד ריכוזים של חומרים נוגדים-VEGF, לשימוש ערכות ELISA ב 96-גם צלחות כדי לאתר את התרופה של עניין וליצור עקומת תקן של ריכוזי תרופה ידועים.
    1. לדלל את הזגוגית, ההומור המימי, ואת דגימות רשתית / דמו עם אלבומין 0.1% שור מלוח פוספט שנאגר 1x (PBS) לריכוזים הנמצאים בטווח ליניארי, ולהשתמש אלה עבור assay.
  2. מחלקים את הדגימות לתוך aliquots על הצלחת ב 100 μl / היטב. דגירת הלילה ב 4 ° C ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים באמצעות 200 μl של פתרון הכביסה של 0.05% Tween20 ב 1x PBS.
    הערה: ההווה אנטי VEGF במעשים המדגמים כמו הנוגדן הראשוני עבור ELISA; ולכן, שימוש נוסף נוגדן ראשוני אינו הכרחי.
  3. לדלל את הנוגדן המשני 1: 20,000 ב 0.1% BSA ב PBS 1x, ולהוסיף 100 μl של הפתרון-המדולל היטב. לאחר דוגרי הצלחת עם נוגדנים משני בדילול הלילה ב 4 ° C, למדוד את הצפיפות האופטית באורך גל 450 ננומטר. פחת אפס הצפיפות אופטית התקן הממוצעת מן הממוצע של קריאות כפולות עבור כל תקן מדגם.
  4. צור עקומת סטנדרט על פי איתות אור היחסים מפתרונות של התרופה עם ריכוזים ידועים על ידי הקטנת הנתונים באמצעות תוכנת מחשב מסוגלת לייצר לוגיסטי ארבעה פרמטר (4-PL) עקום בכושר, כגון SoftMax פרו. ליצירת עקומת סטנדרט, את עקומת 4-PL ניתן להשיג על ידי לחיצה על [4-פרמטר] ב [Curve הרגיל] - [Fit].
  5. חשב את ריכוז התרופה ב fr דגימותאום עקום הסטנדרט.
    הערה: המגבלות של גילוי (לוד) של תרופות אנטי VEGF נחקרו בניסוי שלנו. לוד של bevacizumab היה 0.024-3.125 ng / ml וכי של אפליברספט היה 0.039-10 ng / ml.

4. שיטות ניתוח פרמקוקינטיקה

הערה: לקבלת ניתוח PK, אפשר להשתמש גם compartmental או שאינם compartmental ניתוח. בניתוח compartmental, התנהגות דיספוזיציה המולקולות יכולה להיות מוסברת על ידי משוואה (מודל). לפיכך, ניתוח PK compartmental יכול לחזות את הריכוז בכל t זמן ואילו המודל הלא compartmental לא יכול לדמיין או לחזות פרופילי ריכוז הזמן משטרי מינון אחרים. עם זאת, ראוי דגמי compartmental יכול להיות תהליך מורכב וארוך. לעומת זאת, ההנחות הן מגבילות פחות במודל הלא compartmental. השיטה הלא compartmental היא פשוט נפוץ לחשב פרמטרי pharmacokinetic כגון זמן מחצית חיים, סיקול, ונפח של הפצה.בחרנו מודלים compartmental ללימודי pharmacokinetic על תרופות אנטי VEGF.

  1. לנתח את הנתונים ריכוז התרופה עם מודלים compartmental באמצעות תוכנת מודלים כגון תוכנות WinNonlin הפניקס.
    1. לחץ [דגם PK] ב [WNL5 קלאסי דוגמנות] ולמפות את זמן התצפית, המינון מנוהל, ואת ריכוז התרופה בתפריט [Setup].
    2. בחר את דגם compartmental (למשל, מספר התאים) בכרטיסייה [בחירת מודל], ולחץ על הכפתור [ביצוע] לחשב פרמטרי מודל.
  2. לאחר הניתוחים, בחר את דגם התא הסופי המתארת ​​בצורה הטובה ביותר את נתוני ריכוז תרופה על פי הקריטריונים הבאים: (. למשל, סטיית התקן) (1) Akaike מידע קריטריון, (2) דיוק של אומדני פרמטרים, ו (3) ניתוח גרפי (למשל., בטוב מגרשים בכושר).
  3. חישוב פרמטרים pharmacokinetic של עניין, כגון זמן מחצית החיים (T 1/2) ואזור מתחת לזמן-Concentraעקומת tion (AUC), מן הפרמטרים במודל ומשוואות מונעים על ידי מודל compartmental.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההליך המשמש לנהל זריקות intravitreal של תרופה של עניין עיני ארנב עם טכניקות סטרילי מוצג באיור 1. העיניים שטופלו הן enucleated בשעה מתוזמנת ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. לניתוח, שלושה התאים, ההומור המימי, הזגוגית, לבין הרשתית / דמה, מופרדים מעיני הארנב קפואות, כפי שמודגם באיור 2. דוגמאות של התאים ערוכים ELISA. לאחר הדגרה עם נוגדן משני, צפיפות אופטית נמדדת צלחת 96-היטב, אשר מכילה ריכוזים ידועים של תרופת העניין של העקומה ודגימות התקנית מן לשלושה התאים שנאספו בנקודות זמן מרובות לאחר הזרקת intravitreal (איור 3). נתוני הריכוז מחושב מעקום הסטנדרטי (איור 1 משלים) ניתן להתקין על pharmacokineמודל טיק, ופרמטרי pharmacokinetic ניתן לקבוע מקו המצויד (איור 4). ב 4 איור, פרמקוקינטיקה של intravitreally מוזרק bevacizumab ב vitrectomized ועיניים שאינן vitrectomized הוערכו והשוו. ניתוח PK Compartmental בוצע, אשר סיפקה את המשוואה הבאה כדי להסביר התנהגות PK.

C (t) = C 1 exp (- k 1 t) + 'C 2 exp (- k 2 t)

C (מיקרוגרם / מ"ל): ריכוז בכל עת t (שעה)

C 1, C 2: מיירט-אקסטרפולציה האחורי של שלב ההפצה וביטול

k 1, k 2: קבועי קצב החלוקת דואר והפאזה חיסול

כפי שניתן לראות בתרשים 4, הריכוז נאמד לפי המודל המצויד מתאים היטב לערכים שנמדדו בפועל. לא היו הבדלים משמעותיים בריכוז זגוגית של פרמטרי bevacizumab ו pharmacokinetic כגון זמן מחצית חיים בין עם ובלי vitrectomy. ניסוי זה מצביע על כך את התפקיד של הזגוגית בחלוקה ופינוי bevacizumab הוא חסר משמעות.

איור 1
איור 1:. נוהל ביצוע intravitreal זריקות של סמי תוך עיניים בעין הארנב בהרדמת טכניקות אספטי נמצא בשימוש על ידי החלת טיפות povidone יוד 5% ועל ידי הכנת עור, ואת זריקת intravitreal של התרופה של ריבית מבוצעות באמצעות מזרק מצויד שְׁנִינוּתחה 30 G מחט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. הפרדה של גלגל עין הארנב הקפוא לתאי שלושה בעקבות חתך scleral עם להב כירורגים והסרה של איריס, את הומור זגוגי מימית ניתן להפריד. בהמשך לכך, הרשתית / דמו ניתן להפריד בזהירות מן בלובן העין, המהווה את השכבה החיצונית הלבנה של גלגל העין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: Enzyme-linked חיסוניתAssay sorbent (ELISA) של התרופה תוך-עיניות בדגימות ייצוג התאים שלושה. נתון זה מראה צלחת 96-היטב, אשר משמש עבור immunoassay. לאחר הדגרה עם נוגדן משני, שינוי צבע יצוין במי הקידוחים. הצפיפות האופטית של הצבע תלוי בריכוז של התרופה של עניין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. התאמת הנתונים שנצפו על דגם פרמקוקינטיקה בניסוי זה השוואת הפרמקוקינטיקה של bevacizumab בעיניים vitrectomized והלא vitrectomized, ריכוז intravitreal בפועל של bevacizumab מוצג כנקודות. העקומות המצוידות עבור נתוני הריכוז כי הם מונעים על ידי pharmacokineticמודל, אשר מיוצגים על ידי שתי שורות, נמשך והשתמש לחישוב פרמטרי pharmacokinetic, כגון זמן מחצית החיים של התרופה. ברי שגיאה מצביעים 95 מרווחי% אמון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1 משלים:. תקן Curve של ELISA לצורך האיתור של Bevacizumab זה מתקבל באמצעות התוכנה מסוגלת לייצר התאמת עקומה לוגיסטית ארבעה פרמטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

מִין זְגוּגִי הומור מימי מתייחסence
עכבר 5.3 μl 4.4 μl 22
עכברוש 50-55 μl 13.6 μl 22, 24
אַרנֶבֶת 1.15-1.7 מ"ל 350 μl 23, 27, 28
קוֹף 3.0-4.0 מ"ל 102 μl 23, 26, 28
בן אנוש 3.0-5.0 מ"ל 144 - 247 μl 23, 20, 21, 28

טבלה 1: זגוגי ונפח מימית הומור מינים שונים 17,22-30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zoletil Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride  Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine) Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165 R&D systems 293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer SIGMA C3041-50CAP
Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si Thermo SCIENTIFIC 167008 96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) BOVOGEN BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml gibco 10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) abcam ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent SIGMA C3228-50ML lysis buffer
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #15
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #10
Feather surgical blade stainless steel FEATHER 11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml Thermo SCIENTIFIC 34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml Thermo SCIENTIFIC 34062
Softmax Pro Molecular Devices v.5.4.1 software for generating standard curve
SAAM II  Saam Institute, Seattle, WA software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin Pharsight, Cary, NC v. 6.3 software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab) Genentech

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urtti, A. Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 58, 1131-1135 (2006).
  2. Geroski, D. H., Edelhauser, H. F. Drug delivery for posterior segment eye disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 961-964 (2000).
  3. Ghate, D., Edelhauser, H. F. Ocular drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 3, 275-287 (2006).
  4. Del Amo, M. E., Urtti, A. Current and future ophthalmic drug delivery systems. A shift to the posterior segment. Drug Discov Today. 13, 135-143 (2008).
  5. Avery, R. L., et al. Intravitreal injection technique and monitoring: updated guidelines of an expert panel. Retina. 34, Suppl 12. S1-S18 (2014).
  6. Kim, Y. C., Chiang, B., Wu, X., Prausnitz, M. R. Ocular delivery of macromolecules. J Control Release. 190, 172-181 (2014).
  7. Group, C. R., et al. Ranibizumab and bevacizumab for neovascular age-related macular degeneration. N Engl J Med. 364, 1897-1908 (2011).
  8. Campochiaro, P. A., et al. Sustained benefits from ranibizumab for macular edema following central retinal vein occlusion: twelve-month outcomes of a phase III study. Ophthalmology. 118, 2041-2049 (2011).
  9. Brown, D. M., et al. Ranibizumab for macular edema following central retinal vein occlusion: six-month primary end point results of a phase III study. Ophthalmology. 117, 1124-1133 (2010).
  10. Diabetic Retinopathy Clinical Research Network. Aflibercept, bevacizumab, or ranibizumab for diabetic macular edema. N Engl J Med. 372, 1193-1203 (2015).
  11. McCannel, C. A. Meta-analysis of endophthalmitis after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor agents: causative organisms and possible prevention strategies. Retina. 31, 654-661 (2011).
  12. Meyer, C. H., et al. Incidence of rhegmatogenous retinal detachments after intravitreal antivascular endothelial factor injections. Acta Ophthalmol. 89, 70-75 (2011).
  13. Del Amo, E. M., Urtti, A. Rabbit as an animal model for intravitreal pharmacokinetics: Clinical predictability and quality of the published data. Exp Eye Res. 137, 111-124 (2015).
  14. Hughes, P. M., Krishnamoorthy, R., Mitra, A. K. Vitreous disposition of two acycloguanosine antivirals in the albino and pigmented rabbit models: a novel ocular microdialysis technique. J Ocul Pharmacol Ther. 12, 209-224 (1996).
  15. Ahn, J., et al. Pharmacokinetics of Intravitreally Injected Bevacizumab in Vitrectomized Eyes. J Ocul Pharmacol Ther. , (2013).
  16. Park, S. J., et al. Intraocular pharmacokinetics of intravitreal vascular endothelial growth factor-Trap in a rabbit model. Eye (Lond). 29, 561-568 (2015).
  17. Jager, R. D., Aiello, L. P., Patel, S. C., Cunningham, E. T. Risks of intravitreous injection: a comprehensive review. Retina. 24, 676-698 (2004).
  18. Durairaj, C., Shah, J. C., Senapati, S., Kompella, U. B. Prediction of vitreal half-life based on drug physicochemical properties: quantitative structure-pharmacokinetic relationships (QSPKR). Pharm Res. 26, 1236-1260 (2009).
  19. Ahn, S. J., et al. Intraocular pharmacokinetics of ranibizumab in vitrectomized versus nonvitrectomized eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 567-573 (2014).
  20. Mochizuki, K., et al. Intraocular kinetics of ceftazidime (Modacin). Ophthalmic Res. 24, 150-154 (1992).
  21. Bakri, S. J., et al. Pharmacokinetics of intravitreal ranibizumab (Lucentis). Ophthalmology. 114, 2179-2182 (2007).
  22. Kondo, T., Miura, M., Imamichi, M. Measurement method of the anterior chamber volume by image analysis. Br J Ophthalmol. 70, 668-672 (1986).
  23. Toris, C. B., Yablonski, M. E., Wang, Y. L., Camras, C. B. Aqueous humor dynamics in the aging human eye. Am J Ophthalmol. 127, 407-412 (1999).
  24. Remtulla, S., Hallett, P. E. A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat. Vision Res. 25, 21-31 (1985).
  25. Barza, M. Animal models in evaluation of chemotherapy of ocular infections. Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy. Zak, O., Sande, M. A. , Harcourt Brace Jovanovich. 187-211 (1986).
  26. Hughes, A. A schematic eye for the rat. Vision Res. 19, 569-588 (1979).
  27. Maurice, D. M., Mishima, S. Ocular pharmacokinetics. 69, Springer Verlag. (1984).
  28. Greenbaum, S., Lee, P. Y., Howard-Williams, J., Podos, S. M. The optically determined corneal and anterior chamber volumes of the cynomolgus monkey. Curr Eye Res. 4, 187-190 (1985).
  29. Ruby, A. J., Williams, G. A., Blumenkranz, M. S. Vitreous humor. Foundations of Clinical Ophthalmology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
  30. Jaffe, G. J., Ashton, P., Andrew, P. Intraocular Drug Delivery. , Taylor & Francis. (2006).
  31. Iyer, M. N., et al. Clearance of intravitreal moxifloxacin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 317-319 (2006).
  32. Fauser, S., et al. Pharmacokinetics and safety of intravitreally delivered etanercept. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 242, 582-586 (2004).
  33. Scholes, G. N., O'Brien, W. J., Abrams, G. W., Kubicek, M. F. Clearance of triamcinolone from vitreous. Arch Ophthalmol. 103, 1567-1569 (1985).
  34. Stastna, M., Behrens, A., McDonnell, P. J., Van Eyk, J. E. Analysis of protein composition of rabbit aqueous humor following two different cataract surgery incision procedures using 2-DE and LC-MS/MS. Proteome Sci. 9, 8 (2011).
  35. Sinapis, C. I., et al. Pharmacokinetics of intravitreal bevacizumab (Avastin(R)) in rabbits. Clin Ophthalmol. 5, 697-704 (2011).
  36. Gaudreault, J., Fei, D., Rusit, J., Suboc, P., Shiu, V. Preclinical pharmacokinetics of Ranibizumab (rhuFabV2) after a single intravitreal administration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 726-733 (2005).
  37. Maurice, D. Review: practical issues in intravitreal drug delivery. J Ocul Pharmacol Ther. 17, 393-401 (2001).
  38. Laude, A., et al. Intravitreal therapy for neovascular age-related macular degeneration and inter-individual variations in vitreous pharmacokinetics. Prog Retin Eye Res. 29, 466-475 (2010).
  39. Christoforidis, J. B., Carlton, M. M., Knopp, M. V., Hinkle, G. H. PET/CT imaging of I-124-radiolabeled bevacizumab and ranibizumab after intravitreal injection in a rabbit model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 5899-5903 (2011).
  40. Sangwan, V. S., Pearson, P. A., Paul, H., Comstock, T. L. Use of the Fluocinolone Acetonide Intravitreal Implant for the Treatment of Noninfectious Posterior Uveitis: 3-Year Results of a Randomized Clinical Trial in a Predominantly Asian Population. Ophthalmol Ther. 4, 1-19 (2015).
  41. Bajwa, A., Aziz, K., Foster, C. S. Safety and efficacy of fluocinolone acetonide intravitreal implant (0.59 mg) in birdshot retinochoroidopathy. Retina. 34, 2259-2268 (2014).
  42. Sanford, M. Fluocinolone acetonide intravitreal implant (Iluvien(R)): in diabetic macular oedema. Drugs. 73, 187-193 (2013).
  43. Haller, J. A., et al. Dexamethasone intravitreal implant in patients with macular edema related to branch or central retinal vein occlusion twelve-month study results. Ophthalmology. 118, 2453-2460 (2011).
  44. Boyer, D. S., et al. Three-year, randomized, sham-controlled trial of dexamethasone intravitreal implant in patients with diabetic macular edema. Ophthalmology. 121, 1904-1914 (2014).
  45. Patel, S. R., et al. Targeted administration into the suprachoroidal space using a microneedle for drug delivery to the posterior segment of the eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4433-4441 (2012).
  46. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3, 1377-1397 (2011).

Tags

רפואה גיליון 113 סמים עין תוך עיני intravitreal פרמקוקינטיקה שפן
שימוש עיני ארנב ב פרמקוקינטיקה מחקרים של סמי תוך עיניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahn, S. J., Hong, H. K., Na, Y. M.,… More

Ahn, S. J., Hong, H. K., Na, Y. M., Park, S. J., Ahn, J., Oh, J., Chung, J. Y., Park, K. H., Woo, S. J. Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs. J. Vis. Exp. (113), e53878, doi:10.3791/53878 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter