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Medicine

Intraocular ड्रग्स के Pharmacokinetic अध्ययन में खरगोश आंखों के उपयोग

Published: July 23, 2016 doi: 10.3791/53878
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 1,2, 1,2,4, 5, 6, 1,2, 1,2
1Department of Ophthalmology, Seoul National University Bundang Hospital, 2Department of Ophthalmology, College of Medicine, Seoul National University, 3Department of Ophthalmology, Hanyang University Hospital, 4Department of Ophthalmology, Seoul Metropolitan Government-Seoul National University Boramae Medical Center, 5Department of Clinical Pharmacology, Seoul National University Hospital, 6Department of Clinical Pharmacology, Seoul National University Bundang Hospital

Abstract

जबकि उनके प्रणालीगत अवशोषण को कम औषधि प्रशासन की intraocular मार्ग, चिकित्सकीय दवाओं की उच्च सांद्रता के वितरण के लिए सक्षम बनाता है। कई दवाओं पूर्वकाल कक्ष या शीशे में प्रशासित रहे हैं, और intraocular इंजेक्शन विभिन्न intraocular रोगों के इलाज में प्रभावी किया गया है। खरगोश आँखों व्यापक रूप से, नेत्र अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में पशु अन्य स्तनधारियों की तुलना में संभाल करने के लिए आसान और किफायती है, और एक खरगोश आंख के आकार के एक मानव आँख के समान है। एक 30 जी सुई का प्रयोग, दवाओं खरगोश आंखों की intracameral और intravitreal रिक्त स्थान में इंजेक्ट किया जा सकता है। आंखों तब विश्लेषण जब तक जमे हुए हैं, और जलीय हास्य, कांच, और रेटिना / रंजित में विभाजित किया जा सकता है। कांच और रेटिना / रंजित नमूने homogenized और विश्लेषण से पहले solubilized जा सकता है। फिर, immunoassays प्रत्येक डिब्बे में intraocular दवाओं की सांद्रता को मापने के लिए किया जा सकता है। उचित फ़ार्माकोकायनेटिक मॉडल हो सकता हैइस तरह के आधा जीवन और नशीली दवाओं की अधिकतम एकाग्रता के रूप में कई मापदंडों की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। खरगोश आंखों intraocular दवाओं के फ़ार्माकोकायनेटिक के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल हो सकता है।

Introduction

intraocular दवा वितरण के आगमन से पहले, intraocular रोगों के लिए चिकित्सा उपचार की मुख्य चिंता का विषय दक्षता दवा के साथ जो आँख में घुसना सकता था। खून से नेत्र बाधा आंख में diffusing से दवाओं सहित कई पदार्थों, रोकता है। इसलिए, कि उपचार के स्तर से ऊपर हैं दवाओं की सांद्रता आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। Intracameral और intravitreal इंजेक्शन सहित intraocular औषधि प्रशासन विधि, सीधे कर सकते हैं, रक्त-नेत्र बाधा 1-3 बाईपास इतना है कि दवाओं के चिकित्सीय सांद्रता आंख 4,5 में प्राप्त किया जा सकता है।

तदनुसार, intravitreal दवा वितरण कई intraocular रोगों 5,6 के लिए इलाज का एक लोकप्रिय तरीका बन गया है। उदाहरण के लिए, intravitreal इंजेक्शन व्यापक रूप से उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन, मधुमेह रेटिनोपैथी, रेटिना नस अवरोध, और intraocular में संक्रमण 7-10 लिए किया जाता है। विशेष रूप से, के बाद सेविरोधी वीईजीएफ़ दवाओं का परिचय, intravitreal इंजेक्शन की आवृत्ति उल्लेखनीय रेटिना रोगों के उपचार के लिए बढ़ गया है। इसलिए, यह प्रभावकारिता और चिकित्सा उपचार की सुरक्षा के मूल्यांकन के लिए ऐसी दवाओं के intraocular फार्माकोकाइनेटिक्स समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

हालांकि दवाओं के intraocular प्रशासन नेत्र रोगों के लिए चिकित्सा उपचार में एक बड़ी सफलता, नेत्रगोलक के भीतर दवा एकाग्रता की निगरानी में माना जाता है तकनीकी रूप से मांग की है। क्योंकि मानव आंखों के जलीय हास्य (लगभग 200 μl) और कांच का (के बारे में 4.5 मिलीलीटर, 1 टेबल) की ही छोटी मात्रा में होते हैं, यह दवा एकाग्रता को मापने के लिए आंख का तरल पदार्थ की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन है। इसके अलावा, विधियों, ऐसे कांच का दोहन या पूर्वकाल कक्ष paracentesis रूप में है कि आंख तरल पदार्थ प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है, नेत्र ऊतकों को नुकसान पहुंचा है और इस तरह के मोतियाबिंद, endophthalmitis, या के रूप में गंभीर जटिलताओं में परिणाम हो सकता हैरेटिना टुकड़ी 11,12। तदनुसार, पशु मॉडल आमतौर पर इस्तेमाल किया intraocular दवाओं 13 के फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन में इस्तेमाल किया जाता है। इन पशु मॉडल के अलावा, खरगोश या बंदरों सबसे अक्सर इस्तेमाल जानवर हैं।

खरगोश, जो परिवार Leporidae में आदेश Lagomorpha के छोटे स्तनधारी हैं, दुनिया के कई हिस्सों में पाए जाते हैं। क्योंकि खरगोश आक्रामक नहीं हैं, वे संभाल एक प्रयोग में इस्तेमाल करते हैं, और निरीक्षण करने के लिए आसान कर रहे हैं। कम लागत, जानवर, मनुष्य के लिए इसी तरह की आंख के आकार के लिए तैयार की उपलब्धता, और तुलना पक्ष खरगोश आंखों का उपयोग फ़ार्माकोकायनेटिक के अध्ययन के प्रदर्शन के लिए जानकारी का एक बड़ा डेटाबेस। इस पत्र में, खरगोश आंखों में intraocular दवाओं के फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है।

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Protocol

हमारी प्रोटोकॉल सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी Bundang अस्पताल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) है, जो पशु प्रक्रियाओं और जानवरों की देखभाल के तरीकों इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत की सभी अनुमोदित के दिशा निर्देशों का पालन करती है। IACUC की देखभाल और उपयोग प्रयोगशाला पशु की (2011) के लिए गाइड के आठवें संस्करण के साथ पूर्ण अनुपालन में है। सभी प्रक्रियाओं पशुओं में नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए विजन और नेत्र विज्ञान वक्तव्य में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के दिशा निर्देशों के पालन के साथ प्रदर्शन किया गया। अलग-अलग पिंजरों खरगोश आवास के लिए इस्तेमाल कर रहे थे। अतिरिक्त सर्जरी या तैयारी इस प्रयोग से बाहर ले जाने से पहले (यानी, नसबंदी) की आवश्यकता नहीं किया जा सकता है।

खरगोश की आंखों में नशीली दवाओं की 1. intraocular इंजेक्शन

  1. tiletamine हाइड्रोक्लोराइड और zolazepam का एक मिश्रण की एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ स्वस्थ न्यूजीलैंड सफेद 1.5-2 किलो वजन खरगोश anesthetizeहाइड्रोक्लोराइड (15 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine हाइड्रोक्लोराइड (/ किलो 5 मिलीग्राम)। नेत्रच्छद (झपकी) पलटा निगरानी के द्वारा या कान चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की जाँच करें।
    नोट: एक intraocular दवा नेत्र पिगमेंट को बांधता है, तो बंधन की डिग्री दवा की आंख का फार्माकोकाइनेटिक्स के संशोधन के लिए प्रेरित कर सकता है। उदाहरण के लिए, रंजित खरगोशों के शीशे और जलीय humors में एक वर्णक बाध्यकारी दवा के आधे जीवन वृद्धि हुई सूरजमुखी मनुष्य खरगोश 14 में है कि तुलना में किया जा सकता है। इस मामले में, डेटा pigmented खरगोश आंखों से प्राप्त और अधिक मानव आंखों के लिए इसी तरह की और लागू के रूप में मानव आंखों रंजकता और सूरजमुखी मनुष्य खरगोश आंखों की एक अलग डिग्री मानव समकक्षों प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है हो सकता है। इस प्रकार, दवा-वर्णक बातचीत पर विचार, रंजित या सूरजमुखी मनुष्य खरगोश का उपयोग सावधानी से विचार किया जाना चाहिए और परिणाम खरगोश का तनाव (रंजकता) के साथ एक साथ व्याख्या की जानी चाहिए। हालांकि, सूरजमुखी मनुष्य खरगोश डी के रूप में फ़ार्माकोकायनेटिक गुण की तुलना अध्ययन में उपयोग के लिए सिफारिश कर रहे हैंगलीचा-वर्णक बातचीत तुलना में एक confounding कारक हो सकता है।
    1. 1% proparacaine हाइड्रोक्लोराइड नेत्र आई ड्रॉप के साथ एक सामयिक संवेदनाहारी लागू करें। संज्ञाहरण से वसूली जब तक आंख सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक मरहम (2% hydroxypropyl methylcellulose) का प्रयोग करें।
      नोट: जबकि anesthetized कभी खरगोश पहुंच से बाहर छोड़ दें।
  2. phenylephrine हाइड्रोक्लोराइड और tropicamide के एक या दो बूंदों के साथ पुतली चौड़ा करना।
  3. Intraocular इंजेक्शन से पहले शल्य चिकित्सा की तैयारी के लिए, एक कपास झाड़ू के साथ 5 periocular त्वचा के लिए 5-10% povidone आयोडीन लागू होते हैं। 5-10% povidone आयोडीन की एक बूंद आंख की कंजाक्तिवा पर रखें।
  4. Intraocular दवा प्रशासन या तो intravitreally या intracamerally सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए 5।
    ध्यान दें: दवा प्रणालीगत संचलन में लीन भी साथी आंख घुसना सकता है। एक दवा दोनों आंखों को दिलाई जाती है, एक आंख में दवा एकाग्रता में इंजेक्शन दवा से प्रभावित किया जा सकता हैदूसरी आँख। यह पुष्टि की है कि contralateral इंजेक्शन के प्रभाव प्रणालीगत संचलन में नशीली दवाओं के अन्य नेत्र घुसना नहीं कर सकते हैं के रूप में उपेक्षित किया जा सकता, intraocular इंजेक्शन के लिए दोनों आंखों का उपयोग करते हैं, माना जा सकता है के रूप में यह किफायती है और कम से कम जानवरों की संख्या के लिए बलिदान फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन करता है। intraocular इंजेक्शन के बाद प्रणालीगत एकाग्रता पर फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन के लिए, केवल एक ही आंख के उपयोग के लिए उपयुक्त है।
    1. Intravitreal इंजेक्शन के लिए, scleral सतह से 5 लंबरूप एक 30 जी सुई और या तो वाणिज्यिक 1 मिलीलीटर सीरिंज, इंसुलिन सीरिंज, या कांच सीरिंज का उपयोग कर intravitreally 1 मिमी superotemporal चक्र में शल्य किनारी के पीछे दवा इंजेक्षन।
      नोट: intracameral और intravitreal इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल दवा की मात्रा जांच के तहत दवाओं पर निर्भर करता है। खरगोश आंखों का उपयोग विरोधी वीईजीएफ़ एजेंटों पर फ़ार्माकोकायनेटिक प्रयोगों के लिए, पिछले अध्ययनों 0.025, 0.05 (सबसे सामान्य), या 0.1 मीटर का इस्तेमाल कियाbevacizumab या intracameral या intravitreal इंजेक्शन के लिए रानिबिज़ुमाब के एल। विरोधी संवहनी endothelial वृद्धि कारक, bevacizumab 15 के 0.05 मिलीलीटर, वीईजीएफ़-ट्रैप 16 वर्ष की रानिबिज़ुमाब की 0.025 मिलीग्राम, या 0.03 मिलीलीटर की intraocular फार्माकोकाइनेटिक्स पर हमारे पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया। Paracentesis बिना सबसे बड़ा सुरक्षित मात्रा 0.1 मिलीग्राम माना जा रहा है, हालांकि वहां कुछ सबूत यह 17 का समर्थन करने के लिए किया गया है। अत्यधिक मात्रा या तो intracamerally या intravitreally इंजेक्ट किया जाता है, तो intraocular दबाव काफी बढ़ जाती है। सीधे वृद्धि हुई intraocular दबाव (IIOP) की वजह से ऑप्टिक तंत्रिका क्षति, अर्थात् glaucomatous ऑप्टिक तंत्रिका क्षति, कई मामलों में IIOP बिगड़ा आंख का छिड़काव और केंद्रीय रेटिना धमनी रोड़ा है, जो मस्तिष्क में स्ट्रोक के अनुरूप है की ओर जाता है के अलावा।
    2. intracameral इंजेक्शन के लिए, ऊपर उठाव के साथ corneoscleral किनारी के माध्यम से एक 30 जी सुई डालने और यह देहात से आगे बढ़ कर पूर्वकाल कक्ष में दवा इंजेक्षनआईरिस विमान को rallel आईरिस या लेंस को आघात के जोखिम को कम करने के लिए।
      नोट: दवा तैयार करने पर निर्भर करता है, सुइयों से बड़ा 30 जी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। शर्तों बड़ा गेज सुई की आवश्यकता दवाओं युक्त microspheres, बड़े-प्रोटीन का सेवन, और उच्च चिपचिपाहट योगों में शामिल हैं।
    3. इंजेक्शन के बाद, एक बाँझ कपास टिप applicator घाव चिकित्सा को बढ़ावा देने के साथ इंजेक्शन साइट सेक।
      नोट: आम तौर पर, 30 सेकंड के घाव भरने, जब एक 30 जी सुई intraocular इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए पर्याप्त है। हालांकि, अगर एक बड़ा गेज सुई intraocular इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है, लंबे समय के घाव sclerotomy घाव से रिसाव को कम करने के लिए सील के लिए उपयुक्त होगा। sclerotomy घाव रिसाव के लिए जाँच करने के लिए विशेष रूप से अगर एक बड़ा गेज सुई प्रयोग किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए intraocular तुरंत intraocular इंजेक्शन के बाद इस्तेमाल किया दवा की मात्रा इंजेक्शन राशि के रूप में एक ही है कि महत्वपूर्ण है।
  5. निरीक्षण में इलाज के लिए दैनिक खरगोशएक सप्ताह है, और बाद में एक सप्ताह में एक बार, गंभीर intraocular सूजन (नेत्रश्लेष्मला इंजेक्शन और hypopyon) के किसी भी हस्ताक्षर के लिए इच्छामृत्यु जब तक।
    नोट: इंजेक्शन के बाद दर्दनाशक दवाओं का उपयोग कर एक 30 जी सुई एक न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है कि शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के साथ नहीं है intraocular इंजेक्शन के रूप में की आवश्यकता नहीं है। एक जानवर जब तक पूरी तरह से ठीक है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है।

2. नमूना तैयार

  1. स्पष्टीकरण के लिए, intraocular दवा इंजेक्शन के बाद विभिन्न बिंदुओं पर समय खरगोश (जैसे।, 1 घंटा या 1, 2, 5, 9, 14, या 30 दिन) euthanize।
    नोट: ये समय अंक ब्याज की दवा और ज्ञात फ़ार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल पर निर्भर करते हैं। हर समय बिंदु के लिए, कम से कम दो आंखों 13 का उपयोग करें। विश्वसनीय डेटा की गुणवत्ता के लिए, समय नमूना ध्यान से, संतुलित नमूने के साथ नशीली दवाओं के 13 में से दो आधा जीवन के कम से कम एक समय अवधि के लिए चुना जाना चाहिए कम से कम चार समय अंक 18, विशेष रूप से, पहले 24 घंटे के दौरान अधिक से अधिक 1 समय बिंदु महत्वपूर्ण है। तदनुसार, के लिए बड़े अणुओं (> 1,000 दा) 18, एक नमूना अवधि जैसे 1 घंटा और 1, 2, 5, 9, 14, और 30 दिन 19 एक अच्छा विकल्प हो सकता है। छोटे अणुओं (≤1,000 दा), 1, 2, 4, और 8 घंटा और 1, 3, और 7 दिनों के लिए एक विकल्प हो सकता है 20। आणविक वजन पर निर्भर करता है, नमूना अवधि आगे संशोधित किया जा सकता है।
    1. इच्छामृत्यु के लिए, तेजी से tiletamine हाइड्रोक्लोराइड, zolazepam हाइड्रोक्लोराइड (15 मिलीग्राम / किग्रा), और xylazine हाइड्रोक्लोराइड (/ किलो 5 मिलीग्राम) के एक मिश्रण की एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ खरगोश anesthetizing के बाद 15% नसों में KCl के 10 मिलीलीटर प्रशासन।
  2. एक पलक प्रतिकर्षक साथ नेत्रच्छद विदर खोलें। किनारी के लिए एक 360 डिग्री conjunctival चीरा 2-3 मिमी पीछे बनाओ और ग विदारक से यह पीछे का विस्तारonjunctiva और दुनिया से चूल कैप्सूल।
  3. दुनिया में उनकी प्रविष्टि के करीब extraocular मांसपेशियों कट। घुमावदार संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका दबाना और फिर संदंश और दुनिया के बीच तंत्रिका काटा। नेत्रगोलक खुद को दूर करते हुए आसपास के ऊतकों को बरकरार जा। स्पष्टीकरण के बाद, तुरंत आंखों फ्रीज और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    नोट: तत्काल ठंड के लिए दो विकल्प हो सकता है। दवा एकाग्रता एक बहुत ही प्रारंभिक चरण में मापा जाता है (यानी। 1 घंटा से भी कम), तरल नाइट्रोजन अधिक नेत्रगोलक की बेहतर समय पर ठंड सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त हो सकता है। हालांकि, बाद के समय के लिए, बर्फ तुरंत नेत्रगोलक शांत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और फिर डीप फ्रीजर -80 डिग्री सेल्सियस पर आंखों को स्टोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. समय बिंदुओं के सभी के लिए आंखों प्राप्त करने के बाद, तीन डिब्बों, कांच, जलीय हास्य, और रेटिना / रंजित में जमे हुए आंखों अलग। defros से पहले इन डिब्बों को अलग करेंटिंग।
    नोट: तीन डिब्बों में अलग होने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह प्रक्रिया की गति है। नेत्रगोलक defrosting से पहले बहुत जल्दी अलग किया जाना चाहिए और प्रक्रिया विगलन देरी करने के लिए बर्फ पर किया जा सकता है।
    1. ग्लोब खोलने के लिए, कॉर्निया किनारी (300 डिग्री या अधिक) एक छुरी ब्लेड के साथ एक चीरा बनाते हैं। आईरिस, जलीय हास्य के सामने जमे हुए डिब्बे प्राप्त करते हैं।
    2. खींच रहा है और ऊतक संदंश का उपयोग excoriating से जमे हुए आईरिस और लेंस निकालें। कांच का सुलभ हो जाता है, शेष ऊतकों (रेटिना / रंजित / श्वेतपटल) से अलग से जमे हुए कांच प्राप्त करते हैं।
    3. एक नहीं, 15 स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, अंतर्निहित श्वेतपटल से रेटिना / रंजित ऊतक अलग।
  5. immunoassays के लिए, जलीय हास्य नमूने defrost, और प्रत्येक नमूने की मात्रा को मापने। ट्यूब युक्त टी के उस से एक खाली ट्यूब के वजन घटाकर से जमे हुए नमूने के वजन को मापनेवह नमूना जमे हुए।
    नोट: क्योंकि जमे हुए नमूने के विशिष्ट गुरुत्व लगभग 1 है, प्रत्येक नमूने का वजन नमूने की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. कांच के नमूने वजन, नमूने defrost, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फॉस्फेट बफर एक रोटेटर पर 1% गोजातीय सीरम albumin युक्त नमक की 1.0 मिलीलीटर में उन्हें solubilize। फिर, 10 मिनट, 21 के लिए 387 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  7. homogenization के लिए जमे हुए रेटिना / रंजित नमूने वजन। 01:10 (ऊतक के 1 जी / अभिकर्मक के 10 एमएल) के अभिकर्मक के लिए ऊतक के अनुपात के साथ प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक जोड़ें। एक पूर्व ठंडा microhomogenizer का उपयोग ऊतक homogenize। 12,000-20,000 XG पर 10 मिनट के लिए lysed नमूना अपकेंद्रित्र और एक ठंडा ईपीपी ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।

3. Immunoassay

नोट: कई विश्लेषणात्मक तरीके प्रोटीन एकाग्रता की माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उपयुक्त मात्रात्मक विधि चुनें, डीपता लगाने रेंज पर epending। संक्षेप में, एचपीएलसी के चयनित आयन निगरानी मोड, जबकि नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस क्रमश: एम आर एम / पी आर एम मोड के साथ की रूपरेखा के लिए प्रोटीन की nanogram और picogram स्तर का पता लगाने कर सकते हैं, अणु की picogram स्तर का पता लगाने कर सकते हैं। एलिसा का पता लगाने सीमा picogram स्तर पर माना जाता है।

  1. अप्रत्यक्ष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (ELISAs) के लिए विरोधी वीईजीएफ़ एजेंटों की सांद्रता को मापने के लिए, 96 अच्छी तरह प्लेटों में एलिसा किट का उपयोग ब्याज की दवा का पता लगाने और ज्ञात दवा सांद्रता के एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए।
    1. कांच का, जलीय हास्य, और सांद्रता है कि रैखिक सीमा के भीतर हैं करने के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 0.1% गोजातीय सीरम albumin के साथ रेटिना / रंजित नमूने पतला, और परख के लिए इन का उपयोग करें।
  2. 100 μl पर थाली पर aliquots में नमूने फूट डालो / अच्छी तरह से। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं और फिर प्लेट 0 के समाधान धोने के 200 μl का उपयोग करते हुए तीन बार धोएं।1x पीबीएस में 05% Tween20।
    नोट: एलिसा के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में नमूना कृत्यों में विरोधी वीईजीएफ़ उपस्थित; इसलिए, एक प्राथमिक एंटीबॉडी के अतिरिक्त उपयोग आवश्यक नहीं है।
  3. 1 के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी पतला: 1x पीबीएस में 20,000 0.1% बीएसए, और अच्छी तरह पतला प्रति-समाधान के 100 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक पतला एंटीबॉडी के साथ थाली incubating के बाद, 450 एनएम तरंगदैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने। प्रत्येक मानक और नमूना के लिए डुप्लिकेट रीडिंग के औसत से औसत शून्य मानक ऑप्टिकल घनत्व घटाएँ।
  4. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर इस तरह के SoftMax प्रो के रूप में एक चार पैरामीटर रसद (4-पीएल) वक्र फिट, पैदा करने में सक्षम डेटा का उपयोग कर कम करने से एक मानक ज्ञात सांद्रता के साथ दवा के समाधान से रिश्तेदार प्रकाश संकेत के आधार पर वक्र बनाएँ। [फ़िट] - एक मानक वक्र बनाने के लिए, 4-पी एल वक्र फिट [स्टैंडर्ड वक्र] में [4 पैरामीटर] पर क्लिक करके प्राप्त किया जा सकता है।
  5. नमूने fr में दवा एकाग्रता की गणनाओम मानक वक्र।
    नोट: विरोधी वीईजीएफ़ दवाओं का पता लगाने की सीमा (लोद) हमारे प्रयोग में जांच की गई। bevacizumab की लोद .024-3.125 एनजी / एमएल था और aflibercept की कि 0.039-10 एनजी / एमएल था।

4. Pharmacokinetic विश्लेषण के तरीके

नोट: पी विश्लेषण के लिए, एक या तो पूरक या गैर पूरक विश्लेषण का उपयोग कर सकते हैं। पूरक विश्लेषण में, अणुओं के स्वभाव व्यवहार एक समीकरण (मॉडल) के द्वारा समझाया जा सकता है। इस प्रकार, पूरक पी विश्लेषण किसी भी समय टी में एकाग्रता की भविष्यवाणी जबकि गैर पूरक मॉडल कल्पना या अन्य खुराक परहेजों के लिए एकाग्रता समय प्रोफाइल भविष्यवाणी नहीं कर सकते कर सकते हैं। हालांकि, पूरक मॉडल की फिटिंग एक जटिल और लंबी प्रक्रिया हो सकती है। इसके विपरीत, मान्यताओं गैर पूरक मॉडल में कम प्रतिबंधक हैं। गैर पूरक विधि सरल और आमतौर पर इस्तेमाल इस तरह के आधा जीवन, निकासी, और वितरण की मात्रा के रूप फ़ार्माकोकायनेटिक मापदंडों की गणना करने के लिए है।हम विरोधी वीईजीएफ़ एजेंटों पर फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन के लिए पूरक मॉडल चुना है।

  1. ऐसे फ़ीनिक्स WinNonlin सॉफ्टवेयर के रूप में पूरक मॉडल मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ दवा एकाग्रता डेटा का विश्लेषण।
    1. [पी मॉडल] [WNL5 क्लासिक मॉडलिंग] में क्लिक करें और [सेटअप] मेनू में नक्शा अवलोकन समय, प्रशासित खुराक, और दवा एकाग्रता।
    2. पूरक मॉडल (जैसे, डिब्बों की संख्या) [मॉडल चयन] टैब में चयन करें, और मॉडल मापदंडों की गणना करने के लिए [निष्पादन] बटन पर क्लिक करें।
  2. (। उदाहरण के लिए, मानक त्रुटि) (1) Akaike सूचना कसौटी, (2) पैरामीटर अनुमान की परिशुद्धता, और (3) चित्रमय विश्लेषण: विश्लेषण के बाद, अंतिम डिब्बे मॉडल सबसे अच्छी दवा एकाग्रता निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर डेटा का वर्णन करता है कि चयन (जैसे।, फिट भूखंडों की अच्छाई)।
  3. इस तरह के आधा जीवन (टी 1/2) और समय-concentra के तहत क्षेत्र के रूप में ब्याज की फ़ार्माकोकायनेटिक मापदंडों की गणनाtion वक्र (नीलामी), मॉडल मापदंडों और समीकरणों पूरक मॉडल के द्वारा संचालित से।

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Representative Results

प्रक्रिया है कि बाँझ तकनीकों के साथ खरगोश आँखों में ब्याज की एक दवा का इंजेक्शन intravitreal संचालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है चित्रा 1 में दिखाया गया है। इलाज किया आंखें एक निर्धारित समय पर enucleated और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। विश्लेषण, तीन डिब्बों, जलीय हास्य, कांच, और रेटिना / रंजित के लिए, जमे हुए खरगोश आंखों से अलग हो रहे हैं के रूप में चित्रा 2 में प्रदर्शन किया। डिब्बों के नमूने एलिसा के लिए तैयार हैं। एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, ऑप्टिकल घनत्व एक 96 अच्छी तरह से थाली है, जो तीन डिब्बों से मानक वक्र के लिए ब्याज और नमूने की दवा है कि intravitreal इंजेक्शन के बाद कई समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे के ज्ञात सांद्रता शामिल में मापा जाता है (चित्रा 3)। एकाग्रता डेटा मानक वक्र (पूरक चित्रा 1) से गणना की है कि pharmacokine करने के लिए लगाया जा सकता हैटिक मॉडल, और फ़ार्माकोकायनेटिक मानकों को फिट लाइन (चित्रा 4) से निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 4 में, की फार्माकोकाइनेटिक्स intravitreally में इंजेक्शन bevacizumab vitrectomized और गैर-vitrectomized आंखों का मूल्यांकन किया और तुलना की गई। पूरक पी विश्लेषण जो निम्न समीकरण प्रदान की पीके व्यवहार की व्याख्या करने के लिए किया गया था।

सी (टी) = सी 1 ऍक्स्प (- कश्मीर 1 टी) + सी '2 ऍक्स्प (- कश्मीर 2 टी)

सी (माइक्रोग्राम / एमएल): किसी भी समय टी (घंटे) में एकाग्रता

सी 1, सी 2: वितरण और उन्मूलन चरण के पीछे-extrapolated अवरोध

कश्मीर 1, कश्मीर 2: वें पर दर स्थिरांकई वितरण और उन्मूलन के चरण

के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, अनुमान एकाग्रता फिट मॉडल के अनुसार वास्तविक मापा मूल्यों के लिए काफी अच्छी तरह से मेल नहीं खाते। वहाँ इस तरह के साथ और बिना vitrectomy के बीच आधे-जीवन के रूप में bevacizumab और फ़ार्माकोकायनेटिक मापदंडों के शीशे एकाग्रता में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे। इस प्रयोग से पता चलता है कि वितरण और bevacizumab की निकासी में कांच की भूमिका नगण्य है।

आकृति 1
चित्रा 1:। संज्ञाहरण के तहत खरगोश आँखों में intraocular ड्रग्स के Intravitreal इंजेक्शन प्रदर्शन करने की प्रक्रिया सड़न रोकनेवाला तकनीक का 5% povidone आयोडीन की बूंदों को लागू करने से और त्वचा की तैयारी, और ब्याज की दवा की intravitreal इंजेक्शन द्वारा उपयोग किया जाता है एक सिरिंज फिट उपयोग किया जाता है बुद्धिहा 30 जी सुई। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। तीन डिब्बों में जमे हुए खरगोश नेत्रगोलक की पृथक्करण एक सर्जिकल ब्लेड और आइरिस को हटाने के साथ scleral चीरा के बाद, जलीय हास्य और कांच का अलग किया जा सकता है। बाद में, रेटिना / रंजित श्वेतपटल, जो नेत्रगोलक की सफेद बाहरी परत है से ध्यान से अलग किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एंजाइम से जुड़ी इम्यूनोSorbent नमूने तीन डिब्बों का प्रतिनिधित्व करने में Intraocular ड्रग की परख (एलिसा)। यह आंकड़ा एक 96 अच्छी तरह से थाली है, जो प्रतिरक्षा के लिए प्रयोग किया जाता है पता चलता है। एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, एक रंग बदलने के कुओं में उल्लेख किया है। रंग के ऑप्टिकल घनत्व ब्याज की दवा की एकाग्रता पर निर्भर करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Pharmacokinetic मॉडल को मनाया डेटा फिटिंग इस प्रयोग vitrectomized और गैर-vitrectomized आँखों में bevacizumab की फार्माकोकाइनेटिक्स की तुलना में, bevacizumab की वास्तविक intravitreal एकाग्रता डॉट्स के रूप में प्रस्तुत किया है। एकाग्रता डेटा के लिए फिट घटता है कि फ़ार्माकोकायनेटिक द्वारा संचालित कर रहे हैंमॉडल है, जो दो लाइनों से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, खींचा और इस तरह की दवा के आधे जीवन के रूप में फ़ार्माकोकायनेटिक मापदंडों की गणना के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। त्रुटि सलाखों 95% विश्वास अंतराल संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1:। एलिसा Bevacizumab की जांच के लिए प्रयुक्त की मानक वक्र यह सॉफ्टवेयर एक चार पैरामीटर रसद वक्र फिट पैदा करने में सक्षम का उपयोग कर प्राप्त की है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

जाति कांच का आँख में लेंस और कॉर्निया के बीच नेत्रगोलक के सामने जगह भरने साफ तरल पदार्थ संदर्भ लेंखिलाडि़यों
माउस 5.3 μl 4.4 μl 22
चूहा 50-55 μl 13.6 μl 22, 24
खरगोश 1.15-1.7 मिलीलीटर 350 μl 23, 27, 28
बंदर 3.0-4.0 मिलीलीटर 102 μl 23, 26, 28
मानव 3.0-5.0 मिलीलीटर 144 - 247 μl 23, 20, 21, 28

तालिका 1: विभिन्न प्रजातियों 17,22-30 में कांच और जलीय हास्य मात्रा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zoletil Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride  Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine) Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165 R&D systems 293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer SIGMA C3041-50CAP
Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si Thermo SCIENTIFIC 167008 96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) BOVOGEN BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml gibco 10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) abcam ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo SCIENTIFIC PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent SIGMA C3228-50ML lysis buffer
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #15
100 Scalpel Blades nopa instruments BLADE #10
Feather surgical blade stainless steel FEATHER 11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml Thermo SCIENTIFIC 34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml Thermo SCIENTIFIC 34062
Softmax Pro Molecular Devices v.5.4.1 software for generating standard curve
SAAM II  Saam Institute, Seattle, WA software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin Pharsight, Cary, NC v. 6.3 software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab) Genentech

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Intraocular ड्रग्स के Pharmacokinetic अध्ययन में खरगोश आंखों के उपयोग
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Ahn, S. J., Hong, H. K., Na, Y. M.,… More

Ahn, S. J., Hong, H. K., Na, Y. M., Park, S. J., Ahn, J., Oh, J., Chung, J. Y., Park, K. H., Woo, S. J. Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs. J. Vis. Exp. (113), e53878, doi:10.3791/53878 (2016).

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