Abstract
彼らの全身吸収を最小限に抑えながら、薬物投与の眼内経路は、治療薬の高濃度の配信を可能にします。いくつかの薬剤は、前房または硝子体内に投与され、眼内注射は、様々な眼疾患を硬化させるのに有効でした。動物は、他の哺乳類に比べて取り扱いが容易かつ経済的であるように、ウサギの目は広く、眼科研究のために使用されており、ウサギの眼の大きさは、人間の目と同様です。 30 G針を使用して、薬物は、ウサギの眼の房内および硝子体内空間に注入することができます。眼球は、分析まで凍結され、房水、硝子体、及び網膜/脈絡膜に分けることができます。硝子体および網膜/脈絡膜サンプルを均質化し、分析の前に可溶化することができます。そして、イムノアッセイは、各区画内に、眼内の薬物の濃度を測定するために行うことができます。適切な薬物動態学的モデルは、することができますこのような半減期および薬物の最大濃度などのいくつかのパラメータを計算するために使用されます。ウサギの眼は、眼内の薬物の薬物動態学的研究のための良いモデルとなり得ます。
Introduction
眼内薬物送達の出現する前に、眼内疾患に対する薬物療法の主な関心事は、薬物が眼に浸透可能性があると効率でした。血液眼関門は、眼への拡散が、薬物を含む多くの物質を、防ぐことができます。したがって、治療レベルより上である薬物の濃度を容易に得ることがないかもしれません。薬物の治療濃度は、眼4,5で達成することができるように房内および硝子体内注射を含む眼内薬物投与の方法は、直接、血液眼関門1-3をバイパスすることができます。
したがって、硝子体内薬物送達は、いくつかの眼疾患5,6のための治療の一般的な方法となっています。例えば、硝子体内注射が広く、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、眼内感染7-10に対して行われます。具体的には、以来、抗VEGF薬の導入は、硝子体内注射の頻度は著しく網膜疾患の治療のために増加しています。したがって、薬物療法の有効性および安全性を評価するためのこのような薬物の眼内薬物動態を理解することが重要です。
薬物の眼内投与は、眼疾患のための医学的治療における画期的な成果であると考えられているが、眼球内薬物濃度を監視することは技術的に厳しいです。人間の目は唯一の房水の少量（およそ200μL）および硝子体（約4.5 mlであり、 表1）を含有するので、薬物濃度を測定するために、眼の流体の十分な量を得ることは技術的に困難です。さらに、このような硝子体タッピングまたは前房の穿刺などの眼の流体を得るために使用される方法は、眼組織に損傷を与え、例えば白内障、眼内炎、又は重篤な合併症をもたらし得ます網膜剥離11,12。従って、動物モデルは、一般的に使用される眼内薬物13の薬物動態学的研究において使用されています。これらの動物モデルの中で、ウサギやサルは、最も頻繁に使用される動物です。
家族のウサギ科で注文ウサギ目の小さな哺乳動物であるウサギは、世界のいくつかの部分で発見されています。ウサギは攻撃的ではないので、取り扱いが容易で、実験に使用し、観察します。低コスト、人間に対する動物、同様の目の大きさが容易に入手できる、と比較好意がウサギの眼を使用して、薬物動態学的研究を行うための情報の大規模なデータベース。本論文では、ウサギの眼における眼薬の薬物動態試験のためのプロトコルが記載されています。
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Protocol
私たちのプロトコルは、このプロトコルで提示動物処置と動物のケア方法の全てを承認した盆唐ソウル大病院の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）のガイドラインに従います。 IACUCは、実験動物の管理と使用に関する指針の第八版（2011年）に完全に準拠しています。すべての手順は、動物における眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科計算書の研究のための協会のガイドラインを順守して行われました。個々のケージは、ウサギを収容するために使用されました。この実験を実施する前に、追加の手術または調製（ すなわち 、殺菌）が必要とされないことがあります。
ウサギの眼への薬物の1眼内注射
- チレタミン塩酸塩とゾラゼパムの混合物の筋肉内注射で1.5〜2キロの体重の健康のニュージーランド白ウサギを麻酔塩酸塩（15ミリグラム/ kg）および塩酸キシラジン（5 mgの/ kgで）。眼瞼（点滅）反射を監視することによって、または耳のピンチによって麻酔を確認します。
注：眼内薬物が眼の顔料に結合する場合、結合の程度は、薬物の眼の薬物動態の変更を誘発する可能性があります。例えば、着色されたウサギの硝子体および水性体液中の顔料結合性薬物の半減期はアルビノウサギ14のそれと比較して増加することができます。人間の目は、ヒト対応物を表していない可能性色素沈着およびアルビノウサギの眼の異なる程度を有するので、この場合には、着色されたウサギの眼から得られたデータは、人間の目に類似し、適用することができます。したがって、薬物顔料の相互作用を考慮すると、色素性またはアルビノウサギの使用は慎重に検討すべきであるとの結果がウサギの株（色素沈着）と一緒に解釈されるべきです。しかし、アルビノウサギをdと薬物動態学的特性を比較した研究で使用するために推奨されています敷物顔料の相互作用は、比較において交絡因子であり得ます。- 1％の塩酸プロパラカイン眼科点眼薬と局所麻酔薬を適用します。麻酔から回復するまで、目の乾燥を防ぐために、獣医軟膏（2％ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を使用します。
注：麻酔ながら無人のウサギを残すことはありません。
- 1％の塩酸プロパラカイン眼科点眼薬と局所麻酔薬を適用します。麻酔から回復するまで、目の乾燥を防ぐために、獣医軟膏（2％ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を使用します。
- 塩酸フェニレフリンおよびトロピカミドの一又は二滴で瞳孔を拡張。
- 眼内注射の前に外科手術の準備のために、綿棒5と眼周囲の皮膚に5〜10％ポビドンヨードを適用します。目の結膜に5〜10％ポビドンヨードの一滴を置きます。
- 無菌技術5のいずれかを使用して硝子体内または房内眼薬を管理します。
注：全身循環に吸収された薬物はまた、仲間の目を貫通していてもよいです。薬物を両眼に投与した場合、一方の眼における薬物濃度が中に注入薬剤によって影響を受ける可能性があります他の目。それは、他の目を貫通することができない対側注射の効果は、全身循環における薬剤として無視することができることが確認された場合、それは経済的であり、動物の数のために犠牲に最小化するように、眼内注射のための両眼を使用することは、考えることができます薬物動態試験。眼内注射後の全身濃度に対する薬物動態学的研究のために、片目だけの使用が適切です。- 硝子体内注射のために、強膜面5に対して垂直に30 G針とのいずれかの商業1ミリリットル注射器、インスリン注射器、またはガラスシリンジを使用して、硝子体内に1ミリメートルsuperotemporal象限の外科的角膜輪部の背後に薬剤を注入します。
注：房内と硝子体内注射のために使用される薬剤の量は、調査中の薬に依存して変化します。ウサギの眼を用いて、抗VEGF薬に薬物動態学的実験のために、以前の研究では0.025、0.05（最も一般的）、または0.1メートルを使用しました房内または硝子体内注射のためのベバシズマブまたはラニビズマブのリットル。抗血管内皮増殖因子、0.05ベバシズマブ15 mlの、VEGFトラップ16の0.025ラニビズマブのミリリットル、0.03ミリリットルの眼内薬物動態学に関する我々の以前の研究に使用しました。この17をサポートするためにはほとんど証拠があったが、穿刺せずに最大の安全量は0.1 mlであると考えられています。過度のボリュームがいずれか房内または硝子体内に注入されている場合は、眼圧が大幅に増加しています。直接眼圧の上昇（IIOP）によって引き起こされる視神経損傷、すなわち緑内障視神経損傷に加えて、極端な場合には、IIOPは、脳内の脳梗塞に類似しており、障害のある眼灌流および網膜中心動脈閉塞につながります。 - 房内注射のために、ベベルアップで強角膜輪部を通って30 Gの針を挿入し、それにPAを前進させることによって、前房内に薬剤を注入しますアイリスやレンズへの外傷のリスクを最小限に抑えるために、虹彩面にrallel。
注：製剤に応じて、30 Gを使用することができるより大きな針。より大きなゲージの針を必要とする条件は、薬物を含有するマイクロスフェア、大タンパク質薬剤、および高粘度の製剤を含みます。 - 注入後、創傷治癒を促進するために、滅菌綿チップアプリケーターで注射部位を圧縮します。
注：30 G針が眼内注射のために使用される場合、通常、30秒、創傷治癒のために十分です。より大きなゲージの針が眼内注射のために使用される場合は、より長い時間が強膜切開創からの漏れを最小限に抑えるために密封創傷に適切であろう。強膜切開創漏れをチェックするには、より大きなゲージの針が使用されている場合は特に、眼内注射直後に使用する眼内薬物の量は、注入量と同じであることを確認することが重要です。
- 硝子体内注射のために、強膜面5に対して垂直に30 G針とのいずれかの商業1ミリリットル注射器、インスリン注射器、またはガラスシリンジを使用して、硝子体内に1ミリメートルsuperotemporal象限の外科的角膜輪部の背後に薬剤を注入します。
- 毎日処置したウサギを守って1週間、その後週に一度、重度の眼内炎（結膜充血及び前房蓄膿）の兆候のために安楽死まで。
注：鎮痛剤は、注射後30 Gの針を用いて眼内注射として必要とされていないが、手術後の痛みを伴わない低侵襲的処置です。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
2.試料の調製
- 除核のために、眼内薬物注射後の様々な時点（ 例えば 、1時間または1、2、5、9、14、または30日）でウサギを安楽死させます。
注：これらの時点は、関心のある薬物と知られている薬物動態プロファイルに依存します。各時点について、少なくとも二つの眼球13を使用します 。信頼性の高いデータ品質を得るには、サンプリング時間は、慎重に薬剤13の2半減期の少なくともタイムスパンのためのバランスのとれたサンプリングで少なくとも4時間のポイントを選択すべきです）18については、特に、1以上の時点最初の24時間の間には非常に重要です。したがって、高分子（>千ダ）18のために、このような1時間と1、2、5、9、14、および30日19としてサンプリング周期は良いオプションをすることができます。小分子（≤1,000ダ）、1、2、4、8時間、および1、3、7日間一つの選択肢20であることができます。分子量に応じて、サンプリング期間をさらに修飾することができます。- 安楽死のために、迅速にチレタミン塩酸塩、ゾラゼパム塩酸塩（15ミリグラム/キログラム）、および塩酸キシラジン（/ kgの5 mg）を混合物の筋肉内注射してウサギを麻酔した後、15％の静脈内のKClを10mlを投与。
- まぶたのリトラクターと瞼裂を開きます。角膜輪部に360°結膜切開2〜3ミリメートルの後部を作成し、Cを解剖することによって後方にそれを拡張世界中からonjunctivaとテノン嚢。
- 地球へのそれらの挿入に近い外眼筋を切りました。曲がったピンセットで視神経をクランプした後、ピンセットと地球の間に神経を切断します。無傷の周囲の組織を残しながら、眼球自体を削除してください。眼球摘出後、すぐに眼球を凍結し、-80℃で保管してください。
注：即時凍結するための2つのオプションがあるかもしれません。薬物濃度は、非常に初期の段階（ すなわち 、1時間未満）で測定された場合、液体窒素は、眼球の良い適時凍結を確実にするために、より適切であるかもしれません。しかし、後続の期間について、氷はすぐに眼球を冷却するために使用することができ、その後ディープフリーザーを-80℃で眼球を格納するために使用することができます。 - 時点のすべてのために眼球を取得した後、3つの区画、硝子体、房水、および網膜/脈絡膜に凍結された眼球を分けます。 defros前に、これらの区画を分離ティン。
注：3つの区画に分離するために最も重要な点は、手続きの速度です。眼球は、解凍の前に非常に迅速に分離する必要があり、手順は、解凍を遅らせる氷上で行うことができます。- 地球を開くには、メスの刃で角膜輪部（300℃以上）で切開を行います。アイリス、房水の前に凍結されたコンパートメントを取得します。
- 引っ張り、組織鉗子を使用してexcoriatingにより冷凍虹彩とレンズを取り外してください。硝子体がアクセス可能になると、残りの組織（網膜/脈絡膜/強膜）からそれを分離することによって凍結した硝子体を得ます。
- 15番手術用メスの刃を使用して、根本的な強膜から網膜/脈絡膜組織を分離します。
- イムノアッセイのために、房水サンプルを解凍し、各サンプルの体積を測定します。 Tを含むチューブとは、空の管の重量を差し引くことにより凍結試料の重量を測定します彼はサンプルを凍結させました。
注：凍結試料の比重がほぼ1であるので、各試料の重量は、試料の体積を計算するために使用することができます。 - 、硝子体サンプルを秤量サンプルを解凍し、4℃で一晩、回転体の1％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水1.0 ml中にそれらを可溶化します。その後、10分21 387×gでサンプルを遠心します。
- 均質化のために凍結された網膜/脈絡膜サンプルを計量。 1：10（試薬の組織/ 10ミリリットルの1グラム）の試薬に対する組織の比率でタンパク質抽出試薬を追加します。予備冷却マイクロホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズします。 12,000〜20,000×gで10分間の溶解サンプルを遠心分離し、チルドEPPチューブに上清を移します。
3.イムノアッセイ
注：いくつかの分析方法は、タンパク質濃度の測定のために使用することができます。 D、適切な定量法を選択してください検出範囲にepending。 LC-MS / MSは、それぞれ、MRM / PRMモードでプロファイリングのためのタンパク質のナノグラムおよびピコグラムレベルを検出することができ、一方、簡単に言えば、HPLCの選択イオンモニタリングモードでは、分子のピコグラムレベルを検出することができます。 ELISAの検出限界は、ピコグラムレベルであると考えられています。
- 間接酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、抗VEGF剤の濃度を測定する目的の薬物を検出し、既知の薬物濃度の標準曲線を生成するために、96ウェルプレートでのELISAキットを使用します。
- 硝子体、房水、および直線範囲内にある濃度の1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.1％ウシ血清アルブミンを網膜/脈絡膜サンプルを希釈し、アッセイのためにこれらを使用します。
- 100μl/ウェルでプレートにアリコートにサンプルを分割します。 4℃で一晩インキュベートした後、プレート0の洗浄溶液200μlで3回洗浄します。1×PBSで05パーセントのTween20。
注：抗VEGF ELISAのための一次抗体としてサンプルの行為中に存在します。従って、一次抗体のさらなる使用は不要です。 - 1×PBS中0.1％BSA 20,000、およびウェルあたり希釈液の100μlを添加する：1に二次抗体を希釈します。 4℃で一晩、希釈した二次抗体を用いてプレートをインキュベートした後、波長450nmにおける光学密度を測定します。各標準およびサンプルの重複測定値の平均から平均ゼロ標準光学密度を差し引きます。
- そのようなプロのSoftMaxような4パラメータロジスティック（4-PL）曲線適合を生成することが可能なコンピュータソフトウエアを使用してデータを削減することによって、既知の濃度の薬剤の溶液からの相対的な光信号に基づいて、標準曲線を作成します。 [フィット] - 標準曲線を作成するために、4-PL曲線フィットは、[検量線]の[4-パラメーター]をクリックすることによって得ることができます。
- サンプルのFR中の薬物濃度を計算します標準曲線をオム。
注：抗VEGF薬の検出限界（LOD）は、当社の実験で調べました。ベバシズマブのLODはミリリットル0.024から3.125 ngの/であったとアフリベルセプトのそれは0.039から10 ng / mlでした。
4.薬物動態解析手法
注：PK分析のために、1はコンパートメントまたは非コンパートメント解析のいずれかを使用することができます。コンパートメント解析では、分子の配置の動作は、方程式（モデル）によって説明することができます。非コンパートメントモデルは、他の投与計画についての濃度 - 時間プロファイルを視覚化するか予測することはできないのに対し、このように、コンパートメントPK解析は、任意の時間tにおける濃度を予測することができます。しかし、コンパートメントモデルのフィッティングは、複雑で時間のかかるプロセスすることができます。これとは対照的に、仮定は非コンパートメントモデルでは制限の少ないです。ノンコンパートメント方法はシンプルで、このような半減期、クリアランスおよび分布容積のような薬物動態パラメータを計算するために一般的に使用されます。我々は、抗VEGF薬に関する薬物動態学的研究のためのコンパートメントモデルを選びました。
- このようなフェニックスWinNonlinソフトウェアとしてモデリングソフトウェアを使用してコンパートメントモデルと薬物濃度データを分析します。
- 【WNL5古典的なモデリング]の[PKモデル]をクリックし、[設定]メニューの観測時間、投与量、および薬物濃度をマッピングします。
- [モデル選択]タブで（ 例えば 、区画の数）コンパートメントモデルを選択して、モデルパラメータを計算するために、[実行]ボタンをクリックします。
- （ 例えば 、標準誤差）（1）赤池情報量基準、（2）パラメータ推定値の精度、および（3）のグラフィカルな分析：分析した後、最高の以下の基準に基づいて薬物濃度データを記述し、最終的なコンパートメントモデルを選択（ 例えば 、フィットプロットの良）。
- このような時間concentra下の半減期（T 1/2）および領域として関心の薬物動態パラメータを算出コンパートメントモデルによって駆動されるモデルパラメータと方程式からション曲線（AUC）、。
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Representative Results
無菌技術を用いてウサギの眼への関心の薬物の硝子体内注射を行うために使用される手順は、図1に示されている。処置した眼は、スケジュールされた時間に摘出し、-80℃で保存します。分析のために、3つの区画、房水、硝子体、及び網膜/脈絡膜は、 図2に示されているように、凍結されたウサギの眼から分離されている。区画のサンプルをELISAのために用意されています。二次抗体とのインキュベーション後、光学密度を硝子体内注射（ 図た後複数の時点で採取した3つの区画からの標準曲線及びサンプルの対象の薬物の既知の濃度を含有する96ウェルプレート中で測定されます3）。標準曲線（補足図1）から算出された濃度データはpharmacokineに装着することができますチックモデルおよび薬物動態パラメータは、近似直線（ 図4）から求めることができます。 図4では、vitrectomizedおよび非vitrectomized目に硝子体内に注入されたベバシズマブの薬物動態を評価し、比較しました。コンパートメントPK分析は、PKの動作を説明するために以下の式を提供する、行いました。
（ - 2トンをK） - C（トン）= C 1のexp（1トンをK）+ C '2のexp
C（μgの/ mL）を：任意の時刻t（時間）での濃度
C 1、C 2：分布および排泄相の後方補外切片
目での速度定数：1 で、k 2 k 個電子分布及び排出相
図4に示すように、当てはめモデルに従って推定濃度は実測値に非常によく一致しました。 withや硝子体切除なしの間の半減期としてベバシズマブ及び薬物動態パラメータの硝子体濃度に有意差はなかったです。この実験は、ベバシズマブの分布およびクリアランスにおける硝子体の役割は重要でないことを示唆しています。
図1： ウサギ眼の下麻酔眼内薬物の硝子体内注射を行う手順無菌技術を5％ポビドンヨード滴を適用することによって、皮膚の調製で使用され、目的の薬物の硝子体内注射は、装着シリンジを用いて行われますウィットhaの30 G針。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：3 つの区画に冷凍ウサギの眼球の分離手術用ブレードと絞りを除去しながら、強膜切開後は、房水および硝子体を分離することができます。続いて、網膜/脈絡膜は、眼球の白い外側の層である、強膜から慎重に分離することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 酵素結合免疫3つの区画を表すサンプルにおける眼内の薬物の吸着剤アッセイ（ELISA）。この図は、免疫測定法に使用された96ウェルプレートを示しています。二次抗体とのインキュベーション後、色の変化をウェルに留意されたいです。色の光学濃度は、目的の薬剤の濃度に依存している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 薬物動態学的モデルへの観測データをあてはめ vitrectomizedと非vitrectomized目にベバシズマブの薬物動態を比較した。この実験では、ベバシズマブの実際の硝子体内濃度は、ドットとして提示されています。薬物動態によって駆動される濃度データの近似曲線二行で表されているモデルは、描かれたそのような薬物の半減期などの薬物動態パラメーターの計算に使用されます。エラーバーは95％信頼区間を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足図1：ベバシズマブの検出のために使用されるELISAの標準曲線は、これは、4パラメータロジスティック曲線フィットを生成することができるソフトウェアを使用して取得されます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| 種 | ガラス質の | 房水 | 参照しますレンス |
| マウス | 5.3μlの | 4.4μlの | 22 |
| ラット | 50〜55μlの | 13.6μlの | 22、24 |
| ウサギ | 1.15〜1.7ミリリットル | 350μlの | 23、27、28 |
| モンキー | 3.0〜4.0ミリリットル | 102μlの | 23、26、28 |
| 人間 | 3.0〜5.0ミリリットル | 144から247μlの | 23、20、21、28 |
表1：異なる種 17,22-30 における硝子体と水性ユーモアボリューム 。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zoletil | Virbac Laboratories, Carros Cedex, France | ||
| Xylazine hydrochloride | Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA | ||
| Proparacaine hydrochloride (Alcaine) | Alcon laboratories, Fort Worth, TX | ||
| Phenylephrine hydrochloride and tropicamide | Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan | ||
| Recombinant Human VEGF 165 | R&D systems | 293-VE-050 | |
| Carbobate-Bicarbonate buffer | SIGMA | C3041-50CAP | |
| Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si | Thermo SCIENTIFIC | 167008 | 96 well plate |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) | BOVOGEN | BSA025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml | gibco | 10010-023 | |
| Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-28652 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) | abcam | ab97225 | |
| Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-85183 | |
| CelLytic MT Cell Lysis Reagent | SIGMA | C3228-50ML | lysis buffer |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #15 | |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #10 | |
| Feather surgical blade stainless steel | FEATHER | 11 | |
| 1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34018 | |
| Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34062 | |
| Softmax Pro | Molecular Devices | v.5.4.1 | software for generating standard curve |
| SAAM II | Saam Institute, Seattle, WA | software for pharmacokinetic modeling | |
| Phoenix WinNonlin | Pharsight, Cary, NC | v. 6.3 | software for pharmacokinetic modeling |
| Avastin (bevacizumab) | Genentech |
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