Abstract
sistemik emilimi en aza indirerek ilaç uygulama içi yolu, tedavi edici ilaçlar, yüksek konsantrasyonlarda aktarılmasını sağlar. Çeşitli ilaçlar ön kamaraya ya da vitreus içine uygulanır ve göz içi enjeksiyon çeşitli göz içi hastalıkları tedavi etkili olmuştur. Hayvan diğer memelilere göre kullanımı kolay ve ekonomik bir şekilde Tavşan gözü yaygın oftalmik araştırma için kullanılmıştır ve bir tavşan göz büyüklüğü, insan gözünün benzerdir. 30 G iğne kullanılarak, uyuşturucu tavşan gözlerin intrakamaral ve intravitreal alanlara enjekte edilebilir. gözbebekleri sonra analize kadar dondurulur ve sulu mizah, vitreus ve retina / koroid ayrılabilir. vitröz ve retina / koroid örnekleri homojenize edildi ve analizden önce çözündürülebilir. Daha sonra, bağışıklık her bölme intraoküler ilaç konsantrasyonlarını ölçmek için gerçekleştirilebilir. Uygun farmakokinetik modelleri olabilirBu tür yarı-ömürlere ve maksimum ilaç konsantrasyonu gibi çeşitli parametreler hesaplamak için kullanılır. Tavşan gözü içi ilaçların farmakokinetik çalışmalar için iyi bir model olabilir.
Introduction
Göz içi ilaç dağıtım gelişiyle önce, göz içi hastalıkların tıbbi tedavinin ana endişe ilaç göz içine nüfuz olabilir hangi ile etkinlik oldu. Kan-göz bariyer göz içine yayılmasını, ilaçlar dahil pek çok maddeyi önler. Bu nedenle, terapötik seviyelerin üzerinde olan ilaçların konsantrasyonu kolayca elde edilemez. İlaçların tedavi edici konsantrasyonları göz 4,5 elde edilebilir ve böylece intrakamaral ve intravitreal enjeksiyonlar da dahil olmak üzere göz içi ilaç uygulama yöntemi, can doğrudan kan-göz bariyerini 1-3 atlayabilir.
Buna göre, intravitreal ilaç dağıtım birkaç göziçi hastalıkların 5,6 tedavisinde popüler bir yöntem haline gelmiştir. Örneğin, içi enjeksiyon yaygın yaşla ilgili maküler dejenerasyon, diyabetik retinopati, retinal ven tıkanıklığı ve göz içi enfeksiyonlar 7-10 için gerçekleştirilir. Özellikle, çünküAnti-VEGF ilaç tanıtımı, intravitreal enjeksiyonlar sıklığı oldukça retina hastalıklarının tedavisi için artmıştır. Bu nedenle, tıbbi tedavinin etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için bu ilaçların içi farmakokinetik anlamak önemlidir.
İlaçların içi yönetim küresi içindeki ilaç konsantrasyonunu izleme göz hastalıkları tıbbi tedavide önemli bir atılım olarak kabul edilmesine rağmen, teknik olarak talep ediyor. İnsan gözü, sulu humor (yaklaşık 200 ul) ve camsı (yaklaşık 4.5 mi, Tablo 1), sadece az miktarda için, ilaç konsantrasyonunu ölçmek için, okular akışkan yeterli miktarda elde edilmesi için teknik olarak zordur. Ayrıca, bu tür vitreus dokunarak veya ön kamara parasentez olarak göz sıvısı elde etmek için kullanılan yöntemler, göz dokusuna zarar ve bu tür katarakt endoftalmi, ya da ciddi komplikasyonlara yol açabilirretina dekolmanı 11,12. Bu duruma göre, hayvan modelleri yaygın olarak kullanılan göz içi ilaç 13 farmakokinetik çalışmalarda kullanılmıştır. Bu hayvan modellerinde arasında, tavşan veya maymun en sık kullanılan hayvanlardır.
Aile Leporidae sırayla Lagomorpha küçük memeli tavşan, dünyanın çeşitli yerlerinde bulunmaktadır. tavşan agresif olmadığından, bunlar ele bir deneyde kullanmak ve gözlemlemek kolaydır. Düşük maliyet, insanlara hayvan, benzer göz büyüklüğü hazır durumu ve karşılaştırma iyilik tavşan gözlerini kullanarak farmakokinetik çalışmaları gerçekleştirmek için bilgi büyük bir veritabanı. Bu yazıda, tavşan göziçi ilaçların farmakokinetik çalışmalar için bir protokol tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bizim protokol Bu protokolde yer alan hayvan usul ve hayvan bakım yöntemleri tüm onaylı Seul Ulusal Üniversitesi Bundang Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), kuralları takip eder. IACUC Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (2011) için Kılavuz sekizinci sürümü ile tam bir uyum içindedir. Bütün işlemler hayvanlarda Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği kurallarına bağlılık ile yapıldı. Ayrı ayrı kafeslerde tavşan konut kullanılmıştır. Ek cerrahi veya hazırlık bu deneyi yapmadan önce (yani, sterilizasyon) gerekmeyebilir.
Tavşan Gözlerinde içine İlaç 1. Göz içi enjeksiyon
- tiletamine hidroklorür ve zolazepam bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile 1.5-2 kg ağırlığındaki sağlıklı Yeni Zelanda beyaz tavşanları anestezisihidroklorür (15 mg / kg) ve ksilazin hidroklorür (5 mg / kg). Palpebral (göz kırpma) refleksi izleyerek veya kulak tutam ile anestezi doğrulayın.
NOT: göziçi ilaç göz pigmentleri bağlarsa, bağlanma derecesi ilacın göz farmakokinetik değişiklik neden olabilir. Örneğin, pigmentli tavşan vitröz ve sulu humors bir pigment-bağlama ilacın yarı ömrü yüksek albino tavşanlarda 14 edilene karşılaştırılabilir. insan gözü, insan meslektaşları temsil etmeyebilir pigmentasyon ve albino tavşan gözlerine farklı derecesine sahip olarak, bu durumda, pigmentli tavşan gözlerine elde edilen veriler insan gözü daha benzer ve uygulanabilir. Böylece, ilaç pigment etkileşimini dikkate alarak, pigmentli veya albino tavşan kullanımı dikkatle düşünülmelidir ve sonuçları tavşan suşu (pigmentasyon) ile birlikte yorumlanmalıdır. Ancak, albino tavşan d olarak farmakokinetik özelliklerini karşılaştıran çalışmalarda kullanılmak üzere tavsiye edilirkilim-pigment etkileşim karşılaştırıldığında karıştırıcı faktör olabilir.- % 1 proparacaine hidroklorür oftalmik göz damlaları ile topikal anestezi uygulayın. anestezi kurtarma kadar göz kuruluğu önlemek için veteriner merhemi (% 2 hidroksipropil metil) kullanın.
NOT: anestezi sırasında gözetimsiz tavşan bırakmayın.
- % 1 proparacaine hidroklorür oftalmik göz damlaları ile topikal anestezi uygulayın. anestezi kurtarma kadar göz kuruluğu önlemek için veteriner merhemi (% 2 hidroksipropil metil) kullanın.
- fenilefrin hidroklorid ve tropikamid, bir veya iki damla öğrenci dilate.
- Göz içi enjeksiyon öncesi cerrahi hazırlığı için, bir pamuklu çubukla 5 ile Perioküler cilde% 5-10 povidon-iyot uygulanır. gözün konjonktiva üzerinde% 5-10 povidon-iyot bir damla yerleştirin.
- Aseptik teknikler 5 kullanarak ya intravitreal veya intrakameral göz içi ilaç yönetmek.
NOT: sistemik dolaşımda absorbe ilaç da adam göz nüfuz edebilir. ilaç her iki göze tatbik edildiğinde, bir göz ilaç konsantrasyonu enjekte ilaç etkilenebilirdiğer göz. o kontralateral enjeksiyonun etkisi diğer gözünü nüfuz edemez sistemik dolaşımda ilaç olarak ihmal edilebilir teyit edilirse, göz içi enjeksiyon için iki gözün kullanımı, ekonomik olduğu gibi kabul edilir ve hayvanların sayısı için feda minimize edilebilir farmakokinetik çalışmalar. Göz içi enjeksiyonu takiben sistemik konsantrasyonuna bağlı farmakokinetik çalışma için, sadece bir göz kullanımı uygundur.- Intravitreal enjeksiyonlar için sklera yüzeyi 5 dik bir 30 G iğne ve ya ticari 1 ml şırınga, insülin şırınga veya cam şırıngalar kullanılarak intravitreal 1 mm üst temporal kadranda cerrahi limbusta arkasında ilaç enjekte edilir.
NOT: intrakamaral ve intravitreal enjeksiyon için kullanılan ilacın hacmi soruşturma altında uyuşturucu bağlı olarak değişir. tavşan gözlerini kullanarak anti-VEGF ajanlar farmakokinetik deneyler için, önceki çalışmalarda 0.025, 0.05 (en yaygın) veya 0.1 m kullanılanintrakamaral veya intravitreal enjeksiyon için bevacizumab veya ranibizumabın l. Anti-vasküler endotelyal büyüme faktörü, 0.05 bevacizumab 15 mi, VEGF tuzağı 16 0.025 ranibizumabın ml veya 0,03 ml intraoküler farmakokinetik önceki çalışmalarda kullanılmıştır. Bu 17 desteklemek için çok az kanıt olmasına rağmen parasentez olmadan büyük güvenli hacim, 0.1 ml olduğuna inanılmaktadır. Aşırı ses ya intrakameral veya intravitreal olarak enjekte edilirse, göz içi basıncı önemli ölçüde artmıştır. IIOP beyinde inme benzerdir bozulmuş göz perfüzyon ve santral retinal arter tıkanıklığı, neden aşırı durumlarda doğrudan artmış göz içi basıncı (IIOP) neden optik sinir hasarı, yani glokomatöz optik sinir hasarı, ek olarak. - intrakameral enjeksiyonlar için, yukarı eğim ile korneoskleral limbus aracılığıyla 30 G iğne ekleme ve bunu pa ilerleterek ön kamaraya ilacı enjekteiris veya lens travma riskini en aza indirmek için iris düzlemine rallel.
Not: İlaç formülasyonuna bağlı olarak, daha büyük 30 G kullanılabilir iğneler. Daha büyük ölçek iğne gerektiren durumlar ilaçları içeren mikrosferler, büyük protein ilaçları, ve yüksek viskoziteli formülasyonlar bulunmaktadır. - Enjeksiyondan sonra, yara iyileşmesini sağlamak için steril bir pamuk uçlu aplikatör ile enjeksiyon bölgesini sıkıştırmak.
NOT: Normalde, 30 saniye, 30 G iğne göziçi enjeksiyon için kullanılan yara iyileşmesi için yeterlidir. Daha büyük bir gauge iğne içi enjeksiyon için kullanıldığı takdirde, ancak, daha uzun bir zaman sklerotomi yaradan sızmasını en aza indirmek için sızdırmazlık yara için uygun olacaktır. sklerotomi yara sızıntısı kontrol etmek için daha büyük bir iğne kullanıldığı, özellikle göz içi enjeksiyondan sonra derhal kullanılmalıdır göz içi ilaç miktarı enjekte miktarı aynı olduğundan emin olmak için önemlidir.
- Intravitreal enjeksiyonlar için sklera yüzeyi 5 dik bir 30 G iğne ve ya ticari 1 ml şırınga, insülin şırınga veya cam şırıngalar kullanılarak intravitreal 1 mm üst temporal kadranda cerrahi limbusta arkasında ilaç enjekte edilir.
- günlük tedavi tavşan için gözlemleyinBir hafta ve daha sonra haftada bir kez, şiddetli göz içi iltihabı (konjunktival enjeksiyon ve hipopiyon) herhangi bir işaret için ötenazi kadar.
NOT: enjeksiyondan sonra analjezikler, 30 G iğne ameliyat sonrası ağrı eşlik etmediği bir minimal invaziv bir işlemdir kullanarak göz içi enjeksiyon olarak gerekli değildir. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
2. Numune Hazırlama
- Enükleasyonunu için, göz içi ilaç enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında tavşan (örn., 1 saat ve 1, 2, 5, 9, 14 veya 30 gün önce) euthanize.
Not: Bu zaman noktaları ilgi ilaç ve bilinen farmakokinetik profilleri bağlıdır. Her bir zaman noktası için, en az iki gözleri 13 kullanır. Güvenilir veri kalitesi için, zaman örnekleme ilacın 13 iki yarı-ömürleri en az bir zaman dilimi için dengeli örnekleme ile, özenle en az dört kez noktaları seçilmelidir 18 için, ilk 24 saat içinde en fazla 1 zaman noktası çok önemlidir. Buna göre de, makromoleküller (> 1000 Da) 18, bir numune alma süresi gibi 1 saat karıştırıldı ve 1, 2, 5, 9, 14 ve 30 gün 19 iyi bir seçenek olabilir. Küçük moleküller (≤1,000 Da), 1, 2, 4 ve 8 saat ve 1, 3, ve 7 gün boyunca bir seçenek 20 olabilir. molekül ağırlığına bağlı olarak, numune alma süresi ise değiştirilebilir.- ötenazi için, hızlı bir şekilde tiletamine hidroklorür, zolazepam hidroklorür (15 mg / kg) ve ksilazin hidroklorid (5 mg / kg) karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi tavşan sonra 15% intravenöz KCI 10 mi tatbik.
- bir göz kapağı retraktörü ile palpebral fissür açın. limbus için 360 ° konjunktival kesi 2-3 mm posterior yapın ve c diseksiyon bunu posteriorde uzatmakonjunctiva ve dünyadan Tenon kapsülü.
- dünya onların ekleme yakın ekstraokuler kasları kesti. kavisli bir forseps ile optik siniri Kelepçe ve daha sonra forseps ve dünyanın arasındaki sinir kesti. bozulmamış çevre dokulara bırakarak gözün kendisini kaldırmak. Enükleasyondan sonra, hemen gözbebekleri dondurmak ve -80 ° C'de saklayın.
NOT: Acil donma için iki seçenek söz konusu olabilir. Ilaç konsantrasyonu çok erken aşamada ölçülür (yani. 1 saat daha az), sıvı azot gözün daha iyi zamanında dondurma sağlamak için daha uygun olabilir. Ancak, sonraki dönemlerde, buz hemen gözü soğutmak için kullanılabilir, ve daha sonra derin dondurucu, -80 ° C'de gözleri depolamak için kullanılabilir. - zaman noktalarının tümü için gözbebekleri alındıktan sonra, üç bölmeli, vitreus sulu mizah, ve retina / koroid içine donmuş gözbebekleri ayırın. defros önce bu bölmelerini ayırmakting.
Not: üç bölmeye ayrılması için en önemli nokta prosedürü hızıdır. gözün defrost önce çok hızlı bir şekilde ayrılabilir ve prosedür çözülme geciktirmek için buz üzerinde gerçekleştirilebilir.- dünya açmak için, bir neşter bıçağı ile kornea limbusta (300 ° veya daha fazla) bir kesi yapmak. iris, sulu mizah önünde donmuş bölmesini alın.
- çekerek ve doku forseps kullanarak excoriating dondurulmuş iris ve lensi çıkarın. vitreus erişilebilir hale geldiğinde, geri kalan dokularda (retina / koroid / sklera) ayrılarak dondurulmuş vitrözü edinin.
- Bir No. 15 neşter bıçak kullanarak, arka plandaki skleradan retina / koroid doku ayırın.
- immünoassay sulu mizah örnekleri defrost ve her numunenin hacmini ölçmek. Tüp içeren T bu boş bir tüp ağırlığı çıkartılarak donmuş örneklerin ağırlığı ölçmekO örneği dondurulmuştur.
Not: Dondurulmuş numuneler özgül ağırlığı yaklaşık olarak 1 olduğu, her bir örnek ağırlığı, numunenin hacmi hesaplamak için kullanılabilir. - Camsı örnekleri tartın örnekleri defrost ve gece boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde% 1 sığır serum albümini ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1.0 ml bunları çözünür. Daha sonra, 10 dakika 21 387 x g'de santrifüj örnekleri.
- Homojenizasyon dondurulmuş retina / koroid örnekleri tartın. 1:10 oranında (1 gram doku / reaktif 10 mi) reaktif doku oranında protein ekstraksiyon reaktifi ekleyin. önceden soğutulmuş bir microhomogenizer kullanılarak doku homojenize edilir. 12,000-20,000 x g'de 10 dakika süre ile lize örnek santrifüj ve soğutulmuş EPP tüp süpernatantı aktarın.
3. İmmunoassay
NOT: Birkaç analitik yöntemler protein konsantrasyonu ölçümü için kullanılabilir. d Uygun bir nicel bir yöntem seçinalgılama mesafesine epending. LC-MS / MS, sırasıyla, MRM / PRM modu ile profil için protein nanogram ve pikogram düzeyini algılar ise Kısaca, HPLC seçilmiş iyon izleme modu molekülün pikogram düzeyini algılar. ELİSA'nın tespit limiti pikogram düzeyinde olduğu düşünülmektedir.
- Dolaylı enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) için, bir anti-VEGF maddelerin konsantrasyonlarını ölçmek için, ilgilenilen ilacın tespit ve bilinen ilaç konsantrasyonları standart eğri oluşturmak için 96-yuvalı plakalar içinde ELISA kitleri kullanın.
- camsı, aköz hümör, ve lineer aralığında konsantrasyonlarda 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 büyükbaş hayvan serum albümini ile retina / koroid örnekleri seyreltilir ve tahlil için bu kullanım.
- iyi / 100 ul plaka üzerinde kısma örnekleri bölün. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe ve sonra plaka 0 yıkama çözeltisi 200 ul kullanılarak üç kez yıkayın.1x PBS içinde% 05 Tween20.
Not: ELISA için birincil antikor olarak Örnek eylemlerine, anti-VEGF, bu; Bu nedenle, bir birincil antikor ilave kullanımı gerekli değildir. - 1x PBS içinde 20.000,% 0.1 BSA, ve de her seyreltilmiş çözeltisi 100 ul: 1 sekonder antikoru ile seyreltilir. 4 ° C de bir gece seyreltilmiş sekonder antikor ile kuluçkaya yatırılarak sonra 450 nm dalga boyunda optik yoğunluk ölçülür. Her standart ve numune için yinelenen okuma ortalamasından ortalama sıfır standart optik yoğunluk çıkarın.
- örneğin, SoftMax Pro bir dört parametreli lojistik (4-PL) eğri üretme etkisine sahip bilgisayar yazılımı kullanılarak veri azaltarak bilinen konsantrasyonlarda ilacın çözeltilerinden nispi ışık sinyaline dayalı bir standart eğri oluşturmak. [Fit] - standart bir eğri oluşturmak için, 4-PL eğri [Standart Eğrisi] [4-parametre] tıklayarak elde edilebilir.
- Numuneler fr ilaç konsantrasyonunu hesaplamakstandart eğri om.
Not: Anti-VEGF ilaçların algılama sınırları (LOD) bizim etkileri araştırılmıştır. bevacizumab LOD mi 0,024-3,125 ng / ve aflibercept bu 0,039-10 ng / ml olmuştur.
4. Farmakokinetik Analiz Yöntemleri
NOT: PK analizi için, bir kompartman veya non-kompartman analizini kullanabilirsiniz. kompartman analizde, moleküllerin eğilim davranışı bir denklem (model) ile açıklanabilir. kompartmanlı olmayan modeli görselleştirmek veya diğer doz rejimleri için konsantrasyon-zaman profilleri tahmin edemez ise Böylece, kompartman PK analizi, herhangi bir t anındaki konsantrasyonu tahmin edebilirsiniz. Ancak, kompartman modelleri uydurma karmaşık ve uzun bir süreç olabilir. Buna karşılık, varsayımlar olmayan kompartman modelde daha az kısıtlayıcı bulunmaktadır. kompartmanlı olmayan basit bir uygulama ve bu yarı ömür, temizliği ve dağılım hacmi farmakokinetik parametreleri hesaplamak için yaygın olarak kullanılır.Biz anti-VEGF ajanlar farmakokinetik çalışmalar için bölmeli model seçti.
- Böyle Phoenix WinNonlin'in yazılımı gibi modelleme yazılımı kullanarak bölmeli modelleri ile ilaç konsantrasyon verileri analiz edin.
- [WNL5 klasik modelleme] içinde [PK modeli] tıklayın ve [Ayar] menüsü gözlem süresi, uygulanan doz ve ilaç konsantrasyonu harita.
- [Model seçimi] sekmesinde (örneğin, bölmelerin sayısı) kompartman modeli seçin ve model parametreleri hesaplamak için [Yürütme] düğmesine tıklayın.
- (. Örneğin, standart hata) (1) Akaike Bilgi Kriteri, (2) parametre tahminlerinin hassasiyet, ve (3) grafik analizi: analizler sonucunda, en iyi aşağıdaki kriterlere dayalı ilaç konsantrasyon verileri tanımlayan son bölme modelini seçin (örn., uyum araziler iyiliği).
- Bu tür zaman konsantrasyonları altında yarılanma ömrü (T 1/2) ve alanı olarak ilgi farmakokinetik parametrelerini hesaplamakkompartman modeli ile tahrik model parametreleri ve denklemlerden yon eğrisi (AUC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steril teknikleri ile Tavşan gözlerinde bir ilgi ilacın intravitreal enjeksiyonlar yapmak için kullanılan prosedür Şekil 1'de gösterilmiştir. Işlenmiş gözler planlanmış bir zamanda çıkartılmış ve -80 ° C'de saklanır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, analiz üç bölmeli, sulu salgı, vitröz, ve retina / koroid için, dondurulmuş tavşan gözler ayrılır. Bölmeleri numuneleri ELISA için hazırlanır. Bir ikincil antikor ile inkübe edildikten sonra, optik yoğunluk intravitreal enjeksiyondan sonra çoklu zaman noktalarında toplandı, üç bölmeli standart eğri için ilgi ve örnek, bilinen ilaç konsantrasyonları ihtiva eden bir 96-çukurlu plaka içinde ölçülür (Şekil 3). Standart eğri (Ek Şekil 1) için hesaplanan konsantrasyon verileri pharmacokine takılabilirtlc modeli ve farmakokinetik parametreler ile donatılmış hat (Şekil 4) ile belirlenebilir. Şekil 4'te, farmakokinetiği intravital Bevacizumab Vitrektomi olmayan PPV ameliyatı gözü değerlendirildi ve karşılaştırıldı. Kompartman PK analizi PK davranışlarını açıklamak için aşağıdaki denklemi sağlanan gerçekleştirildi.
(- 2 t k) - C (t) = C 1 exp (1 t k) + C '2 exp
C (ug / ml): bir zaman t (saat) konsantrasyon
C1, C2: Dağıtım ve eliminasyon fazı arka ekstrapole yakaladığını
th hızı sabitleri: 1 k, 2 kE dağıtım ve eliminasyon fazı
Şekil 4'te gösterildiği gibi, uygun modelin göre hesaplanan konsantrasyonu ölçülen gerçek değerlere oldukça iyi eşleşti. Böyle ve vitrektomi olmadan arasındaki yarı ömrü olarak bevacizumab ve farmakokinetik parametrelerin vitreus konsantrasyonunda anlamlı bir fark yoktu. Bu deney bevacizumab dağıtım ve temizlenmesi vitreus rolü önemsiz olduğunu göstermektedir.
Şekil 1:. Anestezi Altında Tavşan Eye Göz İçi Uyuşturucu intravitreal Enjeksiyonları Sahne Prosedür% 5 povidon-iyot damla uygulayarak ve cilt hazırlığı ve ilgi ilacın intravitreal enjeksiyon yoluyla kullanılan aseptik teknikler takılmış bir şırınga kullanılarak yapılır zekâha 30 G iğne. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Üç Kompartmanlarda içine Dondurulmuş Tavşan gözün ayrılması bir cerrahi bıçak ve iris kaldırılması ile skleral kesi sonrasında sulu mizah ve vitreus ayrılabilir. Daha sonra, retina / koroid gözün beyaz dış tabakası olan sklera, dikkatlice ayrılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Enzim-bağlı İmmünoüç bölmeden temsil Samples göz içi ilaç sorbent deneyi (ELISA). Bu rakam, bağışıklık için kullanılan 96-çukurlu bir plaka gösterir. Bir ikincil antikor ile inkübe edildikten sonra, renk değişimi kuyu not edilir. Rengin optik yoğunluk ilgi ilacın konsantrasyonuna bağlıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Farmakokinetik Model Gözlenen veri takılması vitrektomize ve non-vitrektomize gözünde bevacizumab farmakokinetiğini karşılaştıran Bu deneyde, bevacizumab gerçek intravitreal konsantrasyon noktalar olarak sunulmuştur. Farmakokinetik tarafından tahrik edilmektedir konsantrasyon verileri için monte eğrileriiki hat ile temsil edilen modeli, çekilir ve bu ilacın yarı ömrü gibi farmakokinetik parametrelerin hesaplanması için kullanılır. Hata çubukları% 95 güven aralıkları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1:. Bevacizumab Tespiti için Kullanılan ELISA Standart Eğrisi Bu dört parametreli lojistik eğri uyum üretme kapasitesine sahip bir yazılım kullanılarak elde edilir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
| tür | cam | Sulu şaka | başvurmakence |
| Fare | 5.3 ul | 4.4 ul | 22 |
| Sıçan | 50-55 ul | 13.6 ul | 22, 24 |
| Tavşan | 1,15-1,7 mi | 350 ul | 23, 27, 28 |
| Maymun | 3,0-4,0 ml | 102 ul | 23, 26, 28 |
| İnsan | 3.0-5.0 mi | 144-247 ul | 23, 20, 21, 28 |
Tablo 1: Farklı Türlerin 17,22-30 yılında Vitreus ve Sulu Mizah Hacmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zoletil | Virbac Laboratories, Carros Cedex, France | ||
| Xylazine hydrochloride | Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA | ||
| Proparacaine hydrochloride (Alcaine) | Alcon laboratories, Fort Worth, TX | ||
| Phenylephrine hydrochloride and tropicamide | Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan | ||
| Recombinant Human VEGF 165 | R&D systems | 293-VE-050 | |
| Carbobate-Bicarbonate buffer | SIGMA | C3041-50CAP | |
| Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si | Thermo SCIENTIFIC | 167008 | 96 well plate |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) | BOVOGEN | BSA025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml | gibco | 10010-023 | |
| Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-28652 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) | abcam | ab97225 | |
| Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-85183 | |
| CelLytic MT Cell Lysis Reagent | SIGMA | C3228-50ML | lysis buffer |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #15 | |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #10 | |
| Feather surgical blade stainless steel | FEATHER | 11 | |
| 1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34018 | |
| Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34062 | |
| Softmax Pro | Molecular Devices | v.5.4.1 | software for generating standard curve |
| SAAM II | Saam Institute, Seattle, WA | software for pharmacokinetic modeling | |
| Phoenix WinNonlin | Pharsight, Cary, NC | v. 6.3 | software for pharmacokinetic modeling |
| Avastin (bevacizumab) | Genentech |
References
- Urtti, A. Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 58, 1131-1135 (2006).
- Geroski, D. H., Edelhauser, H. F. Drug delivery for posterior segment eye disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 961-964 (2000).
- Ghate, D., Edelhauser, H. F. Ocular drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 3, 275-287 (2006).
- Del Amo, M. E., Urtti, A. Current and future ophthalmic drug delivery systems. A shift to the posterior segment. Drug Discov Today. 13, 135-143 (2008).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal injection technique and monitoring: updated guidelines of an expert panel. Retina. 34, Suppl 12. S1-S18 (2014).
- Kim, Y. C., Chiang, B., Wu, X., Prausnitz, M. R. Ocular delivery of macromolecules. J Control Release. 190, 172-181 (2014).
- Group, C. R., et al. Ranibizumab and bevacizumab for neovascular age-related macular degeneration. N Engl J Med. 364, 1897-1908 (2011).
- Campochiaro, P. A., et al. Sustained benefits from ranibizumab for macular edema following central retinal vein occlusion: twelve-month outcomes of a phase III study. Ophthalmology. 118, 2041-2049 (2011).
- Brown, D. M., et al. Ranibizumab for macular edema following central retinal vein occlusion: six-month primary end point results of a phase III study. Ophthalmology. 117, 1124-1133 (2010).
- Diabetic Retinopathy Clinical Research Network. Aflibercept, bevacizumab, or ranibizumab for diabetic macular edema. N Engl J Med. 372, 1193-1203 (2015).
- McCannel, C. A. Meta-analysis of endophthalmitis after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor agents: causative organisms and possible prevention strategies. Retina. 31, 654-661 (2011).
- Meyer, C. H., et al. Incidence of rhegmatogenous retinal detachments after intravitreal antivascular endothelial factor injections. Acta Ophthalmol. 89, 70-75 (2011).
- Del Amo, E. M., Urtti, A. Rabbit as an animal model for intravitreal pharmacokinetics: Clinical predictability and quality of the published data. Exp Eye Res. 137, 111-124 (2015).
- Hughes, P. M., Krishnamoorthy, R., Mitra, A. K. Vitreous disposition of two acycloguanosine antivirals in the albino and pigmented rabbit models: a novel ocular microdialysis technique. J Ocul Pharmacol Ther. 12, 209-224 (1996).
- Ahn, J., et al. Pharmacokinetics of Intravitreally Injected Bevacizumab in Vitrectomized Eyes. J Ocul Pharmacol Ther. , (2013).
- Park, S. J., et al. Intraocular pharmacokinetics of intravitreal vascular endothelial growth factor-Trap in a rabbit model. Eye (Lond). 29, 561-568 (2015).
- Jager, R. D., Aiello, L. P., Patel, S. C., Cunningham, E. T. Risks of intravitreous injection: a comprehensive review. Retina. 24, 676-698 (2004).
- Durairaj, C., Shah, J. C., Senapati, S., Kompella, U. B. Prediction of vitreal half-life based on drug physicochemical properties: quantitative structure-pharmacokinetic relationships (QSPKR). Pharm Res. 26, 1236-1260 (2009).
- Ahn, S. J., et al. Intraocular pharmacokinetics of ranibizumab in vitrectomized versus nonvitrectomized eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 567-573 (2014).
- Mochizuki, K., et al. Intraocular kinetics of ceftazidime (Modacin). Ophthalmic Res. 24, 150-154 (1992).
- Bakri, S. J., et al. Pharmacokinetics of intravitreal ranibizumab (Lucentis). Ophthalmology. 114, 2179-2182 (2007).
- Kondo, T., Miura, M., Imamichi, M. Measurement method of the anterior chamber volume by image analysis. Br J Ophthalmol. 70, 668-672 (1986).
- Toris, C. B., Yablonski, M. E., Wang, Y. L., Camras, C. B. Aqueous humor dynamics in the aging human eye. Am J Ophthalmol. 127, 407-412 (1999).
- Remtulla, S., Hallett, P. E. A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat. Vision Res. 25, 21-31 (1985).
- Barza, M. Animal models in evaluation of chemotherapy of ocular infections. Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy. Zak, O., Sande, M. A. , Harcourt Brace Jovanovich. 187-211 (1986).
- Hughes, A. A schematic eye for the rat. Vision Res. 19, 569-588 (1979).
- Maurice, D. M., Mishima, S. Ocular pharmacokinetics. 69, Springer Verlag. (1984).
- Greenbaum, S., Lee, P. Y., Howard-Williams, J., Podos, S. M. The optically determined corneal and anterior chamber volumes of the cynomolgus monkey. Curr Eye Res. 4, 187-190 (1985).
- Ruby, A. J., Williams, G. A., Blumenkranz, M. S. Vitreous humor. Foundations of Clinical Ophthalmology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Jaffe, G. J., Ashton, P., Andrew, P. Intraocular Drug Delivery. , Taylor & Francis. (2006).
- Iyer, M. N., et al. Clearance of intravitreal moxifloxacin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 317-319 (2006).
- Fauser, S., et al. Pharmacokinetics and safety of intravitreally delivered etanercept. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 242, 582-586 (2004).
- Scholes, G. N., O'Brien, W. J., Abrams, G. W., Kubicek, M. F. Clearance of triamcinolone from vitreous. Arch Ophthalmol. 103, 1567-1569 (1985).
- Stastna, M., Behrens, A., McDonnell, P. J., Van Eyk, J. E. Analysis of protein composition of rabbit aqueous humor following two different cataract surgery incision procedures using 2-DE and LC-MS/MS. Proteome Sci. 9, 8 (2011).
- Sinapis, C. I., et al. Pharmacokinetics of intravitreal bevacizumab (Avastin(R)) in rabbits. Clin Ophthalmol. 5, 697-704 (2011).
- Gaudreault, J., Fei, D., Rusit, J., Suboc, P., Shiu, V. Preclinical pharmacokinetics of Ranibizumab (rhuFabV2) after a single intravitreal administration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 726-733 (2005).
- Maurice, D. Review: practical issues in intravitreal drug delivery. J Ocul Pharmacol Ther. 17, 393-401 (2001).
- Laude, A., et al. Intravitreal therapy for neovascular age-related macular degeneration and inter-individual variations in vitreous pharmacokinetics. Prog Retin Eye Res. 29, 466-475 (2010).
- Christoforidis, J. B., Carlton, M. M., Knopp, M. V., Hinkle, G. H. PET/CT imaging of I-124-radiolabeled bevacizumab and ranibizumab after intravitreal injection in a rabbit model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 5899-5903 (2011).
- Sangwan, V. S., Pearson, P. A., Paul, H., Comstock, T. L. Use of the Fluocinolone Acetonide Intravitreal Implant for the Treatment of Noninfectious Posterior Uveitis: 3-Year Results of a Randomized Clinical Trial in a Predominantly Asian Population. Ophthalmol Ther. 4, 1-19 (2015).
- Bajwa, A., Aziz, K., Foster, C. S. Safety and efficacy of fluocinolone acetonide intravitreal implant (0.59 mg) in birdshot retinochoroidopathy. Retina. 34, 2259-2268 (2014).
- Sanford, M. Fluocinolone acetonide intravitreal implant (Iluvien(R)): in diabetic macular oedema. Drugs. 73, 187-193 (2013).
- Haller, J. A., et al. Dexamethasone intravitreal implant in patients with macular edema related to branch or central retinal vein occlusion twelve-month study results. Ophthalmology. 118, 2453-2460 (2011).
- Boyer, D. S., et al. Three-year, randomized, sham-controlled trial of dexamethasone intravitreal implant in patients with diabetic macular edema. Ophthalmology. 121, 1904-1914 (2014).
- Patel, S. R., et al. Targeted administration into the suprachoroidal space using a microneedle for drug delivery to the posterior segment of the eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4433-4441 (2012).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3, 1377-1397 (2011).
