Abstract
La via di somministrazione del farmaco intraoculare permette la fornitura di elevate concentrazioni di farmaci terapeutici, riducendo al minimo l'assorbimento sistemico. Diversi farmaci vengono somministrati nella camera anteriore o vitreo, e l'iniezione intraoculare è stata efficace nel curare varie malattie intraoculari. occhi coniglio sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca oftalmica, l'animale è maneggevole ed economico rispetto ad altri mammiferi, e la dimensione di un occhio di coniglio è simile a quella di un occhio umano. Usando un ago G 30, i farmaci possono essere iniettati negli spazi intracameral e intravitreale di occhi di coniglio. I bulbi oculari sono poi congelati fino al momento dell'analisi, e possono essere suddivisi in l'umore acqueo, vitreo, retina e / coroide. I campioni vitreo e la retina / coroide possono essere omogeneizzati e solubilizzati prima dell'analisi. Poi, immunodosaggi possono essere eseguite per misurare le concentrazioni dei farmaci intraoculari in ciascun compartimento. modelli farmacocinetici appropriati possono essereutilizzato per calcolare diversi parametri, come l'emivita e concentrazione massima del farmaco. occhi coniglio può essere un buon modello per gli studi di farmacocinetica dei farmaci intraoculari.
Introduction
Prima dell'avvento di consegna della droga intraoculare, la preoccupazione principale della terapia medica per le malattie intraoculari è stata l'efficienza con la quale il farmaco poteva penetrare nell'occhio. La barriera emato-oculare previene molte sostanze, compresi i farmaci, dalla diffusione nell'occhio. Pertanto, le concentrazioni di farmaci che sono superiori ai livelli terapeutici possono non essere ottenuti facilmente. Il metodo di somministrazione dei farmaci intraoculare, tra cui intracameral e intravitreali iniezioni, può escludere direttamente la barriera emato-oculare 1-3, in modo che le concentrazioni terapeutiche di farmaci possono essere raggiunti negli occhi 4,5.
Di conseguenza, intravitreale consegna della droga è diventato un metodo popolare di trattamento per diverse malattie intraoculari 5,6. Ad esempio, l'iniezione intravitreale è ampiamente eseguita per la degenerazione maculare senile, la retinopatia diabetica, occlusioni venose retiniche, e le infezioni intraoculari 7-10. In particolare, poichél'introduzione di farmaci anti-VEGF, la frequenza delle iniezioni intravitreali è notevolmente aumentato per il trattamento delle patologie retiniche. Pertanto, è importante capire la farmacocinetica intraoculari di tali farmaci per valutare l'efficacia e la sicurezza della terapia medica.
Sebbene l'amministrazione intraoculare di farmaci è considerato un importante passo avanti nella terapia medica per le malattie oculari, il monitoraggio della concentrazione del farmaco all'interno del bulbo oculare è tecnicamente impegnativo. Poiché occhi umani contengono soltanto piccole quantità di umor acqueo (circa 200 ml) e vetrose (circa 4,5 ml, Tabella 1), è tecnicamente difficile ottenere una quantità sufficiente di fluido oculare per misurare la concentrazione di farmaco. Inoltre, i metodi che vengono utilizzati per ottenere il fluido oculare, come intercettazioni vitreo o paracentesi della camera anteriore, possono danneggiare il tessuto oculare e determinare gravi complicazioni, come la cataratta, endoftalmite, odistacco della retina 11,12. Di conseguenza, i modelli animali sono utilizzati in studi di farmacocinetica di farmaci comunemente usati intraoculari 13. Tra questi modelli animali, conigli e scimmie sono gli animali più frequentemente utilizzati.
Conigli, che sono piccoli mammiferi dell'ordine Lagomorpha nella famiglia dei leporidi, si trovano in varie parti del mondo. Dato che i conigli non sono aggressivi, sono facili da gestire, utilizzare in un esperimento, e osservare. Riduzione dei costi, pronta disponibilità dell'animale, simile dimensione occhio agli esseri umani, e un ampio database di informazioni per il confronto favore l'esecuzione di studi di farmacocinetica utilizzando gli occhi di coniglio. In questo lavoro, un protocollo per gli studi di farmacocinetica dei farmaci intraoculari negli occhi di coniglio viene descritta.
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Protocol
Il nostro protocollo segue le linee guida della cura istituzionale degli animali e utilizzo Comitato (IACUC) di Seoul National University Hospital Bundang, che ha approvato tutte le procedure animali e metodi di cura degli animali presentati in questo protocollo. Il IACUC è in piena conformità con l'ottava edizione della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (2011). Tutte le procedure sono state eseguite con l'aderenza alle linee guida dell'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology Dichiarazione per l'uso di animali in oftalmica e Vision Research negli animali. gabbie individuali sono stati utilizzati per alloggiare i conigli. Un ulteriore intervento chirurgico o la preparazione prima di effettuare questo esperimento (per esempio, la sterilizzazione) potrebbe non essere necessaria.
1. iniezione intraoculare del farmaco nel coniglio Occhi
- Anestetizzare sani conigli bianchi New Zealand del peso di 1,5-2 kg con una iniezione intramuscolare di una miscela di cloridrato tiletamina e zolazepamcloridrato (15 mg / kg) e xilazina cloridrato (5 mg / kg). Verificare l'anestesia monitorando la palpebrale (lampeggio) reflex o con pizzico orecchio.
NOTA: se un farmaco intraoculare si lega ai pigmenti oculari, il grado di legame potrebbe indurre la modifica della farmacocinetica oculari del farmaco. Per esempio, l'emivita di un farmaco pigmento vincolante umori vetrose e acquose di conigli pigmentati può essere aumentata rispetto a quella nei conigli albini 14. In questo caso, i dati ottenuti da occhi dei conigli pigmentati può essere più simili e applicabile agli occhi umani occhi umani hanno un diverso grado di pigmentazione e coniglio albino occhi non può rappresentare controparti umane. Pertanto, considerando interazioni farmaco-pigmento, l'uso di conigli pigmentati o albini deve essere attentamente valutata ei risultati devono essere interpretati insieme con il ceppo (pigmentazione) di coniglio. Tuttavia, conigli albini sono raccomandati per l'uso in studi di confronto tra proprietà farmacocinetiche come il dinterazione tappeto-pigmento può essere un fattore confondente nel confronto.- Applicare un anestetico locale con 1% proparacaina cloridrato collirio oftalmico. Utilizzare veterinario pomata (2% idrossipropilmetilcellulosa) per prevenire la secchezza oculare fino al recupero dall'anestesia.
NOTA: Non lasciare mai il coniglio incustodito mentre anestetizzato.
- Applicare un anestetico locale con 1% proparacaina cloridrato collirio oftalmico. Utilizzare veterinario pomata (2% idrossipropilmetilcellulosa) per prevenire la secchezza oculare fino al recupero dall'anestesia.
- Dilatare la pupilla con una o due gocce di fenilefrina cloridrato e tropicamide.
- Per la preparazione chirurgica prima dell'iniezione intraoculare, applicare il 5-10% iodopovidone alla pelle perioculare con un batuffolo di cotone 5. Mettere una goccia di 5-10% iodopovidone sulla congiuntiva dell'occhio.
- Somministrare farmaci intraoculari sia per via intravitreale o intracamerally utilizzando tecniche asettiche 5.
NOTA: Il farmaco assorbita nella circolazione sistemica può anche penetrare l'altro occhio. Quando un farmaco viene somministrato in entrambi gli occhi, la concentrazione di farmaco in un occhio può essere influenzata da farmaco iniettatol'altro occhio. Se è confermato che l'effetto dell'iniezione controlaterale può essere trascurato come farmaco nella circolazione sistemica non può penetrare l'altro occhio, l'uso di entrambi gli occhi per iniezioni intraoculari può essere considerato, in quanto è economico e minimizza il numero di animali sacrificati per gli studi di farmacocinetica. Per studio farmacocinetico sulla concentrazione sistemica dopo l'iniezione intraoculare, l'uso di un solo occhio è appropriato.- Per le iniezioni intravitreali, iniettare il farmaco per via intravitreale 1 millimetro dietro limbus chirurgica nel quadrante superotemporal utilizzando un ago G 30 e sia commerciali 1 ml siringhe, siringhe da insulina o siringhe di vetro perpendicolarmente alla superficie sclerale 5.
NOTA: Il volume di farmaco usato per l'iniezione intravitreale intracameral e varia a seconda dei farmaci oggetto di indagine. Per gli esperimenti di farmacocinetica su agenti anti-VEGF con gli occhi di coniglio, studi precedenti usati 0,025, 0,05 (più comune), o 0,1 ml di bevacizumab o ranibizumab per l'iniezione intravitreale intracameral o. Nei nostri precedenti studi sulla farmacocinetica intraoculari di anti-fattore di crescita vascolare endoteliale, 0,05 ml di bevacizumab 15, 0,025 ml di ranibizumab, o 0,03 ml di VEGF-Trap 16 sono stati utilizzati. Il maggior volume sicuro senza paracentesi si crede di essere 0,1 ml, anche se c'è stata poca prova a sostegno di questa 17. Se il volume eccessivo viene iniettato sia intracamerally o per via intravitreale, pressione intraoculare è notevolmente aumentato. Oltre al danno del nervo ottico direttamente causata da un aumento della pressione intraoculare (IIOP), vale a dire glaucomatosa ottico danni ai nervi, in casi estremi, la IIOP porta a perfusione oculare alterata e occlusione dell'arteria centrale della retina, che è analoga a ictus nel cervello. - Per le iniezioni intracameral, iniettare il farmaco nella camera anteriore inserendo un ago G 30 attraverso il limbus corneosclerale con lo smusso e farlo avanzare parallel al piano del diaframma per minimizzare il rischio di traumi all'iride o lenti.
NOTA: A seconda della formulazione di droga, aghi superiore a 30 G può essere utilizzato. Le condizioni che richiedono ago più grande calibro comprendono microsfere farmaci contenenti, farmaci su larga proteine, e formulazioni ad alta viscosità. - Dopo l'iniezione, comprimere il sito di iniezione con un applicatore a sterili di cotone punta a promuovere la guarigione delle ferite.
NOTA: normalmente, 30 sec è sufficiente per la guarigione della ferita, quando un ago da 30 G è utilizzato per l'iniezione intraoculare. Tuttavia, se un ago calibro maggiore viene utilizzato per l'iniezione intraoculare, tempo più lungo sarebbe appropriato per ferita sigillare per minimizzare le perdite dalla ferita sclerotomie. Per controllare eventuali perdite sclerotomie ferita è importante garantire che la quantità di farmaco intraoculare utilizzato immediatamente dopo l'iniezione intraoculare è la stessa della quantità iniettata, soprattutto se si utilizza un ago calibro grande.
- Per le iniezioni intravitreali, iniettare il farmaco per via intravitreale 1 millimetro dietro limbus chirurgica nel quadrante superotemporal utilizzando un ago G 30 e sia commerciali 1 ml siringhe, siringhe da insulina o siringhe di vetro perpendicolarmente alla superficie sclerale 5.
- Osservare i conigli trattati giornalmente peruna settimana, e una volta alla settimana dopo, per qualsiasi segno di grave infiammazione intraoculare (iniezione congiuntivale e hypopyon) fino eutanasia.
NOTA: Gli analgesici dopo l'iniezione, non sono richiesti iniezione intraoculare usando un ago G 30 è una procedura minimamente invasiva che non sia accompagnato da dolore post-operatorio. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia degli altri animali fino alla completa guarigione.
Preparazione 2. campione
- Per enucleazione, eutanasia i conigli in vari momenti (ad es., 1 ora o 1, 2, 5, 9, 14 o 30 giorni) dopo l'iniezione di droga intraoculare.
NOTA: Questi punti di tempo dipendono dal farmaco di interesse e dei profili farmacocinetici noti. Per ogni punto di tempo, utilizzare almeno due bulbi oculari 13. Per la qualità dei dati affidabili, il tempo di campionamento dovrebbe essere scelto con cura, almeno quattro punti temporali con campionamento equilibrato per almeno un arco di tempo di due emivita del farmaco 13 18, in particolare, più di 1 ora-punto durante il primo 24 ore è cruciale. Pertanto, per le macromolecole (> 1.000 Da) 18, un periodo di campionamento come 1 ora e 1, 2, 5, 9, 14, e 30 giorni 19 può essere una buona opzione. Per piccole molecole (≤1,000 Da), 1, 2, 4, e 8 ore e 1, 3 e 7 giorni può essere una opzione 20. A seconda del peso molecolare, il periodo di campionamento può essere ulteriormente modificato.- Per eutanasia, somministrare 10 ml di 15% KCl endovenosa rapidamente dopo anestetizzare conigli con una iniezione intramuscolare di una miscela di tiletamina cloridrato, zolazepam cloridrato (15 mg / kg) e xilazina cloridrato (5 mg / kg).
- Aprire la rima palpebrale con un divaricatore delle palpebre. Fare un 360 ° congiuntivale un'incisione di 2-3 mm posteriormente al limbus ed estenderlo posteriormente sezionando il conjunctiva e capsula di Tenon dal globo.
- Tagliare i muscoli estrinseci vicino al loro inserimento nel mondo. Bloccare il nervo ottico con pinze curve e poi tagliare il nervo fra le pinze e il globo. Rimuovere il bulbo oculare stesso, lasciando intatti i tessuti circostanti. Dopo l'enucleazione, congelare immediatamente i bulbi oculari e conservarli a -80 ° C.
NOTA: Ci possono essere due opzioni per il congelamento immediato. Se la concentrazione di farmaco è misurata ad una fase molto precoce (es. Meno di 1 ora), azoto liquido può essere più appropriato per garantire una migliore tempestiva congelamento del bulbo oculare. Tuttavia, per i periodi successivi, il ghiaccio può essere utilizzata per raffreddare immediatamente bulbo oculare, e quindi congelatore può essere utilizzata per memorizzare i bulbi oculari a -80 ° C. - Dopo aver ottenuto i bulbi oculari per tutti i punti di tempo, separare gli occhi congelati in tre scomparti, il vitreo, l'umore acqueo, e la retina / coroide. Separare questi compartimenti prima defrosTing.
NOTA: Il punto più importante per la separazione in tre scomparti è la velocità della procedura. Il bulbo oculare deve essere separato molto rapidamente prima sbrinamento e la procedura può essere eseguita sul ghiaccio per ritardare scongelamento.- Per aprire il mondo, fare un'incisione al limbus corneale (300 ° o superiore) con una lama di bisturi. Ottenere vano congelati davanti dell'iride, l'umore acqueo.
- Rimuovere l'iride surgelati e lenti tirando e condannando con pinze dei tessuti. Quando il corpo vitreo diventa accessibile, ottenere il vitreo congelato separandola dai tessuti rimanenti (retina / coroide / sclera).
- Utilizzando una lama di bisturi n ° 15, separare il tessuto della retina / coroide dalla sclera sottostante.
- Per saggi immunologici, scongelare i campioni acquosi umorismo, e misurare il volume di ogni campione. Misurare il peso dei campioni congelati sottraendo il peso di un tubo vuoto da quello del tubo contenente tha congelato campione.
NOTA: Poiché il peso specifico dei campioni congelati è di circa 1, il peso di ciascun campione può essere utilizzato per calcolare il volume del campione. - Pesare i campioni vetrosi, scongelare i campioni, e solubilizzare in 1,0 ml di soluzione salina tamponata con fosfato contenente 1% di albumina bovina serica su un rotatore notte a 4 ° C. Poi, centrifugare i campioni a 387 g per 10 min 21.
- Pesare i campioni congelati retina / coroide per omogeneizzazione. Aggiungere proteina reagente estrazione con un rapporto di tessuto al reagente di 1:10 (1 g di tessuto / 10 ml di reagente). Omogeneizzare il tessuto utilizzando un microhomogenizer pre-raffreddata. Centrifugare il campione lisato per 10 minuti a 12,000-20,000 xg e trasferire il surnatante in una provetta da EPP refrigerata.
3. Immunoassay
NOTA: Diversi metodi analitici possono essere utilizzati per la misurazione della concentrazione proteica. Scegliere un metodo quantitativo adeguato, depending sul campo di rilevamento. In breve, la modalità di monitoraggio ionico selezionato di HPLC in grado di rilevare i livelli di picogrammi di molecola, mentre LC-MS / MS in grado di rilevare nanogrammi e picogrammi livelli di proteina per la profilatura con modalità MRM / PRM, rispettivamente. Il limite di rilevazione ELISA è considerato a livello picogrammi.
- Per i indiretti enzyme-linked test di immunoassorbimento (ELISA) per misurare le concentrazioni di agenti anti-VEGF, utilizzare i kit ELISA in 96 pozzetti per rilevare il farmaco di interesse e di generare una curva standard di concentrazioni farmaco noto.
- Diluire il, l'umore acqueo vitreo, ed i campioni / coroide retina con 0,1% di albumina sierica bovina in 1x PBS (PBS) a concentrazioni che si trovano all'interno della gamma lineare, e utilizzare questi per il test.
- Dividere i campioni in aliquote sulla piastra a 100 microlitri / pozzetto. Incubare per una notte a 4 ° C e poi lavare la piastra tre volte con 200 microlitri della soluzione di lavaggio da 0.05% Tween20 in 1x PBS.
NOTA: L'anti-VEGF presenti negli atti campione come anticorpo primario per ELISA; Pertanto, l'uso aggiuntivo di un anticorpo primario non è necessario. - Diluire l'anticorpo secondario di 1: 20.000 in 0,1% di BSA in PBS 1x, e aggiungere 100 microlitri della-soluzione diluita per pozzetto. Dopo incubazione la piastra con un anticorpo secondario diluito notte a 4 ° C, misurare la densità ottica a 450 nm. Sottrarre la densità media pari a zero ottica standard dalla media delle letture duplicati per ogni standard e campione.
- Creare una curva standard basato sul segnale luminoso relativa da soluzioni del farmaco con concentrazioni note riducendo i dati utilizzando software per computer in grado di generare un quattro parametri logistica (4-PL) misura della curva, come SoftMax Pro. Per la creazione di una curva standard, la curva di adattamento a 4 PL può essere ottenuto cliccando su [4 parametri] in [Curva Standard] - [Fit].
- Calcolare la concentrazione del farmaco nei campioni from la curva standard.
NOTA: I limiti di rilevamento (LOD) di farmaci anti-VEGF sono stati studiati nel nostro esperimento. Il LOD di bevacizumab è stato 0,024-3,125 ng / ml e quella di aflibercept era 0.039-10 ng / ml.
4. farmacocinetiche Metodi di analisi
NOTA: Per l'analisi PK, si può utilizzare sia compartimentale o l'analisi non compartimentale. In analisi compartimentale, comportamento disposizione delle molecole può essere spiegato da un'equazione (modello). Così, l'analisi PK compartimentale in grado di prevedere la concentrazione in qualsiasi momento t mentre il modello non compartimentale non è in grado di visualizzare o prevedere profili di concentrazione in tempo per gli altri regimi di dosaggio. Tuttavia, il montaggio di modelli compartimentali può essere un processo lungo e complesso. Al contrario, le ipotesi sono meno restrittive nel modello non compartimentale. Il metodo non compartimentale è semplice e comunemente utilizzati per il calcolo dei parametri farmacocinetici quali l'emivita, la clearance e volume di distribuzione.Abbiamo scelto modelli compartimentali per gli studi di farmacocinetica su agenti anti-VEGF.
- Analizzare i dati di concentrazione di droga con i modelli compartimentali utilizzando software di modellazione, come il software Phoenix WinNonlin.
- Fare clic su [modello PK] in [modellazione WNL5 classico] e mappare il tempo di osservazione, dose somministrata, e la concentrazione di droga nel menu [Setup].
- Selezionare il modello compartimentale (ad esempio, il numero di vani) nella scheda [selezione del modello], e fare clic sul pulsante [Execution] per calcolare i parametri del modello.
- Dopo le analisi, selezionare il modello del vano finale che meglio descrive i dati di concentrazione di droga sulla base dei seguenti criteri: (es., Errore standard) (1) Akaike criterio di informazione, (2) la precisione delle stime dei parametri, e (3) l'analisi grafica (ad es., la bontà di trame fit).
- Calcolare i parametri farmacocinetici di interesse, come il tempo di dimezzamento (T 1/2) e l'area sotto il tempo-concentrazionecurva di (AUC), dai parametri del modello e le equazioni guidati dal modello compartimentale.
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Representative Results
La procedura utilizzata per effettuare iniezioni intravitreali di un farmaco di interesse in occhi di coniglio con tecniche sterili è mostrato in Figura 1. Gli occhi trattati sono enucleati in un momento programmato e conservati a -80 ° C. Per l'analisi, tre scomparti, l'umore acqueo, il vitreo e la retina / coroide, vengono separati dagli occhi coniglio congelati, come mostrato nella Figura 2. I campioni dei compartimenti sono preparati per l'ELISA. Dopo l'incubazione con un anticorpo secondario, densità ottica è misurata in una piastra a 96 pozzetti, contenente concentrazioni note del farmaco di interesse per la curva standard e campioni dai tre compartimenti che sono stati raccolti in più punti di tempo dopo l'iniezione intravitreale (Figura 3). I dati di concentrazione che viene calcolata dalla curva standard (figura complementare 1) può essere montato sul pharmacokinemodello di tic, ei parametri farmacocinetici possono essere determinati dalla linea montato (Figura 4). Nella Figura 4, per via intravitreale farmacocinetica del bevacizumab in iniettato vitrectomized e gli occhi non vitrectomized sono stati valutati e confrontati. L'analisi farmacocinetica compartimentale è stata eseguita, che ha fornito la seguente equazione per spiegare il comportamento PK.
C (t) = C 1 exp (- k 1 t) + C '2 exp (- k 2 t)
C (mg / ml): Concentrazione in qualsiasi momento t (ora)
C 1, C 2: intercetta back-estrapolato della fase distribuzione ed eliminazione
k 1, k 2: costanti di velocità a The la distribuzione e la fase di eliminazione
Come mostrato in figura 4, la concentrazione stimata secondo il modello adattato abbinato abbastanza bene per i valori effettivamente misurati. Non ci sono state differenze significative nella concentrazione vitrea di parametri farmacocinetici bevacizumab e quali emivita tra il con e senza vitrectomia. Questo esperimento indica che il ruolo del vitreo nella distribuzione e clearance di bevacizumab è insignificante.
Figura 1:. Procedura per l'esecuzione di intravitreali Iniezioni di intraoculari farmaci nell'occhio coniglio Sotto anestesia tecniche asettiche sono utilizzati applicando 5% gocce povidone iodio e per la preparazione della pelle, e l'iniezione intravitreale del farmaco di interesse sono effettuati utilizzando una siringa graduata spiritoha 30 ago G. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Separazione del bulbo oculare coniglio congelato in tre scomparti seguito un'incisione sclerale con una lama chirurgica e la rimozione dell'iride, l'umore acqueo e vitreo può essere separato. Successivamente, la retina / coroide può essere separato con attenzione di sclera, che è lo strato esterno bianco del globo oculare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immuno Enzyme-linkedassorbente Assay (ELISA) del intraoculare droga nei campioni che rappresentano i tre scomparti. Questa figura mostra una piastra a 96 pozzetti, che viene utilizzato per il test immunologico. Dopo l'incubazione con un anticorpo secondario, un cambiamento di colore è notato nei pozzetti. La densità ottica del colore dipende dalla concentrazione del farmaco di interesse. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Montaggio i dati osservati al modello farmacocinetico In questo esperimento confrontando la farmacocinetica del bevacizumab negli occhi vitrectomized e non vitrectomized, la concentrazione effettiva intravitreale di bevacizumab è presentato come punti. Le curve a muro per i dati di concentrazione che sono guidati dalla farmacocineticamodello, che sono rappresentati da due linee, sono disegnate e utilizzato per il calcolo dei parametri farmacocinetici quali l'emivita del farmaco. Le barre di errore indicano gli intervalli di confidenza al 95%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare:. La curva standard del test ELISA utilizzato per il rilevamento di Bevacizumab Questo si ottiene utilizzando il software in grado di generare un quattro parametri logistici in forma curva. Cliccate qui per scaricare questo file.
| Specie | Vitreo | Umore acqueo | Fare riferimentoza |
| Topo | 5.3 ml | 4.4 ml | 22 |
| Ratto | 50-55 ml | 13,6 ml | 22, 24 |
| coniglio | 1.15-1.7 ml | 350 ml | 23, 27, 28 |
| Scimmia | 3,0-4,0 ml | 102 ml | 23, 26, 28 |
| Umano | 3,0-5,0 ml | 144 - 247 ml | 23, 20, 21, 28 |
Tabella 1: vitreo e dell'umor acqueo volume in diverse specie 17,22-30.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zoletil | Virbac Laboratories, Carros Cedex, France | ||
| Xylazine hydrochloride | Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA | ||
| Proparacaine hydrochloride (Alcaine) | Alcon laboratories, Fort Worth, TX | ||
| Phenylephrine hydrochloride and tropicamide | Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan | ||
| Recombinant Human VEGF 165 | R&D systems | 293-VE-050 | |
| Carbobate-Bicarbonate buffer | SIGMA | C3041-50CAP | |
| Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si | Thermo SCIENTIFIC | 167008 | 96 well plate |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net) | BOVOGEN | BSA025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml | gibco | 10010-023 | |
| Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-28652 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) | abcam | ab97225 | |
| Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-85183 | |
| CelLytic MT Cell Lysis Reagent | SIGMA | C3228-50ML | lysis buffer |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #15 | |
| 100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #10 | |
| Feather surgical blade stainless steel | FEATHER | 11 | |
| 1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34018 | |
| Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml | Thermo SCIENTIFIC | 34062 | |
| Softmax Pro | Molecular Devices | v.5.4.1 | software for generating standard curve |
| SAAM II | Saam Institute, Seattle, WA | software for pharmacokinetic modeling | |
| Phoenix WinNonlin | Pharsight, Cary, NC | v. 6.3 | software for pharmacokinetic modeling |
| Avastin (bevacizumab) | Genentech |
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