Abstract
Afgifte van therapeutische middelen te verbeteren arterioveneuze fistel (AVF) rijping kan worden toegediend via intraluminale of externe routes. De eenvoudige murine AVF model werd met intraluminale toediening geneesmiddeloplossing naar de veneuze endotheel tegelijk als fistels creëren. Technische aspecten van dit model worden besproken. Onder algehele narcose wordt een abdominale incisie gemaakt en de aorta en inferior vena cava (IVC) worden blootgesteld. De infra-renale aorta en IVC ontleed te klemmen. Na proximale en distale klemming wordt de prikplaats blootgelegd en een 25 G naald wordt gebruikt om beide wanden van de aorta en in de IVC doorboren. Onmiddellijk na de punctie, een reporter-gen expressie virale vector werd toegediend in de IVC via dezelfde naald, gevolgd door 15 min incubatie. De intraluminale toedieningsmethode ingeschakeld robuuster virale genafgifte aan de veneuze endotheel in vergelijking met toediening van de externe route. dit novel Werkwijze levering studies die de rol van het endotheel in AVF rijping staand en maken intraluminale geneesmiddelafgifte bij de chirurgische operatie te vergemakkelijken.
Introduction
De muizen aortovenous fistel (AVF) punctie model tussen de aorta en inferior vena cava (IVC) is nu een gevestigde techniek. 1 In dit model, beide wanden van de infra-renale aorta doorboord met een 25 G naald, verlaten in de aangrenzende infra-renale vena cava; de voorste aorta ingang gat wordt gerepareerd met eenvoudige compressie, en vereist geen hechtingen reparatie. Seriële follow-up onderzoek door een hoge resolutie Doppler-echografie en histologische analyse toont de AVF een rijping fase en vervolgens een falende fase recapituleren de bekende pathofysiologie van menselijke AVF hebben. 2
Mechanismen die AVF rijping moduleren staand, zijn verbeterde werkwijzen voor afgifte van therapeutische middelen op rijpende AVF endotheel nodig. Afgifte van therapeutische middelen aan vaartuigen kan zowel via endovasculaire aflevering aan het lumen of via externe levering aan de adventitia. Een voorbeeld van externe levering geldt het comalgemeen gebruikte adventitia toepassing van Pluronic gel. Dit copolymeer thermisch omkeerbare en getransformeerd van vloeibaar naar vast gel wanneer verwarmd tot lichaamstemperatuur. Voorafgaande studies hebben aangetoond aanhoudende geneesmiddelafgifte wordt bereikt als geneesmiddel gemengd pluronic gel topisch in vivo wordt toegepast. 3,4 adventitia toepassing van virale vectoren of siRNA met Pluronic gel verluidt is als perivasculaire afgifte systeem. 5,6 Wij hebben ook gerapporteerd dat behandeling van geëxplanteerde humane aderen met adventitiaal stimulering door peptiden resulteerde in fosforylering van endotheliale receptoreiwitten. 7
Anderzijds hebben onderzoekers ook intraluminale afgifte van zowel virale als niet-virale vectoren in canine 8-10 en konijn 11,12 modellen van veneuze transplantaten. In deze verslagen werd genoverdracht uitgevoerd ex vivo na ader oogst. Eslami et al. Beschreven endovasculaire viraal gen levereny aderen in situ carotis zonder een bypass. 13 Gloverman et al. gerapporteerd intraluminale en adventitia aflevering van naakt DNA in rat liesslagader-oppervlakkige epigastrische veneuze fistels. 14 de Mayo groep rapporteerde adventitia drug delivery in ader slagader-halsader muis halsslagader fistels. 15,16 Echter, deze eerder gemeld modellen vereist een gehecht anastomose te creëren de AVF. In dit rapport wordt intraluminale drug delivery met gelijktijdige AVF creatie in muizen beschreven, met behulp van een hechting-less model van AVF schepping. Door deze gemodificeerde muizen AVF model een eenvoudige werkwijze voor intraluminale afgifte van geneesmiddelen aan de veneuze tak van de fistel kan worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Goedkeuring door de geschikte Institutional Animal Care en gebruik Comite wordt verkregen.
1. Anesthesie en pre-operatieve procedures
- Verdoven mannelijke C57BL / 6 ijs, in de leeftijd 8 weken, met verdampte 3% isofluraan en 0,8 l / min zuurstof toegediend in een acryl inductie kamer.
- Bevestig adequate anesthesie door een gebrek aan reactie op teen knijpen. Plaats de muis in rugligging op de operatietafel en de positie van een silicone masker te leveren verdampte 2-3% isofluraan door continue inademing.
- Verwijder ventrale haar van de nek tot onderbuik met een chemisch ontharingscrème.
- Voer Doppler-echografie onderzoek voorafgaand aan de AVF chirurgie om de baseline kenmerken van arteriële en veneuze flow en diameter vat op te nemen op het gebied van belang. 1,2
- Bevestig een 1 ml spuit met een 25 G naald en laadt de spuit met het gewenste geneesmiddel. Buig de naald naar een hoek van 60 graden ongeveer 4 mm uit de noodzaakle tip. Pak de 25 G-naald met een gebogen naald houder.
2. operatieve ingrepen
- Bereid de incisie met een topisch antisepticum en breng een chirurgische doek. Gebruik steriele handschoenen en instrumenten om aseptische techniek te handhaven gedurende de operatie.
- Voeg een middellijn buikoperatie met een scalpel uitstrekt vanaf het niveau van de onderste rand lever tot net boven de pubis.
- Plaats een retractor en eviscerate alle ingewanden uit de buikholte naar de rechterkant. Wikkel de darmen in gaas doordrenkt met een zoutoplossing. Ontleden het membraan het aansluiten van de retro-peritoneum en lagere dikke darm om het volle zicht van de aorta en IVC te verkrijgen.
- Ontleden de infra-renale aorta en IVC uit de omliggende weefsels, de voorbereiding voor proximale en distale klemmen.
- Plaats één microchirurgie clip in zowel de proximale aorta en het proximale IVC op het niveau net onder de linker nier-ader. Plaats een tweede microchirurgie clip over zowel de dIstal aorta en het distale IVC.
- Pak het bindweefsel rond de aorta en draai mediaal zodat het dorsale oppervlak van de aorta licht wordt blootgesteld arteriële punctie, zoals eerder beschreven. 1
- Snel bloot de prikplaats. De prikplaats zal op de caudale aspect van de schepen, ongeveer driekwart van de afstand van de linker nier-ader aan de aorta vertakking. Houden van de aorta in een gedraaide positie met de linkerhand, ontleden de linker laterale marge van de aorta, zodat er voldoende blootstelling aan punctie met de rechterhand mogelijk te maken. Wees niet te ontleden tussen de aorta en de IVC.
- Handhaving van de aorta in een gedraaide positie en doorboren de aorta door middel van in de IVC met behulp van een 25 G naald met een bijgevoegd 1 ml spuit met drug oplossing. (Figuur 1A)
- Infuseren de geneesmiddeloplossing (100 - 200 pl) met de linkerhand. De naald kan worden gezien door de verwijde en dunIVC wand wanneer de transparante geneesmiddeloplossing verdringt het veneuze bloed uit de IVC (Figuur 1B, C). Blijf nog steeds en onderhouden van de naald op zijn plaats gedurende 15 min.
- Verwijder de distale microchirurgie clip om de-clamp alleen de distale aorta en de distale IVC.
- Verwijder de naald en dan hebben betrekking op de prikplaats van de aorta door te trekken tot aangrenzende retro-peritoneale weefsel.
- Verwijder de proximale microchirurgie clip om de-klem de proximale aorta en het proximale IVC. Bij de-klemming, wordt arterieel bloed waargenomen stroomt in de IVC in plaats van donkere veneuze bloedstroom. Houd voor de punctie gat voor 1 min.
- Na bevestiging van hemostase door observatie voor 30 sec zonder compressie, de terugkeer van de darmen in hun natuurlijke positie en sluit de buik met een lopende hechting op basis van uw goedgekeurde dier protocol.
3. Postoperatieve Procedures
- Na de sluiting van de buik, stop anesthesia. Solliciteer post-operatieve zorg, waaronder analgesie en wondverzorging in overeenstemming met de instructies wordt aanbevolen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. Voor analgesie gebruiken we buprenorfine bij 0,1 mg / kg intrasmuscularly elke 12 uur gedurende 24 uur na de chirurgische procedures.
- Op de eerste dag na de operatie, het uitvoeren van Doppler-echografie om doorgankelijkheid van de AVF bevestigen. Daarnaast meten andere schip en de stroom kenmerken serieel en vergelijken voor veranderingen ten opzichte van pre-operatieve uitgangswaarden. 1,2
Figuur 1. (A) Operative Photo Resultaat Intraluminale Delivery tijdens AVF Surgery. Klem de proximale en distale aorta, en de IVC door toepassing microchirurgie clips. Prik de aorta door middel van in de IVC met behulp van een 25 G naald met bijgevoegde spuit met drug-oplossing. (B) A HigHaar macht Picture (4X vergroting) van de lekke IVC voor Infusion. De naald wordt verduisterd door donkere veneuze bloed. Geel pijlpunten duiden de wall-to-wall diameter van de IVC. (C) een hogere macht Picture (4X vergroting) van de lekke IVC na Infusion. De naald (zwarte pijl) kan worden gezien door de zacht opgezwollen en dun IVC muur (gele pijlen) als de transparante drug oplossing verdringt het veneuze bloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een reeks van 33 muizen overleven op de eerste dag na de operatie was 97,0%; AVF openheid, zoals bepaald door ultrageluid, was 84,9%.
Gentransductie efficiëntie van deze endovasculaire aflevering route met de traditionele buitenroute vergeleken. Voor intraluminale bezorging (ILD), onmiddellijk na de punctie, 200 ul adenovirus-GFP (Ad-GFP) vector oplossing (1 x 10 9 PFU / ml) werd toegediend in de IVC via de punctienaald, gevolgd door 15 min incubatietijd . Controlemuizen ontvingen adventitia levering (AD) van Ad-GFP (1 x 10 9 PFU / ml) aan de IVC behulp Pluronic gel. Monsters werden geëxplanteerd op 24 uur na blootstelling aan adenovirusvectoren. Expressie van GFP in de IVC wand en de fistel werd beoordeeld door waarneming en aangezicht van de intima van fluorescentiemicroscopie en histologisch onderzoek in secties met een anti-GFPantilichaam.
En face waarneming toonde sterkere expressie van GFP in de IVC wand in muizen behandeld met ILD vergeleken met AD, met karakteristieke verhoging rond de fistel bij 24 uur (Figuur 2A). GFP expressie werd persistent in beide groepen bij 72 uur na transfectie (gegevens niet getoond). Histologische analyse met anti-GFP antilichaam toonde robuuster en plaatsspecifieke GFP expressie in de intima van de IVC in muizen behandeld met ILD vergeleken met AD. (Figuur 2B). Om deze resultaten te bevestigen, werden infra-renale IVCs behandeld met adenovirus-GFP door AD of ILD geoogst voor Western Blot. GFP eiwitexpressie voldoende voor detectie na ILD, suggereert superieure virale geneesmiddelafgifte aan de IVC wand via de intraluminale route op 24 uur na transfectie.
Figuur 2. Levering van adenovirus-GFP aan de AVF Lumen Verbetert GFP expressie. (A) Vertegenwoordiger immunofluorescentie vertoning en face uitzicht op de AVF endotheel (24 uur) bij muizen die adenovirus-GFP door adventitia levering (boven) of door intraluminale levering (onder) toegepast. Bar geeft 25 pm. (B) Representatieve immunofluorescentie toont delen van de AVF endotheel (24 uur) bij muizen die adenovirus-GFP door adventitia levering (boven) of door intraluminale levering (onder) toegepast. * Geeft lumen van het IVC; balk geeft 25 pm. (C) Representatieve Western blot die detectie van GFP in AVF behandeld met adenovirus-GFP toegepast via de adventitia of intraluminale route.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze modificatie van het muizen AVF model omvat intraluminaal levering aan de veneuze endotheel bij de AVF creëren. Een AVF werd gemaakt door het doorprikken van de infra-renale aorta met een 25 G naald en de uitbreiding van de punctie door de tegenoverliggende wand van de aorta in de IVC, gevolgd door injectie van het geneesmiddel oplossing door dezelfde naald. De oplossing wordt gehandhaafd intra-caval, dwz., In de veneuze tak van AVF, totdat de-klemmen. Wat onderscheidt dit model van andere murine modellen AVF 17-19 is het ontbreken van hechtingen of lijmen dat stenose, acute trombose en eventuele interferentie met moleculaire analyse kan veroorzaken. De mogelijkheid om dezelfde naald die de aorta en IVC doorsteekt om de AVF maken ook geneesmiddelen leveren de AVF lumen vereenvoudigt de afgifte met minimale verblijf manipulatie.
Er zijn een aantal kritische stappen en wijst op het succes en de consistentie van de procedure te verbeteren. de proximal klem van de aorta en IVC is onder de linker renale ader geplaatst. Als er grote lumbale aderen in het bovenste gedeelte van de infra-renale IVC wordt moet een aanpassing van de klemmende site onder deze vaartuigen aanbevolen efficiënte incubatie van geneesmiddelen zonder verdunning toe door retrograde bloedende lumbale aderen. Het distale klem van de aorta en IVC wordt geplaatst op het niveau van darmbeenvertakking, opdat zij kunnen interfereren met de naald punctie van de distale aorta en IVC. Het houden van de 25 G-naald met een gebogen naald houder maakt een optimale richting van de naald tijdens het vaartuig punctie. Hemostase wordt bereikt door het bedekken van de arteriële kabelopening met het aangrenzende retro-peritoneum. Speciale aandacht wordt besteed aan een zorgvuldige compressie terwijl het vermijden van AVF occlusie en trombose zoals eerder beschreven. 1
De ontwikkeling van genoverdracht technologie biedt de mogelijkheid om chirurgische resultaten op moleculair niveau te wijzigen. Rapporten beschrijven intraluminal genafgifte een ader zijn vooral gericht op gerichte behandeling van veneuze graft falen. Daarentegen dit model zorgt voor geneesmiddelafgifte voor modulatie van AVF rijping. Voordelen van dit model omvatten het gebruik van een murine model waarmee onderzoek variërende muis genetische stammen. Bovendien, een 15-min intraluminale blootstellingsprotocol gemakkelijk overdraagbaar klinische intra-operatieve instellingen en kan helpen beoordelen peri-procedurele interventies juxta-anastomose stenose die vaak bemoeilijkt menselijke AVF chirurgische ingreep. Uit deze eerste resultaten wordt aangetoond dat deze methode levert meer plaatsspecifieke genexpressie in het endotheel in vergelijking met de traditionele buitenroute.
Een mogelijke beperking van deze studie is het effect van variabele distensie druk op de IVC. Isolatie van het IVC-segment is niet perfect in dit muismodel, dwz., Zijtakken (lumbale aderen) werden niet afgebonden. Daarom is het moeilijk exact maintain een consistent niveau van uitzetting druk tijdens incubatie. Hoewel het IVC voorzichtig wordt opgezwollen door handmatige infuus, kunnen hogere distending drukken neointima hyperplasie 20,21 en directe gladde spiercellen schade, 11 wat leidt tot storingen in de analyse veroorzaken. Het is ook moeilijk om de efficiëntie van geneesmiddelafgifte volledig kwantificeren, zoals sommige geneesmiddel kan worden verloren tijdens de bevalling via lumbale aderen, als na klem verwijderd door het proximale IVC en eventueel via de AVF in de aorta. Tenslotte maakt deze werkwijze enkele geneesmiddel systemisch vrijgegeven na verwijdering clamp; evacuatie van het geneesmiddel en het spoelen van de site kan systemische afgifte te voorkomen, maar kwantificering van de mate van klaring van het geneesmiddel zou moeten worden bevestigd.
Samenvattend, deze technische wijziging van de AVF murine model is relatief eenvoudig en reproduceerbaar en maakt gerichte endotheliale medicijnafgifte om de muis AVF. intraluminale inprojectie ten tijde van AVF schepping technisch haalbaar en kan met succes verbeteren virale genexpressie in het endotheel in vergelijking met adventitiele levering. Dit AVF-geneesmiddelafgifte model zal een nuttige vorm niet alleen voor dissectie van de mechanismen die veneuze AVF onderdeel rijping te reguleren, maar ook voor therapeutische modulatie van AVF rijping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
- Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
- Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
- Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
- Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
- Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
- Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
- Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
- Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
- Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
- Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
- Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
- Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
- Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
- Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
- Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
- Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
- Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
- Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).
