Abstract
Consegna di agenti terapeutici per migliorare la fistola artero-venosa (AVF) la maturazione può essere somministrato sia attraverso percorsi intraluminali o esterni. Il semplice modello AVF murino è stato combinato con la somministrazione intraluminale della soluzione medicinale all'endotelio venosa allo stesso tempo come creazione fistola. Gli aspetti tecnici di questo modello sono discussi. In anestesia generale, un'incisione addominale è fatto e l'aorta e vena cava inferiore (IVC) sono esposti. L'aorta infra-renale e IVC sono sezionati per il bloccaggio. Dopo bloccaggio prossimale e distale, il sito di puntura è esposto e un ago da 25 G è utilizzato per forare entrambe le pareti dell'aorta e nel IVC. Subito dopo la puntura, un gene reporter esprimente vettore virale è stato infuso nella IVC tramite lo stesso ago, seguito da 15 minuti di incubazione. La modalità di somministrazione intraluminale abilitato più robusto trasferimento genico virale per l'endotelio venosa rispetto alla somministrazione per via esterna. Questo novel metodo di consegna faciliterà studi che esplorano il ruolo dell'endotelio in AVF maturazione e permettono drug delivery intraluminale al momento dell'intervento chirurgico.
Introduction
La fistola aortovenous murino (AVF) modello di foratura tra l'aorta e la vena cava inferiore (IVC) è ora una tecnica consolidata. 1 In questo modello, entrambe le pareti dell'aorta infra-renale sono perforati con un ago da 25 G, uscendo nella adiacente infra-renale vena cava; il foro di entrata aortica anteriore è riparato con compressione semplice, e non richiede la riparazione di sutura. L'esame di serie di follow-up ad alta risoluzione da Doppler e l'analisi istologica mostra la AVF di avere una fase di maturazione e quindi una fase di mancanza, ricapitolando la fisiopatologia noto di AVF umana. 2
Per esplorare i meccanismi che modulano AVF la maturazione, sono necessari metodi migliori per la consegna di agenti terapeutici alla maturazione AVF endotelio. Consegna di agenti terapeutici alle navi può essere sia via la consegna endovascolare al lume, o tramite consegna esterno al avventizia. Un esempio di consegna esterna è il comcomunemente usato applicazione avventiziale di Pluronic gel. Questo copolimero è termo-reversibile e trasformato da liquido a gel solido quando riscaldato alla temperatura corporea. Studi precedenti hanno dimostrato la somministrazione di farmaci sostenuta si ottiene quando farmaco mescolato in gel Pluronic viene applicato localmente in vivo. 3,4 applicazione avventiziale di vettori virali o siRNA con il gel Pluronic è stato segnalato per essere efficace come un sistema di consegna perivascolare. Noi 5,6 hanno anche riferito che il trattamento di espiantati safene umane con la stimolazione avventiziale da peptidi provocato fosforilazione di proteine recettori endoteliali. 7
D'altra parte, i ricercatori hanno utilizzato anche la consegna intraluminale dei due vettori virali e non virali in canino 8-10 e coniglio 11,12 modelli di innesti di vena. In questi rapporti, il trasferimento genico è stata eseguita ex vivo dopo vena vendemmia. Eslami et al. Riportato gene virale endovascolare consegnay per carotide vene in loco senza creare un by-pass. 13 Gloverman et al. consegna endoluminale e avventiziale riportato DNA nudo nel ratto dell'arteria femorale superficiale epigastrica vena fistole. 14 Il gruppo di Mayo ha segnalato la somministrazione di farmaci avventiziale nel topo carotide-giugulare vena fistole. 15,16 Tuttavia, questi modelli precedentemente segnalati richiesto un anastomosi suturata per creare l'AVF. In questo rapporto, la somministrazione di farmaci endoluminale con la creazione AVF simultanea nei topi è descritto, utilizzando un modello di sutura-meno della creazione AVF. Utilizzando questo modello murino AVF modificato un metodo semplice per la somministrazione di farmaci intraluminale all'arto venosa della fistola può essere eseguita.
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Protocol
Approvazione da parte del Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale adeguato si ottiene.
1. Anestesia e procedure pre-operatorie
- Anestetizzare maschio C57Bl / 6 di ghiaccio, di età compresa tra 8 settimane, con vaporizzato 3% isoflurano e 0,8 L / min di ossigeno somministrato in una camera di induzione acrilico.
- Confermare un'anestesia adeguata dalla mancanza di reazione al pinch punta. Posizionare il supina mouse sulla tabella di funzionamento e posizionare una maschera di silicone per fornire vaporizzato 2 - 3% isoflurano per inalazione continua.
- Rimuovere i capelli ventrale dal collo al basso addome usando una crema depilatoria chimica.
- Eseguire esame ecografico Doppler prima della chirurgia AVF per registrare le caratteristiche di base di arterioso e venoso e il flusso di diametro del vaso presso le aree di interesse. 1,2
- Attaccare una siringa da 1 ml ad un ago 25 G e caricare la siringa con il farmaco desiderato. Piegare l'ago a un angolo di 60 gradi circa 4 mm dalla necessitàLe punta. Afferrare l'ago G 25 con un supporto ago curvo.
2. Procedure Operative
- Preparare il sito di incisione con un antisettico topico e applicare un telo chirurgico. Utilizzare guanti e strumenti sterili per mantenere la tecnica asettica in tutta la chirurgia.
- Effettuare una incisione addominale mediana con un bisturi estende dal livello del bordo inferiore del fegato appena sopra il pube.
- Inserire un divaricatore e sviscerare tutte le viscere dalla cavità addominale verso il lato destro. Avvolgere le viscere in una garza imbevuta con soluzione fisiologica. Sezionare la membrana che collega la retro-peritoneo e inferiore del colon per ottenere piena vista della aorta e IVC.
- Sezionare l'aorta infra-renale e IVC dai tessuti circostanti, la preparazione per prossimale e distale bloccaggio.
- Inserire un singolo clip microchirurgia attraverso sia dell'aorta prossimale e prossimale IVC a livello appena sotto la vena renale sinistra. Posizionare un secondo clip microchirurgia attraverso sia il ddell'aorta Istal e la IVC distale.
- Afferrare tessuto connettivo circostante l'aorta e ruotare medialmente in modo che la superficie dorsale della aorta è leggermente esposto per la puntura arteriosa, come descritto in precedenza. 1
- esporre rapidamente il sito di puntura. Il sito della puntura sarà alla parte caudale dei vasi, circa tre quarti della distanza dalla vena renale sinistra alla biforcazione aortica. Mantenendo l'aorta in una posizione ruotata con la mano sinistra, sezionare il margine laterale sinistra dell'aorta modo che ci sia ampio esposizione a consentire foratura con la mano destra. Fare attenzione a non sezionare tra l'aorta e l'IVC.
- Mantenere l'aorta in una posizione ruotata e forare l'aorta attraverso nella IVC utilizzando un ago G 25 con annessa soluzione contenente farmaco siringa da 1 ml. (Figura 1A)
- Infondere la soluzione medicinale (100 - 200 pl) con la mano sinistra. L'ago può essere visto attraverso la dilatata e sottileParete IVC quando la soluzione droga trasparente sposta il sangue venoso dal IVC (Figura 1B, C). Rimangono ancora e mantenere l'ago in posizione per 15 min.
- Rimuovere la clip microchirurgia distale di de-clamp solo l'aorta distale e il distale IVC.
- Rimuovere l'ago e poi coprire il sito di puntura dell'aorta tirando il tessuto retro-peritoneale adiacente.
- Rimuovere la clip microchirurgia prossimale di de-clamp l'aorta prossimale e prossimale IVC. Al de-bloccaggio, sangue arterioso si osserva che scorre nella IVC invece di flusso di sangue venoso scuro. Mantenere che copre il foro della puntura per 1 min.
- Dopo la conferma di emostasi con l'osservazione per 30 sec senza compressione, restituire le viscere nella loro posizione naturale e chiudere l'addome con una sutura in esecuzione secondo il vostro protocollo animale approvato.
Procedure 3. post-operatorie
- Dopo la chiusura del ventre, interrompere Anesthesia. Applicare cure post-operatorie inclusi analgesia e la cura delle ferite in conformità alle istruzioni raccomandate dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali. Per analgesia usiamo buprenorfina a 0.1 mg / kg intrasmuscularly ogni 12 ore per 24 ore seguendo le procedure chirurgiche.
- Il primo giorno dopo l'operazione, eseguire Doppler a ultrasuoni per confermare la pervietà del AVF. Inoltre, misurare altra nave e caratteristiche di flusso in serie e comparare per le modifiche da valori basali pre-operatorie. 1,2
Figura 1. (A) Operative foto che mostra intraluminale consegna durante l'intervento chirurgico AVF. Bloccare prossimale e distale dell'aorta, nonché la IVC applicando clip microchirurgia. Forare l'aorta attraverso nella IVC con un ago da 25 G con una soluzione di droga siringa attaccata contenente. (B) A HigIl suo potere Picture (4X) del perforata IVC prima infusione. La punta dell'ago è oscurata da sangue venoso di colore scuro. Giallo frecce indicano il diametro da parete a parete del. (C) una maggiore potenza Picture (4X) IVC della perforata IVC dopo l'infusione. La punta dell'ago (freccia nera) può essere visto attraverso la parete IVC dolcemente disteso e sottile (frecce gialle) come la soluzione di droga trasparente sposta il sangue venoso.
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Representative Results
In una serie di 33 topi, la sopravvivenza nel primo giorno post-operatorio era 97,0%; AVF pervietà, come determinato da ultrasuoni, era 84,9%.
Gene efficienza di trasduzione del percorso di consegna endovascolare con il percorso esterno tradizionale è stato confrontato. Per la consegna intraluminale (ILD), subito dopo la puntura, 200 ml di Adenovirus-GFP (-GFP Ad) vettore soluzione (1 × 10 9 PFU / ml) venivano iniettati nella IVC tramite l'ago puntura, seguito da 15 minuti di tempo di incubazione . Topi di controllo hanno ricevuto la consegna avventiziale (AD) di Ad-GFP (1 × 10 9 PFU / ml) per l'IVC usando il gel Pluronic. I campioni sono stati espiantati a 24 ore dopo l'esposizione a vettori di adenovirus. Espressione di GFP al muro IVC e la fistola è stata valutata mediante osservazione en-faccia dell'intima mediante microscopia a fluorescenza, nonché esame istologico in sezioni usando un anti-GFPanticorpo.
En osservazione faccia mostrava forte espressione di GFP nel muro IVC nei topi trattati con ILD rispetto a AD, con l'aumento caratteristica intorno fistola a 24 ore (Figura 2A). espressione GFP era persistente in entrambi i gruppi a 72 ore dopo la trasfezione (dati non riportati). L'analisi istologica con anticorpo anti-GFP ha mostrato più robusta e sito-specifica espressione GFP nell'intima della IVC nei topi trattati con ILD rispetto AD. (Figura 2B). Per confermare questi risultati, IVCS infra-renale trattati con adenovirus-GFP da AD o ILD sono state raccolte per Western Blot. espressione della proteina GFP era sufficiente per rilevamento solo dopo ILD, suggerendo superiore drug delivery virale alla parete IVC per via intraluminale a 24 ore dopo la trasfezione.
Figura 2. La consegna di Adenovirus-GFP per l'AVF Lumen Migliora espressione GFP. (A) Rappresentante immunofluorescenza mostra en faccia vista dell'endotelio AVF (24 ore) in topi trattati con adenovirus-GFP applicato dalla consegna avventiziale (in alto) o mediante consegna intraluminale (in basso). La barra indica 25 micron. (B) immunofluorescenza Rappresentante che mostra le sezioni del endotelio AVF (24 ore) in topi trattati con adenovirus-GFP applicato dalla consegna avventiziale (in alto) o mediante consegna intraluminale (in basso). * Indica lume della IVC; barra indica 25 micron. (C) Western Blot Rappresentante mostrando rilevamento di GFP in AVF trattati con adenovirus-GFP applicata tramite l'avventizia o via endoluminale.
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Discussion
Questa modifica del modello murino AVF incorpora drug delivery intraluminale all'endotelio venoso al momento della creazione AVF. Un AVF stato creato da puntura dell'aorta infra-renale con un ago 25 G ed estendere la foratura attraverso la parete aortica opposta nella IVC, seguita da iniezione di soluzione medicinale attraverso lo stesso ago. La soluzione viene mantenuta intra-cavale, cioè., Nella parte venoso AVF, fino de-bloccaggio. Ciò che distingue questo modello dagli altri modelli murini AVF 17-19 è la mancanza di suture o adesivi che possono causare la stenosi, trombosi acuta, e possibili interferenze con l'analisi molecolare. La possibilità di utilizzare lo stesso ago che perfora l'aorta e IVC per creare l'AVF per fornire anche farmaci al lume AVF consente l'erogazione semplice con la manipolazione nave minima.
Ci sono alcuni passaggi critici e punti per migliorare il tasso di successo e la coerenza della procedura. Il prmorsetto oximal dell'aorta e IVC è posizionato sotto la vena renale sinistra. Se ci sono grandi vene lombari nella parte superiore del infra-renale IVC, si raccomanda quindi modifica del sito di bloccaggio al di sotto di questi vasi per consentire un efficiente incubazione di farmaco senza diluizione retrogrado-sanguinamento da vene lombari. Il morsetto distale dell'aorta e IVC è collocato a livello di iliaca biforcazione, affinché non possa interferire con la puntura dell'aorta distale e IVC. Tenendo il ago G 25 con un supporto ago curvo permette la direzione ottimale dell'ago durante la puntura dei vasi. L'emostasi è ottenuta coprendo il foro di entrata arteriosa con l'adiacente retro-peritoneale. Particolare attenzione è rivolta a fornire un'attenta compressione evitando AVF occlusione e la trombosi come descritto in precedenza. 1
Lo sviluppo della tecnologia di trasferimento genico offre la possibilità di modificare risultati chirurgici a livello molecolare. I rapporti che descrivono inconsegna del gene traluminal ad una vena si sono concentrate principalmente sul trattamento mirato di fallimento della vena trapianto. Al contrario, questo modello consente la somministrazione di farmaci per la modulazione di AVF di maturazione. I vantaggi di questo modello includono l'uso di un modello murino permettendo esame dei diversi ceppi di topo genetiche. Inoltre, a 15 min protocollo esposizione endoluminale è facilmente trasferibile a contesti clinici intra-operatoria e può aiutare a valutare interventi peri-procedurale per prevenire la stenosi iuxta-anastomotica che complica comunemente chirurgia AVF umana. Da questi risultati iniziali, mostriamo che questo metodo fornisce più site-specific gene nel endotelio rispetto al percorso esterno tradizionale.
Un potenziale limitazione di questo studio è l'effetto della pressione distensione variabile nella IVC. L'isolamento del segmento IVC non è perfetto in questo modello di topo, vale a dire., Rami laterali (vene lombari) non sono stati legatura. Pertanto, è difficile precisamente maintain un livello costante di pressione distensione durante l'incubazione. Anche se l'IVC è leggermente dilatato per infusione manuale, pressioni di distensione più elevate possono causare iperplasia neointimale 20,21 e danni alle cellule muscolari lisce diretta, 11 che porta a interferenze in analisi. È anche difficile quantificare completamente l'efficienza della somministrazione di farmaci, come alcuni farmaco può essere persa durante la consegna attraverso le vene lombari, così come dopo la rimozione del morsetto attraverso prossimale IVC e potenzialmente attraverso l'AVF nell'aorta. Infine, questo metodo consente una parte del farmaco di essere rilasciato sistemicamente dopo la rimozione del morsetto; evacuazione del farmaco e lavaggio del sito potrebbe impedire rilascio sistemico, ma quantificazione del grado di washout farmaco dovrebbe essere confermata.
In conclusione, questa modifica tecnica al modello murino AVF è relativamente semplice e riproducibile e permette la somministrazione di farmaci mirati endoteliale alla AVF mouse. endoluminale ininiezione, al momento della creazione AVF è tecnicamente fattibile e può migliorare con successo l'espressione genica virale nell'endotelio rispetto alla consegna avventiziale. Questo modello di distribuzione AVF-farmaco sarà una modalità utile non solo per la dissezione dei meccanismi che regolano venosa AVF arto maturazione, ma anche per la modulazione terapeutica di AVF stagionatura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
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