Abstract
A entrega de agentes terapêuticos para melhorar a fístula arteriovenosa (FAV) de maturação pode ser administrado quer por via intraluminal ou externos. O modelo murino FAV simples foi combinada com a administração intraluminal de solução de fármaco para o endotélio venoso ao mesmo tempo que a criação de fístula. são discutidos aspectos técnicos deste modelo. Sob anestesia geral, uma incisão é feita abdominal e a veia cava inferior e aorta (IVC) estão expostos. A aorta infra-renal e IVC são dissecados para fixação. Após o pinçamento proximal e distal, o local da punção é exposta e uma agulha G 25 é usado para perfurar ambas as paredes da aorta e para o IVC. Imediatamente após a punção, um gene repórter que expressa vector viral foi infundido na VCI através da mesma agulha, seguido por 15 min de incubação. O método de administração intraluminal activado de entrega de genes virais mais robusto ao endotélio venoso em comparação com a administração por via externa. este novel método de entrega vai facilitar estudos que explorar o papel do endotélio em FAV maturação e permitem uma entrega de drogas intraluminal no momento da operação cirúrgica.
Introduction
A fístula aortovenous murino (FAV) modelo de punção entre a aorta ea veia cava inferior (VCI) é agora uma técnica estabelecida. 1 Nesse modelo, ambas as paredes da aorta infra-renal são perfuradas com uma agulha G 25, sair para o adjacente infra-renal, veia cava; o orifício de entrada da aorta anterior é reparado com compressão simples, e não necessita de reparação de sutura. Serial exame de acompanhamento por ultra-som Doppler de alta resolução e análise histológica mostra a AVF ter uma fase de maturação e, em seguida, uma fase falhando, recapitulando a fisiopatologia conhecido da AVF humana. 2
Para explorar mecanismos que modulam FAV maturação, são necessários métodos melhorados para a administração de agentes terapêuticos para o amadurecimento endotélio FAV. A entrega de agentes terapêuticos para navios podem ser tanto via entrega endovascular para o lúmen, ou através de entrega externa à adventícia. Um exemplo de entrega externa é o commumente usado aplicação adventícia de gel Pluronic. Este copolímero é termo-reversível e transformado de líquido para gel sólido quando aquecida à temperatura corporal. Entrega da droga sustentada estudos anteriores mostraram é conseguido quando a droga misturada em gel 'Pluronic' é aplicada por via tópica in vivo. 3,4 aplicação adventícia de vectores virais ou ARNsi com gel 'Pluronic' tem sido relatada como sendo eficaz como um sistema de entrega perivascular. 5,6 Nós têm também relataram que o tratamento de veias safenas humanas explantados com estimulação adventícia por peptídeos resultou na fosforilação de proteínas receptoras endoteliais. 7
Por outro lado, os investigadores têm usado também entrega intraluminal de ambos os vectores virais e não virais em canino e coelho 8-10 11,12 modelos de enxertos de veia. Nesses relatórios, a transferência de genes foi realizada ex vivo após veia colheita. Eslami et ai. Relataram gene virai endovascular entregary a carótida veias in situ sem criar um bypass. 13 Gloverman et al. entrega intraluminal e adventícia relatado de DNA nu em ratos femoral fístulas veia epigástrica artéria-superficial. 14 O grupo Mayo relataram entrega da droga adventícia em fístulas rato artéria carótida-jugular. 15,16 No entanto, estes modelos previamente relatados necessária uma anastomose suturada para criar FAV. Neste relatório, a entrega de drogas intraluminal com a criação AVF simultânea em ratos é descrito, utilizando um modelo de sutura-less da criação FAV. Usando este modelo de murino modificado FAV um método simples para a entrega de drogas intraluminal para o membro da fístula venosa pode ser realizada.
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Protocol
Aprovação pela Comissão Cuidado e Uso Institucional animal apropriado é obtido.
1. A anestesia e procedimentos pré-operatórios
- Anestesiar ratos machos C57BL / 6 de gelo, com idades entre 8 semanas, com isoflurano vaporizado 3% e 0,8 L / min de oxigénio administrado em uma câmara de indução acrílico.
- Confirmar anestesia adequada pela falta de reação a pitada dedo do pé. Posicione o supino rato na mesa de operação e coloque uma máscara de silicone para entregar vaporizado 2-3% de isoflurano por inalação contínua.
- Remover pêlos ventral do pescoço até inferior do abdome utilizando um creme depilatório químico.
- Realizar o exame de ultra-som Doppler antes da cirurgia AVF para gravar características basais dos arterial e fluxo venoso e diâmetro do vaso para as áreas de interesse. 1,2
- Anexar uma seringa de 1 ml a uma agulha G 25 e carregar a seringa com o fármaco desejado. Dobrar a agulha a um ângulo de 60 graus aproximadamente 4 mm a partir da necessidadele ponta. Segure a 25 G agulha com um suporte de agulha curva.
2. Procedimentos Operativos
- Prepare o local da incisão com um anti-séptico tópico e aplicar um campo cirúrgico. Use luvas e instrumentos esterilizados para manter uma técnica asséptica durante toda a cirurgia.
- Fazer uma incisão na linha média abdominal com um bisturi que se estende desde o nível da borda inferior do fígado para um pouco acima do púbis.
- Insira um afastador e eviscerar todas as entranhas da cavidade abdominal para o lado direito. Enrole as entranhas em gaze embebida em soro fisiológico. Dissecar a membrana que liga o retro-peritônio e inferior do cólon para obter visão completa da aorta e CIV.
- Dissecar a aorta infra-renal e IVC dos tecidos adjacentes, preparando-se para proximal e fixação distal.
- Coloque um único clipe de microcirurgia através tanto da aorta proximal e proximal VCI no nível imediatamente abaixo da veia renal esquerda. Coloque um segundo clipe microcirurgia através tanto o daorta istal e da VCI distal.
- Agarrar o tecido conjuntivo em torno da aorta e medialmente rodar de modo a que a superfície dorsal da aorta é exposta ligeiramente para o punção arterial, tal como descrito anteriormente. 1
- expor rapidamente o local da punção. O local da punção será no aspecto caudal dos vasos, cerca de três quartos da distância da veia renal esquerda para a bifurcação da aorta. Mantendo a aorta numa posição rodada com a mão esquerda, dissecar a margem lateral esquerda da aorta de modo que há uma ampla exposição para permitir a perfuração com a mão direita. Tenha cuidado para não dissecar entre a aorta ea veia cava inferior.
- Manter a aorta numa posição rodada e punção na aorta através de para a VCI usando uma agulha G 25 com uma solução contendo a droga ligada seringa de 1 ml. (Figura 1A)
- Infundir a solução do fármaco (100 - 200 mL) utilizando a mão esquerda. A agulha pode ser visto através da dilatada e finaParede da VCI quando a solução de fármaco transparente desloca o sangue venoso para fora da VCI (Figura 1B, C). Permanecem ainda e manter a agulha na posição, durante 15 min.
- Remova o clipe microcirurgia distal de-braçadeira somente a aorta distal e da VCI distal.
- Remova a agulha e, em seguida, cobrir o local da punção da aorta, puxando o tecido retro-peritoneal adjacente.
- Remova o clipe microcirurgia proximal de-prender a aorta proximal e proximal IVC. Upon de-fixação, o sangue arterial é observado que flui para o IVC, em vez de fluxo sanguíneo venoso escuro. Mantenha cobrindo o buraco da punção por 1 min.
- Após a confirmação da hemostasia por observação durante 30 segundos sem compressão, retorno dos intestinos em sua posição natural e fechar o abdómen com uma sutura contínua de acordo com o seu protocolo de animais aprovado.
Procedimentos 3. pós-operatórias
- Após o fechamento do abdômen, interromper o anesthesia. Aplicar cuidados pós-operatórios, incluindo analgesia e cuidados de feridas, de acordo com as instruções recomendadas pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal. Para analgesia usamos buprenorfina a 0,1 mg / kg intrasmuscularly cada 12 h durante 24 horas seguindo os procedimentos cirúrgicos.
- No primeiro dia após a operação, a realização do Doppler ultra-som para confirmar a permeabilidade da FAV. Além disso, medir a outra embarcação e características de fluxo em série e comparar para mudanças de valores basais pré-operatórios 1,2.
Figura 1. (A) Mostrando intraluminal entrega durante a cirurgia AVF operativo Foto. Prender o proximal e distai da aorta, bem como a VCI por aplicação de pinças de microcirurgia. Punção na aorta através de para a VCI usando uma agulha de 25 G com uma solução de fármaco que contém a seringa ligados. (B) Um Higseu retrato de energia (uma ampliação de 4X) do puncionado IVC antes da infusão. A ponta da agulha é obscurecida por sangue venoso de cor escura. Setas amarelas indicam o diâmetro de parede a parede da VCI. (C) um poder superior de imagem (uma ampliação de 4X) do puncionado IVC após a infusão. A ponta da agulha (seta preta) pode ser vista através da parede da VCI suavemente distendido e finas (pontas de seta amarelo) como a solução de um fármaco transparente desloca o sangue venoso.
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Representative Results
Numa série de 33 ratinhos, a sobrevivência, no primeiro dia pós-operatório foi de 97,0%; FAV permeabilidade, tal como determinado por ultra-sons, foi de 84,9%.
Gene eficiência de transdução desta via de administração endovascular com o percurso externa tradicional foi comparada. Para a administração intraluminal (ILD), imediatamente após a punção, a 200 ul de adenovírus-GFP (GFP-Ad) vetor solução (1 × 10 9 UFP / ml) foi infundido para a VCI através da agulha de perfuração, seguido de tempo de incubação de 15 min . Os ratinhos de controlo receberam a entrega adventícia (AD) de Ad-GFP (1 × 10 9 UFP / ml) para a VCI usando gel 'Pluronic'. As amostras foram explantadas às 24 h após a exposição a vectores de adenovírus. Expressão de GFP na parede da VCI e da fístula foi avaliada por observação en face da íntima através de microscopia de fluorescência, assim como o exame histológico de secções utilizando um anticorpo anti-GFPanticorpo.
En observação da face mostraram expressão forte da GFP na parede da veia cava inferior nos ratos tratados com DPI em comparação com AD, com o aumento característico em torno da fístula às 24 h (Figura 2A). a expressão da GFP era persistente em ambos os grupos de 72 h após a transfecção (dados não mostrados). A análise histológica com anticorpo anti-GFP demonstrou expressão de GFP mais robusto e específica do local na camada íntima da VCI nos ratinhos tratados com DPI em comparação com AD. (Figura 2B). Para confirmar estes resultados, IVCS infra-renais tratados com adenovírus-GFP por AD ou ILD foram colhidas por Western blot. a expressão da proteína GFP foi suficiente para a detecção apenas depois de ILD, sugerindo a entrega de drogas virai superior a parede da VCI por via intraluminal às 24 h após a transfecção.
Figura 2. A entrega de Adenovírus-GFP para o lúmen FAV Melhora Expressão de GFP. (A) representativa mostrando imunofluorescência PT vista de face do endotélio FAV (24 h) em ratinhos que receberam adenovírus-GFP aplicada por entrega adventícia (topo), ou por entrega intraluminal (parte inferior). A barra indica 25 um. (B) imunofluorescência representativas que mostra secções do endotélio FAV (24 h) em ratinhos que receberam adenovírus-GFP aplicada por entrega adventícia (topo), ou por entrega intraluminal (parte inferior). * Denota lúmen do IVC; barra indica 25 um. (C) Western blot Representante mostrando a detecção de GFP em AVF tratados com adenovírus-GFP aplicada através da adventícia ou da via intraluminal.
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Discussion
Esta modificação do modelo murino incorpora FAV de administração de fármaco intraluminal ao endotélio venoso no momento da criação FAV. Uma FAV foi criado através de punção na aorta infra-renal com uma agulha G 25, e estendendo-se o furo através da parede aórtica em frente para a VCI, seguido de injecção de solução de fármaco através da mesma agulha. A solução é mantida intra-cava, isto é., No membro de FAV venosa, até que de-aperto. O que distingue este modelo a partir de outros modelos murinos 17-19 FAV é a falta de suturas ou colas que podem causar estenose, trombose aguda, e uma possível interferência com a análise molecular. A capacidade de usar a mesma agulha que perfura a aorta ea veia cava inferior para criar a FAV para entregar drogas também para o lúmen FAV permite a administração mais simples, com o mínimo de manipulação navio.
Existem alguns passos críticos e pontos para melhorar a taxa de sucesso e consistência do processo. o proximal braçadeira da aorta e veia cava inferior é colocada por baixo da veia renal esquerda. Se existem grandes veias lombares na porção superior da VCI infra-renal, em seguida, a modificação do sítio de fixação para abaixo destes vasos é recomendado para permitir a incubação do fármaco eficiente, sem diluição, por retrógrada volta-sangramento das veias lombares. O grampo distal da aorta e CIV é colocado ao nível da bifurcação ilíaca, para que não pode interferir com a punção com agulha da aorta distal e IVC. Segurando a 25 G agulha com um suporte de agulha curvo, permite um sentido ideal da agulha durante a punção do vaso. A hemostase é conseguida cobrindo o orifício de entrada arterial com a retro-peritoneu adjacente. É dada especial atenção para fornecer compressão cuidado, evitando a oclusão da FAV e trombose, como descrito anteriormente 1.
O desenvolvimento da tecnologia de transferência de genes oferece o potencial para modificar resultados cirúrgicos ao nível molecular. Relatórios que descrevemtraluminal de entrega de genes para uma veia têm-se centrado principalmente no tratamento alvo de falha do enxerto venoso. Em contraste, este modelo permite a entrega de drogas para a modulação da maturação FAV. As vantagens deste modelo incluem a utilização de um modelo murino permitindo o exame de diferentes estirpes de ratinho genéticos. Além disso, um protocolo de exposição intraluminal 15 min é facilmente transferível para situações clínicas intra-operatórias e pode ajudar a avaliar intervenções peri-procedimento para prevenir a estenose justa-anastomose que comumente complica a cirurgia AVF humano. A partir destes resultados, que mostram que este método produz mais a expressão do gene específico do local dentro do endotélio em comparação com a via externa tradicional.
Uma possível limitação deste estudo é o efeito da pressão de distensão variável na VCI. O isolamento do segmento VCI não é perfeito neste modelo de ratinho, isto é., Os ramos laterais (veias lombar) não foram ligados. Portanto, é difícil precisamente maintain um nível consistente de pressão distensão durante a incubação. Embora o IVC é suavemente distendido por infusão manual pressões de distensão mais elevadas podem causar hiperplasia neointimal 20,21 e danos às células do músculo liso directa, 11 levando a interferência na análise. Também é difícil de quantificar completamente a sua eficiência de entrega de drogas, como algumas drogas podem ser perdidos durante a entrega através das veias lombar, assim como após a retirada da pinça através da VCI proximal e potencialmente através da FAV para a aorta. Por último, este método permite que parte do fármaco a ser libertado sistemicamente após a retirada da pinça; evacuação do fármaco e lavagem do local pode impedir a libertação sistémica, mas a quantificação do grau de lavagem de drogas teria de ser confirmada.
Em conclusão, esta modificação técnica para o modelo murino AVF é relativamente simples e reprodutível e permite alvo entrega da droga endotelial à FAV mouse. intraluminal emjecção no momento da criação FAV é tecnicamente viável e pode melhorar com êxito a expressão de genes virais no endotélio em comparação com a entrega adventícia. Este modelo de entrega FAV-droga será uma modalidade útil não só para dissecção dos mecanismos que regulam venosa do membro maturação FAV, mas também para a modulação terapêutica de FAV maturação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
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