Abstract
El suministro de agentes terapéuticos para mejorar la fístula arteriovenosa (AVF) maduración se puede administrar ya sea a través de rutas intraluminales o externos. El modelo simple de AVF murina se combinó con la administración intraluminal de solución de fármaco al endotelio venoso al mismo tiempo como la creación de la fístula. Se discuten los aspectos técnicos de este modelo. Bajo anestesia general, una incisión abdominal y se hace la aorta y la vena cava inferior (IVC) están expuestos. La aorta infra-renal y la vena cava inferior se disecan para la sujeción. Después de sujeción proximal y distal, el sitio de punción está expuesto y una aguja de 25 G se utiliza para punzar ambas paredes de la aorta y en la vena cava inferior. Inmediatamente después de la punción, un gen que expresa reportero vector viral se infundió en la vena cava inferior a través de la misma aguja, seguido de 15 min de incubación. El método de administración intraluminal activar más robusto de suministro de genes viral al endotelio venoso en comparación con la administración por vía externa. esta Novel método de administración facilitará estudios que exploran el papel del endotelio en AVF maduración y permiten la administración de fármacos intraluminal en el momento de la operación quirúrgica.
Introduction
La fístula aortovenous murino (FAV) modelo de punción entre la aorta y la vena cava inferior (VCI) es ahora una técnica establecida. 1 En este modelo, las dos paredes de la aorta infra-renal se punza con una aguja de 25 G, que sale a la contigua infra-renal vena cava; el orificio de entrada de la aorta anterior se repara con compresión simple, y no requiere la reparación de sutura. Serial examen de seguimiento mediante ecografía Doppler de alta resolución y el análisis histológico muestra la FAV para tener una fase de maduración y luego una fase en su defecto, la recapitulación de la fisiopatología conocida de FAV humano. 2
Para explorar los mecanismos que modulan AVF maduración, se necesitan métodos mejorados para el suministro de agentes terapéuticos a la maduración endotelio AVF. El suministro de agentes terapéuticos a los vasos puede ser vía la entrega endovascular para el lumen, o por medio de entrega externa a la adventicia. Un ejemplo de entrega externa es la comcomúnmente utilizado aplicación de la adventicia de Pluronic gel. Este copolímero es termo-reversible y se transforma de líquido a gel sólido cuando se calienta a la temperatura corporal. Administración de fármacos sostenida Estudios anteriores han mostrado se logra cuando fármaco mezclado en gel Pluronic se aplica tópicamente in vivo. 3,4 aplicación adventicia de vectores virales o siRNA con gel Pluronic ha informado para ser eficaz como sistema de administración perivascular. 5,6 Nos tiene también informó de que el tratamiento de las venas safena humanos explantados con la estimulación de la adventicia por péptidos resultó en la fosforilación de proteínas receptoras endoteliales. 7
Por otro lado, los investigadores también han utilizado el suministro intraluminal de ambos vectores virales y no virales en caninos 8-10 y conejo 11,12 modelos de injertos venosos. En estos informes, la transferencia de genes se realizó ex vivo después de la vena de la cosecha. Eslami et al. Informó gen viral endovascular entregarY para carótidas venas in situ sin necesidad de crear un bypass. 13 Gloverman et al. informaron el suministro intraluminal y la adventicia de ADN desnudo, en la rata femoral fístulas vena epigástrica superficial arterias. 14 Mayo El grupo informó de administración de fármacos de la adventicia en fístulas carótida ratón arteria-vena yugular. 15,16 Sin embargo, estos modelos se informó anteriormente requiere una anastomosis suturada para crear la FAV. En este informe, se describe la administración de fármacos intraluminal con la creación simultánea FAV en ratones, utilizando un modelo de sutura-less de la creación de FAV. Mediante el uso de este modelo murino AVF modificado un método sencillo para la administración de fármacos intraluminal a la extremidad venosa de la fístula se puede realizar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se obtuvo la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional apropiado.
1. Anestesia y procedimientos preoperatorios
- Anestesie macho C57BL / 6 de hielo, mayores de 8 semanas, con isoflurano vaporizado 3% y 0,8 L / min de oxígeno administrado en una cámara de inducción acrílico.
- Confirmar una anestesia adecuada por la falta de reacción ante pizca dedo del pie. Coloque el ratón en decúbito supino sobre la mesa de operaciones y la posición de una máscara de silicona para entregar vaporiza 2 - 3% de isoflurano por inhalación continua.
- Eliminar el vello ventral desde el cuello hasta el abdomen inferior con una crema depilatoria química.
- Realizar Doppler examen de ultrasonido antes de la cirugía FAV para registrar las características basales de flujo arterial y venoso y el diámetro de los vasos en las áreas de interés. 1,2
- Adjuntar una jeringa de 1 ml a una aguja 25 G y cargar la jeringa con el medicamento deseado. Doblar la aguja a un ángulo de 60 grados aproximadamente 4 mm de la necesidadLe punta. Sujete la aguja de 25 G con un soporte de aguja curva.
2. Procedimientos Operativos
- Preparar el lugar de la incisión con un antiséptico tópico y aplicar un paño quirúrgico. Use guantes e instrumentos estériles para mantener una técnica aséptica durante toda la cirugía.
- Se practica una incisión abdominal en la línea media con un bisturí que se extiende desde el nivel del borde inferior del hígado a justo por encima del pubis.
- Insertar un retractor y destripar todos los intestinos de la cavidad abdominal hacia el lado derecho. Envolver las entrañas de una gasa empapada con solución salina. Diseccionar la membrana que conecta el retroperitoneo y la parte inferior del colon para obtener una vista completa de la aorta y la vena cava inferior.
- Diseccionar la aorta infra-renal y la vena cava inferior de los tejidos circundantes, la preparación para proximal y distal de sujeción.
- Coloque un solo clip microcirugía a través tanto de la aorta proximal y el proximal IVC en el nivel justo por debajo de la vena renal izquierda. Colocar un segundo clip de la microcirugía a través tanto de la distal aorta y la vena cava inferior distal.
- Agarre el tejido conectivo que rodea la aorta y girar en sentido medial de modo que la superficie dorsal de la aorta es ligeramente expuesto para la punción arterial, como se describió anteriormente. 1
- exponer rápidamente el sitio de la punción. El sitio de punción será en la cara caudal de los vasos, aproximadamente tres cuartas partes de la distancia desde la vena renal izquierda hasta la bifurcación aórtica. Mantener la aorta en una posición girada con la mano izquierda, diseccionar el margen lateral izquierdo de la aorta de manera que existe una amplia exposición para permitir la punción con la mano derecha. Tenga cuidado de no diseccionar entre la aorta y la vena cava inferior.
- Mantener la aorta en una posición girada y la punción de la aorta a través de la vena cava inferior en el uso de una aguja de 25 G con una solución que contiene el fármaco 1 ml jeringa unida. (Figura 1A)
- Infundir la solución de fármaco (100 - 200 l) con la mano izquierda. La aguja puede ser visto a través de la dilatación de las pupilas y delgadoPared IVC cuando la solución de fármaco transparente desplaza la sangre venosa de la vena cava inferior (Figura 1B, C). Permanecer inmóvil y mantener la aguja en la posición durante 15 minutos.
- Retire el clip de la microcirugía distal de de-pinza solamente la aorta distal y la vena cava inferior distal.
- Retire la aguja y luego cubrir el sitio de la punción de la aorta tirando hacia arriba el tejido retroperitoneal adyacente.
- Retire el clip de la microcirugía proximal de de-sujetar la aorta proximal y el extremo proximal IVC. Al des-sujeción, sangre arterial se observa fluyendo hacia la vena cava inferior en lugar del flujo de sangre venosa oscura. Siga cubriendo el agujero de perforación durante 1 min.
- Después de la confirmación de la hemostasia mediante la observación durante 30 s sin compresión, devolver los intestinos en su posición natural y cerrar el abdomen con una sutura continua de acuerdo a su animal protocolo aprobado.
3. Procedimientos postoperatorios
- Tras el cierre del abdomen, deje de anesthesia. Aplicar cuidados postoperatorios incluyendo la analgesia y el cuidado de las heridas, de acuerdo con las instrucciones recomendadas por el Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucional. Para la analgesia utilizamos buprenorfina a 0,1 mg / kg intrasmuscularly cada 12 h durante 24 hr después de los procedimientos quirúrgicos.
- En el primer día después de la operación, realice Doppler de ultrasonido para confirmar la permeabilidad de la FAV. Además, medir otro recipiente y las características de flujo en serie y comparación de los cambios de los valores de referencia pre-operativas. 1,2
Figura 1. (A) Operativo foto que muestra intraluminal de entrega durante la cirugía FAV. Abrazadera de la aorta proximal y distal, así como la vena cava inferior mediante la aplicación de clips de microcirugía. La punción de la aorta a través de la VCI en el uso de una aguja de 25 G con solución de fármaco que contiene jeringa unida. (B) A Higsu imagen de potencia (4X aumentos) de la VCI pinchado antes de la infusión. La punta de la aguja está oscurecida por la sangre venosa de color oscuro. Puntas de flechas amarillas indican el diámetro de pared a pared de la vena cava inferior. (C) Una energía más alta de imagen (ampliación 4X) de la pinchada IVC después de la infusión. La punta de la aguja (flecha negro) se puede ver a través de la pared IVC suavemente distendido y delgada (puntas de flecha de color amarillo) como la solución de fármaco transparente desplaza la sangre venosa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En una serie de 33 ratones, la supervivencia en el primer día post-operatorio fue de 97,0%; AVF permeabilidad, como se determina por ultrasonido, era 84,9%.
Se comparó la eficacia de transducción génica de esta ruta de entrega endovascular con la ruta externa tradicional. Para la entrega intraluminal (ILD), inmediatamente después de la punción, 200 l de Adenovirus-GFP (-GFP Ad) solución de vector (1 x 10 9 PFU / ml) se infundió en la vena cava inferior a través de la aguja de punción, seguido por 15 min de tiempo de incubación . Los ratones control recibieron la entrega de la adventicia (AD) de Ad-GFP (1 × 10 9 PFU / ml) de la vena cava inferior usando gel Pluronic. Las muestras se explantaron a las 24 horas después de la exposición a los vectores de adenovirus. La expresión de GFP en la pared IVC y la fístula fue evaluada por observación en-cara de la íntima por microscopía de fluorescencia, así como el examen histológico en las secciones usando un anticuerpo anti-GFPanticuerpo.
En observación de la cara mostró más fuerte expresión de GFP en la pared de la VCI en los ratones tratados con ILD en comparación con AD, con el aumento característico alrededor de la fístula a las 24 horas (Figura 2A). expresión de GFP fue persistente en ambos grupos a las 72 horas después de la transfección (datos no mostrados). El análisis histológico con el anticuerpo anti-GFP mostró la expresión de GFP más robusta y específica de sitio en la íntima de la vena cava inferior en los ratones tratados con ILD en comparación con AD. (Figura 2B). Para confirmar estos resultados, IVCs infra-renal tratados con adenovirus-GFP por AD o ILD se recogieron por transferencia de Western. expresión de la proteína GFP fue suficiente para la detección sólo después de ILD, lo que sugiere la administración de fármacos viral superior a la pared IVC por vía intraluminal a las 24 horas después de la transfección.
Figura 2. La entrega de adenovirus-GFP para la FAV Lumen mejora la expresión de GFP. (A) Representante de inmunofluorescencia muestra en opinión de la cara del endotelio FAV (24 h) en ratones que recibieron adenovirus-GFP aplicada por la entrega de la adventicia (arriba) o mediante la colocación intraluminal (parte inferior). La barra indica 25 micras. (B) inmunofluorescencia representativo que muestra las secciones del endotelio FAV (24 h) en ratones que recibieron adenovirus-GFP aplicada por la entrega de la adventicia (arriba) o mediante la colocación intraluminal (parte inferior). * Denota lumen de la vena cava inferior; barra indica 25 micras. (C) Representante de Western blot que muestra la detección de GFP en AVF tratado con adenovirus-GFP aplica a través de la adventicia o la vía intraluminal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Esta modificación del modelo murino AVF incorpora la administración de fármacos intraluminal al endotelio venoso en el momento de la creación AVF. Un AVF fue creado por punción de la aorta infra-renal con una aguja 25 G y se amplía la punción a través de la pared aórtica opuesto en el IVC, seguido de la inyección de la solución de fármaco a través de la misma aguja. La solución se mantiene dentro de la vena cava, es decir., En el miembro venosa de AVF, hasta que de-sujeción. Lo que distingue a este modelo de otros modelos murinos AVF 17-19 es la falta de puntos de sutura o colas que pueden causar estenosis, trombosis aguda, y la posible interferencia con el análisis molecular. La capacidad de utilizar la misma aguja que perfora la aorta y vena cava inferior para crear la FAV para entregar también medicamentos para el lumen AVF permite la entrega más simple con una mínima manipulación del vaso.
Hay algunos pasos críticos y puntos para mejorar la tasa de éxito y la coherencia del procedimiento. el prabrazadera oximal de la aorta y vena cava inferior se coloca debajo de la vena renal izquierda. Si hay grandes venas lumbares en la parte superior de la IVC infra-renal, se recomienda entonces la modificación del sitio de fijación por debajo de estos vasos para permitir que la incubación eficaz de fármaco sin dilución por retrógrada back-sangrado de las venas lumbares. La pinza distal de la aorta y vena cava inferior se coloca a nivel de la bifurcación ilíaca, para que no puede interferir con la punción de la aguja de la aorta distal y IVC. Sosteniendo la aguja 25 G con un soporte de aguja curvada permite dirección óptima de la aguja durante la punción del vaso. La hemostasia se consigue cubriendo el orificio de entrada arterial con el retroperitoneo adyacente. Se presta especial atención a proporcionar la compresión cuidado evitando al mismo tiempo la oclusión y trombosis FAV como se ha descrito anteriormente. 1
El desarrollo de la tecnología de transferencia génica ofrece la posibilidad de modificar los resultados quirúrgicos a nivel molecular. Informes que describen enla entrega de genes intraluminal a una vena se han centrado principalmente en el tratamiento selectivo de fracaso del injerto de vena. Por el contrario, este modelo permite la administración de fármacos para la modulación de AVF maduración. Las ventajas de este modelo incluyen el uso de un modelo murino que permite el examen de la variación de cepas genéticas de ratones. Además, un protocolo de exposición intraluminal 15-min es fácilmente transferible a entornos clínicos intraoperatorios y puede ayudar a evaluar intervenciones peri-procedimiento para prevenir la estenosis anastomótica yuxtaóseo que comúnmente complica la cirugía AVF humano. A partir de estos resultados iniciales, se muestra que este método produce más la expresión génica específica de sitio dentro del endotelio en comparación con la ruta externa tradicional.
Una limitación potencial de este estudio es el efecto de la presión de distensión variable de la IVC. El aislamiento del segmento de IVC no es perfecto en este modelo de ratón, es decir., No se ligaron las ramas laterales (venas lumbares). Por lo tanto, es difícil precisamente maintain un nivel constante de presión de distensión durante la incubación. A pesar de la vena cava inferior se distiende con suavidad por infusión manual, mayores presiones de distensión pueden causar hiperplasia neointimal 20,21 y daños en las células del músculo liso directo, 11 que conduce a interferencias en el análisis. También es difícil de cuantificar completamente la eficiencia de la administración de fármacos, como algunos medicamentos puede perderse durante la entrega a través de las venas lumbares, así como después de la eliminación de sujeción a través de la IVC proximal y potencialmente a través de la AVF en la aorta. Por último, este método permite que algo de la droga que se publicará por vía sistémica después de la eliminación de sujeción; tendría que ser confirmado la evacuación de la droga y enrojecimiento del sitio podría evitar la liberación sistémica, pero la cuantificación del grado de lavado del fármaco.
En conclusión, esta modificación técnica para el modelo murino AVF es relativamente simple y reproducible y permite la administración de fármacos dirigidos endotelial de la FAV ratón. intraluminal eninyección en el momento de la creación AVF es técnicamente factible y puede mejorar con éxito la expresión génica viral en el endotelio comparación con la administración de la adventicia. Este modelo de entrega AVF-fármaco será una modalidad útil no sólo para la disección de los mecanismos que regulan la maduración venosa extremidad AVF, sino también para la modulación terapéutica de AVF maduración.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
- Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
- Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
- Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
- Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
- Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
- Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
- Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
- Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
- Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
- Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
- Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
- Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
- Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
- Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
- Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
- Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
- Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
- Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).
