Abstract
Levering af terapeutiske midler til forøgelse arteriovenøs fistel (AVF) modning kan indgives enten via intraluminale eller eksterne ruter. Den enkle murine AVF model blev kombineret med intraluminal administration af lægemiddel-opløsning til den venøse endotel samtidig som fistel skabelse. Tekniske aspekter af denne model diskuteres. Under generel anæstesi, er en abdominal snit og aorta og vena cava inferior (IVC) er udsat for. Den infra-renale aorta og IVC dissekeres til fastspænding. Efter proksimal og distal fastspænding, er punkturstedet eksponeret og en 25 G nål anvendes til at punktere begge væggene i aorta og ind i IVC. Umiddelbart efter punkteringen, blev et reportergen-udtrykkende viral vektor infunderes i IVC via den samme nål, efterfulgt af 15 minutters inkubation. Den intraluminale administration metode aktiveret mere robust viral gen levering til venøs endotel i forhold til administration af den eksterne rute. Denne novel metode til levering vil lette undersøgelser, der udforsker rolle endotel i AVF modning og muliggør intraluminale lægemiddeladministration på tidspunktet for kirurgisk indgreb.
Introduction
Det murine aortovenous fistel (AVF) punktur model mellem aorta og inferior vena cava (IVC) er nu en etableret teknik. 1 I denne model begge vægge af infra-renale aorta punkteres med en 25 G nål, spændende ind i tilstødende infra-renal vena cava; den forreste aorta indgangshullet repareres med enkle kompression, og kræver ikke sutur reparation. Seriel opfølgende undersøgelse af høj opløsning Doppler ultralyd og histologisk analyse viser AVF at have en modning fase og derefter en svigtende fase, den gentog den kendte patofysiologi human AVF. 2
At undersøge mekanismerne, der modulerer AVF modning, er der behov for forbedrede fremgangsmåder til afgivelse af terapeutiske midler til modning AVF endotel. Levering af terapeutiske midler på fartøjer kan være enten via endovaskulær levering til lumen, eller via ekstern levering til adventitia. Et eksempel på ekstern levering er comofte anvendes adventitial anvendelse af Pluronic-gel. Denne copolymer er termo-reversibel og transformeret fra flydende til fast gel, når opvarmet til kropstemperatur. Tidligere undersøgelser har vist vedvarende lægemiddeladministration opnås, når lægemidlet blandes i pluronic gel påføres topisk in vivo. 3,4 adventitial anvendelse af virale vektorer eller siRNA med Pluronic-gel er blevet rapporteret at være effektiv som en perivaskulær afgivelsessystem. 5,6 Vi har også rapporteret, at behandlingen af eksplanterede humane saphenous vener med adventitial stimulering med peptider resulterede i phosphorylering af endotheliale receptorproteiner. 7
På den anden side har forskere også anvendt intraluminal levering af både virale og ikke-virale vektorer i hunde 8-10 og kanin 11,12 modeller af vene transplantater. I disse rapporter blev genoverførsel udført ex vivo efter vene høst. Eslami et al. Rapporterede endovaskulær virusgen leverey til carotis vener i situ uden at skabe en bypass. 13 Gloverman et al. rapporterede intraluminal og adventitial administration af nøgent DNA i rotte femoral arterie-overfladiske epigastriske vene fistler. 14 Mayo-gruppen rapporterede adventitial lægemiddeltilførsel i muse carotisarterie-halsvene fistler. 15,16 Disse tidligere rapporterede modeller krævede en syet anastomose, at skabe den AVF. I denne rapport er intraluminal drug delivery med samtidig AVF skabelse i mus beskrives ved hjælp af en sutur-mindre model af AVF skabelse. Ved at bruge denne modificerede murine AVF model kan udføres en simpel metode til intraluminal lægemiddeltilførsel til den venøse led af fistlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkendelse af den relevante Institutional Animal Care og brug Udvalg opnås.
1. Anæstesi og Pre-operative procedurer
- Bedøver C57BL / 6 is, alderen 8 uger, med fordampet 3% isofluran og 0,8 L / min oxygen administreret i en akryl induktion kammer.
- Bekræft passende bedøvelse ved manglende reaktion på tå knivspids. Placer musen liggende på operationsbordet og anbring en silikone maske for at levere fordampet 2 - 3 i% isofluran ved kontinuerlig inhalation.
- Fjern ventral hår fra halsen til underlivet anvendelse af en kemisk hårfjerningsmiddel.
- Udfør Doppler ultralydsundersøgelse før AVF operation for at optage baseline karakteristika for arteriel og venøs flow og diameter fartøj på områder af interesse. 1,2
- Vedhæft en 1 ml sprøjte til en 25 G nål og indlæse sprøjten med den ønskede stof. Bøj nålen til en 60 graders vinkel ca. 4 mm fra behovetle tip. Tag fat i 25 G nål med en buet nåleholder.
2. operative procedurer
- Forbered incisionssted med et aktuelt antiseptisk og anvende en kirurgisk afdækningsstykke. Brug sterile handsker og instrumenter til at opretholde aseptisk teknik under hele operationen.
- Foretag en midtlinje abdominal incision med en skalpel strækker sig fra niveauet for den nedre liver kant til lige over pubis.
- Indsæt en retractor og eviscerate alle tarme fra bughulen mod højre side. Pak tarme i gaze gennemvædet med saltvand. Dissekere membranen forbinder retro-bughinden og nedre tyktarm for at opnå fuld visning af aorta og IVC.
- Skær infra-renale aorta og IVC fra omgivende væv, forberedelse til proksimal og distal fastspænding.
- Placer et enkelt mikrokirurgi klip på tværs af både den proksimale aorta og den proximale IVC på niveauet lige under venstre renale vene. Placer en anden mikrokirurgi klip på tværs både distal aorta og den distale IVC.
- Tag fat i bindevævet omkring aorta og rotere medialt, så den dorsale overflade af aorta er lidt udsat for arteriel punktur, som tidligere beskrevet. 1
- Hurtigt udsætte indstiksstedet. Indstiksstedet vil være på caudale aspekt af skibene, cirka tre fjerdedele af afstanden fra venstre renale vene til aortaforgreningen. Holde aorta i en roteret position med venstre hånd, dissekere den venstre laterale margin af aorta, således at der er rigelig eksponering at tillade punktering med højre hånd. Pas på ikke at dissekere mellem aorta og IVC.
- Oprethold aorta i en roteret position og punktere aorta igennem i IVC anvendelse af en 25 G nål med en vedhæftet 1 ml sprøjte indeholdende lægemiddelopløsning. (Figur 1A)
- Infunder lægemiddelopløsningen (100 - 200 pi) med venstre hånd. Nålen kan ses gennem den dilaterede og tyndeIVC væggen, når den transparente lægemiddelopløsning forskyder veneblod ud af IVC (figur 1B, C). Forblive stille og opretholde nålen på plads i 15 min.
- Fjern den distale mikrokirurgi klippet til de-clamp kun den distale aorta og den distale IVC.
- Fjern kanylen og derefter dække indstiksstedet af aorta ved at trække op tilstødende retro-peritoneal væv.
- Fjern den proximale mikrokirurgi klippet til de-klemme den proksimale aorta og den proximale IVC. Ved de-fastspænding, er arterieblod observerede strømmer ind i IVC stedet for mørk venøs blodgennemstrømning. Hold dækker punkteringshullet i 1 min.
- Efter bekræftelse af hæmostase ved observation i 30 sek uden komprimering, returnere tarme i deres naturlige position og luk maven med en kørende sutur efter din godkendte dyr protokol.
3. Post-operative procedurer
- Efter lukningen af maven, ophøre Anesthesia. Påfør postoperativ pleje, herunder analgesi og sårpleje i overensstemmelse med instruktionerne, der anbefales af Institutional Animal Care og brug Udvalg. For analgesi bruger vi buprenorphin på 0,1 mg / kg intrasmuscularly hver 12 timer i 24 timer efter de kirurgiske procedurer.
- På den første dag efter operation, udføre Doppler ultralyd for at bekræfte åbenheden af AVF. Desuden måler andet fartøj og flow egenskaber serielt og sammenligne for ændringer fra præ-operative baseline-værdier. 1,2
Figur 1. (A) operative Foto Viser intraluminale Delivery under AVF Surgery. Klemme den proximale og distale aorta, samt IVC ved at anvende mikrokirurgi klip. Punktere aorta igennem i IVC anvendelse af en 25 G nål med påsat sprøjte indeholdende lægemiddelopløsning. (B) A Highendes Power Picture (4X forstørrelse) af det punkterede IVC før Infusion. Nålespidsen sløres af mørkt farvet veneblod. Gule pilespidser betegne væg-til-væg diameter af IVC. (C) en højere effekt-billede (4X forstørrelse) af det punkterede IVC efter infusion. Nålespidsen (sort pil) kan ses gennem den blidt udspilet og tynde IVC væg (gule pile) som den transparente lægemiddelopløsning forskyder veneblod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en serie på 33 mus, overlevelse på den første postoperative dag var 97,0%; AVF passage, som bestemt ved ultralyd, var 84,9%.
Gentransduktion Effektiviteten af denne endovaskulær levering rute med den traditionelle eksterne rute blev sammenlignet. For intraluminal levering (ILD), umiddelbart efter punkteringen, 200 pi Adenovirus-GFP (Ad-GFP) -vektoren opløsning (1 × 10 9 PFU / ml) blev infunderet i IVC via punkteringsnålen, efterfulgt af 15 minutters inkubering tid . Kontrolmus modtog adventitial levering (AD) af Ad-GFP (1 × 10 9 PFU / ml) til IVC hjælp Pluronic-gel. Prøver blev eksplanteret ved 24 timer efter udsættelse for adenovirusvektorer. Ekspression af GFP ved IVC væg og fistel blev vurderet ved en-face observation fra intima ved fluorescensmikroskopi samt histologisk undersøgelse i afsnit anvendelse af et anti-GFPantistof.
En face observation viste stærkere ekspression af GFP i IVC væg i mus behandlet med ILD sammenlignet med AD, med karakteristisk forstærkning omkring fistlen ved 24 timer (figur 2A). GFP-ekspression var vedholdende i begge grupper ved 72 timer efter transfektion (data ikke vist). Histologisk analyse med anti-GFP-antistof viste mere robust og stedspecifik GFP-ekspression i intima af IVC i musene behandlet med ILD sammenlignet med AD. (Figur 2B). For at bekræfte disse resultater, blev infra-renal IVCs behandlet med adenovirus-GFP af AD eller ILD høstet til Western blot. GFP-proteinekspression var tilstrækkeligt for detektion først efter ILD, hvilket tyder overlegen viral lægemiddeltilførsel til IVC væg via intraluminale rute ved 24 timer efter transfektion.
Figur 2. Levering af adenovirus-GFP til AVF Lumen Øger GFP Expression. (A) repræsentant immunofluorescens viser en face visning af AVF endotel (24 timer) i mus, der modtog adenovirus-GFP anvendes af adventitial levering (øverst) eller ved intraluminal levering (nederst). Bar indikerer 25 um. (B) repræsentant immunfluorescens viser sektioner af AVF endotel (24 timer) i mus, der modtog adenovirus-GFP anvendes af adventitial levering (øverst) eller ved intraluminal levering (nederst). * Angiver lumen IVC; bar indikerer 25 um. (C) repræsentative Western blot, der viser påvisning af GFP i AVF behandlet med adenovirus-GFP påføres via adventitia eller intraluminal rute.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne modifikation af den murine AVF model inkorporerer intraluminal lægemiddeltilførsel til den venøse endotel på tidspunktet for AVF skabelse. En AVF blev skabt ved at punktere infra-renale aorta med en 25 G nål og forlængelse af punktering gennem den modstående aortavæg i IVC, efterfulgt af injektion af lægemiddel-opløsning gennem den samme nål. Opløsningen holdes inden cava, dvs.., I den venøse led af AVF, indtil de-fastspænding. Hvad adskiller denne model fra andre murine AVF modeller 17-19 er manglen på suturer eller lim, der kan forårsage stenose, akut trombose, og mulig interferens med molekylær analyse. Evnen til at bruge samme nål, der punkterer aorta og IVC at skabe AVF til også at levere medicin til AVF lumen giver enklere levering med minimal fartøj manipulation.
Der er nogle kritiske trin og punkter til forbedring af succesraten og sammenhæng i proceduren. pRoximal klemme af aorta og IVC er placeret under venstre renale vene. Hvis der er store lumbale vener i den øvre del af den infra-renale IVC, anbefales derefter modifikation af spændebåndet stedet til under disse fartøjer for at tillade effektiv inkubation af lægemiddel uden fortynding ved retrograd back-blødning fra lumbale vener. Den distale klemme af aorta og IVC er placeret på niveau med bækkenforgreningen, at den ikke kan forstyrre nålestik af den distale aorta og IVC. Holder 25 G nål med en buet nåleholder muliggør optimal retning af nålen under punktur af kar. Hæmostase opnås ved at dække indgangshul den arterielle med den tilstødende retro-bughinden. Der lægges særlig vægt på at give omhyggelig komprimering samtidig undgå AVF okklusion og trombose som tidligere beskrevet. 1
Udviklingen af genoverførsel teknologi giver mulighed for at ændre kirurgiske resultater på det molekylære niveau. Rapporter beskriver itraluminal genadministration til en vene har hovedsageligt fokuseret på målrettet behandling af venegraft svigt. I modsætning hertil denne model giver mulighed for lægemiddelafgivelse til modulering af AVF modning. Fordelene ved denne model indbefatter anvendelsen af en murin model tillader undersøgelse af varierende muse genetiske stammer. Desuden en 15-min eksponering protokol intraluminale er nemt overføres til klinisk intra-operative indstillinger og kan hjælpe med at vurdere peri-proceduremæssige interventioner for at forhindre juxta-anastomotiske stenose, der almindeligvis komplicerer human AVF kirurgi. Ud fra disse første resultater viser vi, at denne metode giver mere stedspecifik genekspression i endotel sammenlignet med den traditionelle eksterne rute.
En potentiel begrænsning af denne undersøgelse er virkningen af variabel distension pres på IVC. Isolering af IVC-segmentet er ikke perfekt i denne musemodel, dvs.., Blev sidegrene (lumbale vener) ikke ligeret. Derfor er det vanskeligt præcist at maintain et ensartet udspiling tryk under inkubation. Selvom IVC forsigtigt udspilet ved manuel infusion, kan højere distending tryk forårsage neointimal hyperplasi 20,21 og direkte glat muskelskade celle, 11 hvilket fører til indblanding i analyser. Det er også vanskeligt helt kvantificere effektiviteten af lægemiddelafgivelse, som nogle lægemiddel kan gå tabt under levering gennem lumbale vener, samt efter klemme fjernelse gennem den proximale IVC og potentielt gennem AVF ind i aorta. Endelig denne fremgangsmåde tillader nogle af lægemidlet, der skal frigives systemisk efter klemme fjernelse; evakuering af lægemidlet og skylning af sitet kan forhindre systemisk frigivelse, men kvantificering af graden af narkotika udvaskning vil skulle bekræftes.
Afslutningsvis denne tekniske ændring af murine AVF modellen er forholdsvis enkel og reproducerbar og muliggør målrettet endotel lægemiddeladministration til musen AVF. intraluminal iGenereringen på tidspunktet for AVF skabelse er teknisk mulig og kan med held forbedre viral genekspression i endothelium sammenlignet med adventitial levering. Denne AVF-lægemiddelafgivelse model vil være et nyttigt modalitet ikke kun for dissektion af de mekanismer, der regulerer venøs AVF lemmer modning, men også til terapeutisk modulation af AVF modning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
- Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
- Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
- Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
- Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
- Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
- Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
- Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
- Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
- Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
- Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
- Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
- Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
- Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
- Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
- Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
- Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
- Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
- Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).
